Narenciye tomurcuk ağacı işlemenin, cihaz mühendisliği yoluyla aşağı akış patojen tespiti için otomatikleştirilmesi

Gösterilen teknik, floem açısından zengin narenciye dokusunu hızlı bir şekilde işlemek için düşük maliyetli bir araç kullanır ve emek yoğun protokollere ve özel laboratuvar ekipmanlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Bu, narenciye viroidlerinin, virüslerin ve bakterilerin hızlı bir şekilde tespit edilmesini ve yönetilmesini sağlar. Bu yöntem, narenciye endüstrisine fayda sağlayan ve potansiyel olarak fidanlık ve saha operasyonlarında hastalıkların teşhis ve tedavisine yardımcı olan test hizmetlerinin kalitesini ve tekdüzeliğini artırabilir ve iyileştirebilir.

Narenciye bitkileri patojen tarafından enfekte olur, dünya çapında önemli ekonomik kayıplara neden olur. Budwood Doku Çıkarıcı veya BTE gibi gelişmiş patojen tespit teknikleri, büyük ölçekli ağaç üretimi için patojen testi yapılmış çoğaltıcı malzemeler üretmek için gereklidir. Narenciye numuneleri ile test edilmiş ve onaylanmış olmasına rağmen, yöntem diğer birçok ürün için teşhis laboratuvarlarında ve saha operasyonlarında uygulanabilir.

Bu tekniği uygulayan yeni başlayanlar protokole aşina olmalı, talimatları tam olarak takip etmeli ve sabırlı olmalıdır. Başlamak için, bir ağaç seçmek için telefon uygulaması Test İzleyicisi'ni kullanın ve ağaç bilgilerini etikete yüklemek için telefona bir Yakın Alan İletişimi veya NFC yaka etiketi tutun. Üç ila dört narenciye tomurcuk ağacı örneği yerleştirinampBudwood Doku Çıkarıcı veya BTE, uyumlu plastik torba taşıyıcısına yerleştirin ve klipsle kapatın.

Metinde açıklanan adımları izleyerek numunenin kalitesinden emin olduktan sonra, ağacın NFC yaka etiketini taramak için telefon uygulaması Test Tracker'ı kullanın ve numune çantasındaki NFC klips etiketiyle bağlayın. Uygun şekilde dezenfekte edilmiş bir çeker ocak içinde, doku çıkarıcı tabanının arkasındaki anahtarı çevirin. Kutunun sol tarafındaki anahtarın üst kısmına basıldığından emin olun ve yanıp sönen yeşil LED haznenin hazır olduğunu gösterene kadar bekleyin.

BTE haznesini hazırlamak için, boş bir numune torbası, bir O-ring kullanarak arka nozüle sabitleyerek haznenin arkasına takın. Bıçakta aşınma belirtileri veya plastikte devam eden bıçakta kesikler veya uçta kesikler gibi hasar olup olmadığını kontrol edin. Bıçak üzerindeki okun tek kilit sembolüyle aynı hizada olduğundan ve haznenin altındaki hava tahliyesinin O sembolüne doğru çevrildiğinden emin olun.

Şeffaf kapağı hazne açıklığının üzerine yerleştirin. Haznenin sağındaki rayı kullanarak, şeffaf BTE sürgüsünü haznenin üzerine kaydırın ve haznenin altındaki kilidi sürgünün içine girebildiği kadar itin. Piston kapağının sürgünün üstüne monte edildiğinden emin olun.

BTE haznesini BTE tabanına yüklemek için, hazırlanan hazneyi, BTE taban nozulu haznenin arkasına çıkıntı yapacak şekilde tabana yerleştirin. YükleyinampNFC klips üzerindeki beyaz etiketi hareket ettirerek BTE tabanına tag sarı ışık yanıp sönmeye başlayana kadar kutunun sağ tarafındaki Z'ye yavaş dairesel hareketlerle. Numuneyi tabana taktıktan sonra, numune torbasında delik olmadığından emin olun.

Ardından O-ringi s'nin üzerine yerleştirinampBTE nozülünün önüne sabitlemek için torba torba. Kullanılmayan şırınga setini yüklemek için önce şırınga setini yırtın. Ardından kullanılmayan şırınga setini kantar kulesine yerleştirin.

Kırmızı bir ışık yanıp sönmeye başladığında veya terazi sıfır gösterdiğinde şırınga setini çıkarın. Sıvının alt şırıngada kalmasını sağlarken filtreli pistonu şırıngadan çıkarın. Pistonu herhangi bir yüzeye temas etmeyeceği bir kağıt havluya veya kuleye yerleştirin.

Son olarak, çıkış portunu şırıngaya bastırarak ve 90 derece çevirerek şırıngayı sürgülü çıkış portuna takın. Tomurcuk ağacı örneğini işlemeye başlamak için, makineyi başlatmak için üstteki siyah düğmeye basın. Torbadan bir tomurcuk ağacı çubuğu alın ve BTE nozulunun üstünden geçirin.

Diğer elinizle haznenin diğer tarafındaki tomurcuk ağacı çubuğunu tutun ve yavaşça bıçağın içine inin. Tomurcuk ağacını döndürürken yavaşça ileri geri hareket ettirin. Hafif bir uğultu duyulduğunda, floem'e odaklanmak için dalı makinenin daha derinlerine hareket ettirin.

Tüm dallar için aynısını tamamladıktan sonra, işlemi durdurmak için üstteki siyah düğmeye basın ve ışığın tekrar sarı renkte yanıp sönmeye başlamasını bekleyin. Numune ağırlığını doğrulamak için şırıngayı 90 derece döndürün ve aşağı çekin. Pistonu şırıngaya geri yerleştirin ve şırıngayı kuleye yerleştirin.

