Mikoheterotrofik Bitkilerde Endofitik Mantarları Tanımlamak için İzolasyon, Karakterizasyon ve Toplam DNA Ekstraksiyonu

Burada sunulan teknikler, farklı bitki organlarıyla ilişkili endofitik mantar topluluğunu araştırmak için yararlıdır. Endofitik mantar izolasyonu, tanımlanmalarına izin verir ve simbiyotik çimlenme gibi diğer tekniklerde değerlidir. Başlamak için, litre başına üç mililitre antibiyotik ile desteklenmiş sekiz ila 10 santimetre PDA kültür ortamı Petri kapları hazırlayın.

Kültür ortamı Petri kaplarını kullanmadan önce 24 saat boyunca 36 santigrat derecede inkübe ederek kontaminasyon olup olmadığını kontrol edin. Ertesi gün, standart bir prosedür kullanarak sağlıklı mikoheterotrofik bitki parçalarını yüzeysel olarak dezenfekte edin ve steril bir Petri kabına yerleştirin. Numunelerin yüzeysel dezenfeksiyonunun etkinliğini değerlendirmek için, numunelerin son yıkaması sırasında kullanılan birkaç damla damıtılmış suyu PDA üzerinde aşılayın.

Daha sonra, alevli bir neşter ve forseps kullanarak, numuneleri 0,2 santimetre kalınlığında parçalara ayırın. Ortamla temas halinde olacak yüzey alanını büyütmek için numuneleri bölümlere ayırın. Yeraltı organlarının beş parçasını, antibiyotik takviyeli PDA plakasına, çanak kenarlarına dokunmadan mümkün olduğunca uzağa yerleştirin.

Petri kaplarını streç filmle kapatın ve beş gün boyunca karanlıkta 25 ila 27 santigrat derecede saklayın. Alt kültürlemeden bir gün önce, litre AA ortamı başına beş ila yedi gram kullanarak beş santimetre Petri kapları hazırlayın ve plakaları 24 saat boyunca 36 santigrat derecede inkübe edin. Mantar izolatlarını saflaştırmak için PDA plaka kolonilerini renge, büyüme desenine, dokuya ve kenar boşluğu formatına göre ayırt edin.

Ardından yemeğin alt tarafındaki koloni kenar boşluklarını sınırlayın. Ayrıca kolonileri bir kodla tanımlayın. Otoklavlanmış bir tahta kürdanın ucunu kullanarak, tanımlanan mantar kolonisinin kenarlarından az miktarda miselyum geri kazanın ve AA plakasını çizgilendirin, birbirinden ve çanak kenarlarından bir santimetrede üç stria üretin.

AA plakasını etiket kağıdı ve kurşun kalem kullanarak uygun kodla etiketleyin. Plakaları karanlıkta üç gün boyunca 25 ila 27 santigrat derecede inkübe etmeden önce kapatın. İnkübasyondan sonra, bireysel kolonileri oluşturan ince hifleri tanımlamak için plakaları titizlikle gözlemleyin.

Kalıcı bir işaretleyici kullanarak tek tek kolonilerin alanını sınırlayın. Otoklavlanmış bir kürdan kullanarak koloniyi içeren ortamın bir kısmını kesin ve kesilen hacmi antibiyotiksiz yeni bir PDA Petri plakasının merkezine aktarın. Petri kaplarını izolatların kodlarıyla etiketledikten sonra, streç filmle kapatın ve yedi ila 14 gün boyunca karanlıkta 25 ila 27 santigrat derecede tutun.

Mantar izolatlarının Castellani'nin yöntemiyle korunmasına başlamak için, otoklavlanmış iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 0,5 mililitre damıtılmış su ekleyin. Otoklavlanmış bir kürdan kullanarak, halihazırda yetiştirilmiş saflaştırılmış izolatların miselyum kenarlarından 0,5 x 0,5 santimetre küboid ortam kesin. Damıtılmış su ile mikrosantrifüj tüplerine dört ila altı küboid yerleştirin.

Tüpleri karanlıkta 25 santigrat derecede gerektiği kadar saklayın. Gerektiğinde, bir küboidi geri kazanın ve depolanmış bir izolat yetiştirmek için yeni bir PDA kabının ortasına yerleştirin. Temiz bir cam slayt üzerine bir damla Toluidin mavi-O lekesi koyarak alay montaj yöntemine başlayın.

Böyle bir teknikte farklı lekeler kullanılabilir. Otoklavlanmış bir kürdan kullanarak, yetiştirilen izolattan bir miktar hifleri dikkatlice çıkarın ve bunları leke damlasına yerleştirin. Bir kapak fişi yerleştirin ve ışık mikroskobu altında analiz edin.

Yapışkan bant montaj yöntemi için, temiz bir cam slayt üzerine bir damla laktofenol pamuk mavisi leke koyun. Cam slayta ve merkezi leke damlasına tam olarak uyan boyutta şeffaf bir yapışkan bant şeridi kesin. Yapışkan şeridin yapışkan yüzeyini miselyum yüzeyine yönlendirin ve çok fazla bastırmadan veya toplamadan bir miktar hif toplamaya çalışın.

Ardından bandı cam slayta yapıştırın ve lekenin toplanan hiflerle temas halinde olduğundan emin olun. Bandın üzerine bir damla su damlatın ve slaytı ışık mikroskobu altında analiz etmeden önce bir kapak fişi yerleştirin. Fragmanların iç kısmından çıkan küçük filamentli mantar misel gruplarının büyümesi, mikoheterotrofik bitki organ fragmanının PDA ortamı üzerinde aşılanmasından beş gün sonra gözlendi.

Saflaştırılmış izolatın aşılanmasından yedi ila 14 gün sonra, PDA üzerinde saf mantar izolat kolonisinin santrifüj büyümesi gözlendi ve tek bir dairesel miselyum oluşturdu. Olası kontaminasyonlar kolayca tespit edildi ve ortamdaki büyüme formu, yönü, rengi ve pigment üretimi ile ilgili koloni homojenliğini tehlikeye attı. Mikoheterotrofik orkidenin fusiform köklerinden izole edilen bir koloni, Wullschlaegelia aphylla, ortamda yayılabilir pigmentler veya eksüdalar olmadan opaktı.

Koloninin üst tarafı beyazımsı ila gri, alt tarafı kahverengimsiydi. Miseller havadan ve boldu ve kenarlar düzensiz ve havadandı. Koloni kadifemsi bir dokuya ve makroskopik yapıları olmayan buruşuk bir topografyaya sahipti.

Boyanmamış miselyumda kolayca görülemeyen yapılar, mantar miselyumu laktofenol pamuk mavisi ve Toluidin mavisi-O ile boyandıktan sonra sergilendi ve tanımlanmaları kolaylaştırıldı. Burada sunulan mantar izolasyon yöntemleri, mantar endofitlerini tanımlamak için yeşil bitkilere de uygulanabilir. İzole edilen mantarlar simbiyotik çimlenme denemelerinde kullanılabilir.