Flow Sitometride Bacillus subtilis Spor Sayımı ve Etiket Analizinin İyileştirilmesi
30 Haziran 2023
Bu protokol, etidyum bromür ile etiketlenmiş bakteri sporlarını ölçmek için akış sitometrisinin kullanımına ve boncuk saymaya odaklanır. Yöntem ayrıca, bozulmamış sporların yüzeyindeki proteinlerin kovalent bağlanmasını analiz etmek için de etkilidir.
Geleneksel yöntemler kullanılarak Bacillus subtilis sporlarının hücre sayacı zahmetli bir iş olabilir, çünkü bu yöntemler tamamen manuel olabilir ve doğrulukları operatörün deneyimine bağlı olabilir. Bu protokol, hareketsiz ve çimlenen sporların sayımını mümkün kılar. Ek olarak, teknik, yüzeyindeki floresan proteinlerin başa çıkma yüzdesini belirlemeyi de mümkün kılar.
Bu protokolde yer alan kurulum adımı göz önüne alındığında, vizyon, tesisler ve teknik anlayış ve bu uygulamadaki özenin detayı ile gösterilmektedir. Sitometre yazılımına giriş yaparak başlayın. Yazılım çalışma alanında Sitometre'yi ve ardından Fluidic Startup'ı seçin.
Ardından Temizleme Modları'nı seçin. Ve son olarak, SIT Flush'ı başlatın. 50 mikrolitre otoklav sporu alın ve bunları ışıktan korunarak 30 dakika boyunca hacimce% 0.05 seyreltme faktöründe etidyum bromür ile inkübe edin.
Sporları 17.949 G'de 10 dakika santrifüjleyerek ve PBS'de tekrar süspanse ederek PBS ile üç kez yıkayın. Ardından, üreticinin seyreltme önerilerini izleyerek 10 mikrolitre boncuk ekleyin ve numuneyi bir akış sitometresi kullanarak analiz edin. Negatif kontrolü referans olarak kullanarak parçacıkların morfo-metrik ve floresan özelliklerine dayalı geçit stratejisini tanımlayın.
Ardından tüpü yavaşça karıştırın. Akış sitometresi probuna takın ve Al'a tıklayın. Lazer gücünü ayarlamak için, sitometre penceresindeki parametreler sekmesine gidin, ileri saçılımı 375'e ve yan saçılımı 275'e ayarlayın.
Ardından eşik sekmesini seçin ve 500 olarak ayarlayın. Ardından, otofloresansı ortadan kaldırmak için yalnızca sporları içeren boyasız numuneyi analiz edin. Parametre sekmesinde, kontrollerde floresan kullanarak negatif ve pozitif popülasyonları ayırt etmek için filtre dedektörü üçünün voltajlarını 603'e ve filtre dedektörü beşin voltajlarını 538'e ayarlayın.
Ardından Telafiye'ye tıklayın ve filtre dedektörü 5'e 3 kurulum ofsetini bire ayarlayın. Cihazı alım için yapılandırmak üzere Deneme'yi seçin, deneme düzenini seçin ve alımı 30.000 olay olarak ayarlayın. Parametreleri ayarladıktan sonra, akış sitometresinde etiketlenmiş ve boncuk içeren numuneler için veri alın.
50 mikrolitre sporu 17.949 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, 25 mikrolitre 1-etil-3-3-dimetilaminopropil karbodiimid kullanarak sporları tekrar askıya alın ve 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, spor süspansiyonuna 50 milimolar konsantrasyonda 25 mikrolitre N-hidroksisülfosüksinimid ekleyin.
Spor süspansiyonunu oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Sporları daha önce gösterildiği gibi santrifüj ederek PBS ile üç kez yıkayın. Numunelere floresan protein ekleyin ve gece boyunca 15 santigrat derecede inkübe edin.
1 ila 50 arasında seyreltilmiş etidyum bromür mililitresine 10 miligram ekleyin, ardından numuneleri ışıktan koruyarak bir saat buz üzerinde bırakın. Sporları yıkadıktan ve kapıları daha önce gösterildiği gibi tanımladıktan sonra, nokta grafiğinin x ekseninde filtre dedektörü üç ve Y ekseninde filtre dedektörü beş parametrelerini değiştirin. Sayım boncukları yöntemi, otoklav spor örneklerinde mikrolitre başına iki kez 10 ila üçüncü spor tespit etti.
Otoklav spor örneklerinin etidyum bromür boyaması, otoklavlanmamış sporların boyanmasından daha yüksek ortalama floresan yoğunluğu gösterdi ve bu da genetik materyalin daha fazla boyandığını gösterdi. Otoklav spor yüzeyi, APC etiketli, anti-insan interlökin 10 antikoru ile birleştiğinde, otoklavlanmamış sporlara kıyasla daha fazla eşleşme etkinliği gösterdi. Etidyum bromüre geçirgen sporların varlığı, toplam popülasyonda çimlenmiş sporların olası varlığını göstermiştir.