Terazi numuneyi otomatik olarak algıladıktan sonra yeşil renkte yanıp sönen bir LED, numune ağırlığının uygun aralıkta olduğunu gösterir. Numune ağırlığının çok düşük olduğunu gösteren kırmızı ışık yanıp sönüyorsa, numune işlemini tekrarlayın. Ağırlık çok yüksekse, bazı numuneleri çıkarın, sarı LED'in yanıp sönmesi yavaşlayacaktır.

Numuneyi homojenize etmek için, pistonu numuneyi içeren şırıngadan çıkarın. Sıvıyı şırıngaya itin ve pistonu geri takın. Tamponu geçirmek için pistonu itin ve bitki özsuyunu, kauçuk boru aracılığıyla ağ filtreden boş şırıngaya geçirin.

Numune homojen bir yeşil sıvıya dönüşene kadar tamponu ve bitki özsuyunu bir şırıngadan diğerine üç ila dört kez ileri geri iterek numuneyi karıştırın. İyice homojenize edildikten sonra, bitki özsuyu örneğini ağ filtresi olmadan şırıngaya itin ve kauçuk boruyu ve filtreli şırıngayı ondan ayırın. Daha sonra bitki özsuyu örneğini şırıngadan iki mililitrelik steril bir mikrosantrifüj tüpüne atın.

Numuneyi kalıcı bir işaretleyici kullanarak torba numarasıyla etiketledikten sonra, daha fazla kullanana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. 10'dan sonra BTE çıkarılabilir hazneyi sterilize edin.ampişlendi ve yeşil LED maviye dönmek yerine yanıp sönmeye devam etti. Hazneyi sökmek ve tüm kirleticileri temizlemek için şeffaf plastik kapağı, şeffaf hazne sürgüsünü ve hazne kızağındaki tıkanma portunu çıkarın.

Ardından haznenin altındaki hava tahliye valfini açık asma kilit işaretine çevirin. Hazne bileşenlerini kurulum ultrasonik temizleyiciye yerleştirdikten sonra, kapağın kaymasını önlemek için hazneyi altındaki kapak ile banyoya yerleştirin. Ultrasonik temizleyiciyi 15 dakika çalıştırın.

Hazne bileşenlerini kurutma istasyonuna taşımadan önce hazne bileşenlerini su banyosunda en az 30 saniye durulayın. Kurutmaya başlamak için, hava tabancasını haznenin üst açıklığının oluğu ile aynı hizaya getirin ve yaklaşık 30 saniye boyunca hava dağıtmak için tabancanın tetiğine basın. Hava tabancasını haznenin üst nozullarına doğru çevirin ve tetiğe bastıktan sonra, her nozul girişinin üç tam dairesini yavaşça izleyin.

Hava tabancasını BTE'nin ortasına yerleştirin ve en iç noktadan başlayarak tetiği basılı tutun ve hava tabancası kızağa doğru bakana kadar hareket ettirin. Yüzey suyunu dışarıdan çıkarmak için tüm haznenin önünden ve arkasından hızla hava akıtan. Narenciye dokusunun işlenmesi için BTE ve konvansiyonel laboratuvar protokolünün karşılaştırılması, her iki durumda da 260 nanometrede absorbans ölçülerek belirlenen ekstrakte edilmiş nükleik asit konsantrasyonlarının karşılaştırılabilir olduğunu göstermiştir.

BTE tarafından ekstrakte edilen nükleik asitlerin saflığı, 260 ve 280 nanometredeki absorbansların oranı olarak belirlendi, düşük protein kontaminasyonu ile yüksekti. Narenciye NADH dehidrojenaz geninin mRNA'sını hedefleyen RT-qPCR ile analiz edilen nükleik asit bütünlüğü, hem BTE hem de standart manuel protokol için çok benzerdi. Konvansiyonel laboratuvar prosedürü, numune başına elle doğrama için yaklaşık yedi ila 10 dakika ve dondurarak kurutma, öğütme ve santrifüjleme dahil olmak üzere doku işleme için daha fazla zaman gerektiriyordu.

Bununla birlikte, BTE, hazırlama, tartma ve temizleme adımları dahil olmak üzere üç dakika içinde bir nükleik asit ekstraksiyonu için her numuneyi işledi. İlk BTE numune işlemesinden elde edilen 72 sağlıklı numunenin hiçbiri, test edilen narenciye patojenleri için amplifikasyon eğrileri üretmedi ve böylece narenciye dokusunun BTE işlemesini doğruladı. İkinci BTE numune işlemede, eklenen iki karışım enfekte numune ile, ekstrakte edilen nükleik asitler, birinci ve beşinci partilerde farklı narenciye virüslerinin ve viroidlerin varlığını gösterdi.

Bununla birlikte, kafalar arasında çapraz kontaminasyon veya yanlış pozitif veya negatif sonuç tespit edilmedi. İşleme sırasında, dalı çok uzun süre tek bir yerde bırakmak, dalı çok derinden kesebilir, tıkanma olasılığını artırabilir ve hücresel olmayan lifli materyal toplayabilir. İşlendikten sonra, materyal çoğu DNA ve RNA ekstraksiyon ve saflaştırma protokolü için hazırdır ve bitki patojenleri için herhangi bir moleküler tespit testi ile test edilebilir.

Budwood Doku Çıkarıcının geliştirilmesi, yüksek verimli alan ve koru çapında taramanın kapısını açtı. Yaprak Doku Çıkarıcı ile birlikte, kökler ve pedinküller gibi daha önce işlenmesi zor kabul edilen bitki dokularının büyük ölçekte işlenmesine izin verir.