Akış sitometrisi analizlerine dayanarak, floresan antikorun çimlenmiş olanlara kıyasla hareketsiz sporlarla daha yüksek bir bağlanma yüzdesi gösterdiği gözlendi. Ayrıca, floresan antikorların konsantrasyonu arttıkça, birleştirilmiş sporların yüzdesinde ve ortalama floresan yoğunluğunda bir artış gözlenmiştir. Akış sitometrisi ve sporların doğru sayımı yoluyla hassas okumalar sağlamak için mevcut boncukların kapsamlı bir homojenizasyonunun yapılması önemlidir.
Spora bağlı antijenlerin konsantrasyonunu standartlaştıran Kanada çalışmaları, sporun aşı antikorları olarak kullanımını analiz etmektedir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, etidyum bromür ile etiketlenmiş bakteri sporlarını kantitatif analiz etmek için akış sitometrisi ve sayma boncuklar kullanmaya odaklanmaktadır. Dokunulmaz spor yüzeyindeki proteinlerin kovalent bağlanmasının verimli analizini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Akış Sitometrisi
- Hücre Sayım Teknikleri
Arka Plan
- Bacillus subtilis sporlarının sayımı için geleneksel yöntemler iş gücü yoğundur.
- Manuel sayımın doğruluğu operatör deneyimine bağlıdır.
- Bu protokol, dorman ve gerileyici sporların sayımına olanak tanır.
- Ayrıca spore yüzeylerindeki floresan proteinlerin yüzdesini değerlendirir.
Çalışmanın Amacı
- Bakteryel sporların sayımını hızlandırmak.
- Spor sayımında doğruluğu artırmak.
- Akış sitometrisi kullanarak sporlar üzerindeki protein bağlanmasını analiz etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Sporların sayımı için akış sitometrisi.
- Sporları etiketlemek için etidyum bromür kullanımı.
- Sitometri işletimi için yazılım kurulumu.
- Spor yüzeylerindeki floresan protein bağlanmasının analizi.
Ana Sonuçlar
- Bacillus subtilis sporlarının verimli sayımı sağlanmıştır.
- Dorman ve gerileyici sporların doğru değerlendirilmesi yapılmıştır.
- Protein bağlanma yüzdelerinin başarılı bir şekilde belirlenmesi gerçekleştirilmiştir.
- Protokol, kullanım kolaylığı ve teknik anlayış göstermiştir.
Sonuçlar
- Bu protokol, spor sayımının verimliliğini artırır.
- Protein etkileşimlerini analiz etmek için güvenilir bir yöntem sağlar.
- Akış sitometrisi, mikrobiyolojik çalışmalarda değerli bir araçtır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accurate enumeration and surface labeling analysis of Bacillus subtilis spores are critical for biotechnological applications where quantification and antigen display efficiency impact downstream R&D. Flow cytometry-based workflows, leveraging DNA and surface markers, enable standardized, operator-independent spore quantification and facilitate robust assessment of protein coupling. These capabilities support translational research and platform development for spore-based delivery systems and immunological studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of antigen display on spore surfaces for target validation studies.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing dormant from germinated spores via DNA labeling.
- Facilitates predictive confidence in spore-based platform development through reproducible enumeration.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-throughput quantification of labeled spores for assay development.
- Improves reproducibility and scalability of spore-based screening assays using counting beads.
- Enables reliable evaluation of coupling efficiency for surface-displayed proteins.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spore quantification with translational biomarker strategies for vaccine and delivery platform studies.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling precise measurement of spore populations and surface modifications.
- Reduces biological ambiguity in preclinical models using robust, quantitative readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This flow cytometry-based method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing quantitative, reproducible spore enumeration and surface marker analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on antigen display and spore viability through dual labeling strategies.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized quantification for downstream compound or antigen screening.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence and bead-based readouts for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment with biomarker and platform development objectives in vaccine and delivery research.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized workflow for spore-based quantification and surface analysis across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in spore-based applications.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of spore enumeration and labeling workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of spore-based platforms and translational studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry operation and gating strategy definition.
- Needs access to cytometry instrumentation and compatible analytical software.
- Demands cross-team standardization of labeling protocols and bead handling for reproducibility.
- May require adaptation for different spore types or surface markers based on application.
- Dependent on thorough homogenization and control setup to ensure accurate quantification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:44
Flow Cytometry Setting and Preparation of Autoclaved Spores for Flow Cytometry
1:47
Analysis Using Flow Cytometry
3:27
Estimation of the Protein Coupling Index on a Spore Surface Using Flow Cytometry
4:52
Results: Fluorescence Coupling Percentage Analysis of Bacillus subtilis Spores
6:08
Conclusion
