İn vitro Model Olarak Tüm Yenidoğan Koklear Eksplantları
28 Temmuz 2023
Mevcut protokol, önceki protokolleri güncellemekte ve yüksek kaliteli koklear eksplantların kültürlenmesi için nispeten basit yaklaşımlar içermektedir. Bu, canlı ve sabit hücrelerde güvenilir veri toplama ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Bu protokol, iç kulak hücrelerini incelemeye yönelik devam eden eğilimi desteklemektedir.
Bu protokol, kültür adımlarını düzene sokmak, yüksek kaliteli eksplantlar elde etmek için basit bir yaklaşım içerir ve koklear hücrelerin moleküler mekanizmalarının araştırılmasına ve ortaya çıkarılmasına katkıda bulunur. Bu tekniğin ana avantajı, diseksiyon adımlarını, uygun polimer yüzey kaplamasını, optimize edilmiş orta hacmi ve eksplantların bağlanma süresini koordine ederek minimum doğrudan organ kullanımıdır. Bu teknik, sensörinöral işitme kaybını incelemek için popüler bir in vitro yaklaşımı temsil eder.
Bu, ototoksik modeller oluşturmak, yapısal analiz yapmak, sinyal yollarını değerlendirmek ve ilaç tarama çalışmaları yapmak için kullanılabilir. Prensip olarak, bu yöntem farklı doku eksplantlarına uygulanabilir. Embriyonik gelişim aşamaları hakkında fikir edinmek için iç kulak araştırmalarında da kullanılabilir.
Başlamak için, kafası kesilmiş farenin kafasını steril pedin üzerine yerleştirin. Mandibulayı çıkarmak için makas ve forseps kullanın, ardından cildi kaldırın ve kafatasından geri soyun. Kafatasını tutmak için forsepsleri yörünge boşluklarına yerleştirin.
Keskin bir neşter bıçağı kullanarak, kokleaya zarar vermeden kafatasını sagital sütür boyunca ve ardından koronal sütür alanı boyunca dikkatlice kesin. Şimdi, beyni iki kafatası yarısından çıkarın. Mikroskop altında, kokleayı temporal kemikte lokalize edin ve koklea ile temporal kemik arasındaki çevre dokuyu gevşetin.
Ardından forsepsleri üst yarım daire kanalına yerleştirin. Temporal kemiği yavaşça kokleadan uzaklaştırın ve girişe bağlı kokleayı temporal kemikle tutun. Forseps uçlarını beyaz bir çizgi olarak görünen apeks bölgesine yerleştirin ve koklear kanalı ortaya çıkarmak için kıkırdaklı koklear kapsülü parça parça çıkarın.
Forsepsleri kokleanın altına yerleştirin ve vestibüler organ ve temporal kemikten ayırın. Kokleayı buz gibi soğuk PBS içeren 60 milimetrelik yeni bir kaba aktarın. Corti eksplant organlarını izole etmek için, organı tabanda ve koklear kanalı bazal kanca bölgesinde tutun ve koklear kanalı yırtmadan modiolustan nazikçe gevşetin.
Ardından koklear kanalı tabanda tutun ve spiral ligament ve stria vaskularisi çekin. Koklear eksplantları izole etmek için, spiral ganglionu kemik spiral laminadan ayırmak için forseps kullanın ve dekolman sırasında modiolusu gevşetin. Forseps ile kanca bölgesini kavrayın ve stria vaskularis ile spiral ligamenti çıkarın.
Ayrıca, Reissner'in zarını parça parça çıkarın. Koklear eksplantları aktarmak için, eksplantın bulunduğu tabağa bir laboratuvar spatulası batırın. Bir spatula sallayarak birkaç mikrolitre PBS ile birlikte saç hücreleri yukarı bakacak şekilde eksplantı kaldırın.
Spatulayı ortamda hafifçe sallayarak eksplantını sekiz oyuklu bir hazne slaytına yerleştirin. Eksplantın odaya kaymasına izin verin. 100 mikrolitrelik bir pipet kullanarak 80 mikrolitre ortamı çıkarın ve atın.
Mikroskop altında saç hücrelerinin ve spiral ganglion nöron hücrelerinin görünürlüğünü kontrol edin. Gerekirse, üst üste binen dokuyu ayırmak için forseps kullanın. Kalan ortamı kuyudan çıkarın.
Eksplant şimdi odanın yüzeyinde daha düz duracaktır. 10 saniye sonra, eksplantın hemen yanındaki ortamdan bir veya iki damla geri pipetleyin ve eksplant ayrılmasını önlemek için kalan ortamı biraz uzağa pipetleyin. Ortamı eklerken eksplantların hareket etmediğinden emin olun.
Organları odanın tabanına sıkıca tutturmak için odayı iki saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı aspire edin. Ve 100 veya 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, dikkatlice 300 mikrolitre taze, önceden ısıtılmış tam ortam ekleyin.
Dönen disk konfokal mikroskobik görüntüler, Corti eksplantlarının sıçan organının hem normal hem de stresli koşullar altında yapılarını ve toplam uzunluklarını koruduğunu gösterdi. Ek olarak, bir taramalı konfokal mikroskop, apoptoz geçiren saç hücreleri ile birlikte fare organlarından eksplantların hayatta kalan saç hücrelerini gösterdi. Protokol, uygun hücre geçirgen problar ve dönen disk konfokal mikroskobu kullanılarak canlı koklear hücrelerdeki biyolojik işlemcilerin izlenmesini sağladı.
Bu koklear eksplantların kültürü, tüy hücreleri ve spiral ganglion hücreleri arasındaki etkileşimin analizini geliştirir. Koklear implantların saç hücreleri, saç hücresi belirteci MYO7A ile tespit edildi. Benzer şekilde, sağlıklı ve hasarlı spiral ganglion hücre gövdeleri ve nöritler, nöronal belirteç Tuj 1 kullanılarak tanımlandı.
Büyütülmüş genel bakışta, MYO7A antikoru ile etiketlenmiş saç hücrelerinin hücre gövdeleri görüldü. Dış saç hücresi stereosilileri ve falloidin ile etiketlenmiş bireysel iç saç hücresi stereosilyalarının evrişimsiz görüntüleri tanımlandı. Mikroskop altında yapılan işlemlerde, özellikle spiral ganglionu kemiksi spiral laminadan ayırırken dikkatli olunmalıdır.
Sağlam eksplantlar dikkatli bir şekilde aktarılmalı ve hizalanmalıdır. Bu protokol, iç kulak eksplantları üzerinde yapılan in-vitro çalışmaları optimize etmiştir. Sinyal yolakları ve ilaç toksisitesi gibi bu çalışmaların sonuçları, daha ileri in-vivo çalışmaların tasarımına rehberlik edebilir.
Genel Bakış
Bu protokol, iç kulak hücrelerini incelemeyi amaçlayan koklear eksplantların kültüre edilmesi için geliştirilmiş bir yaklaşım sunmaktadır. Metodoloji, eksplantların kalitesini artırarak koklear hücre mekanizmalarının ve potansiyel ototoksik yanıtların anlaşılmasına katkıda bulunur. Canlı görüntüleme teknikleri, koklear hücre etkileşimleri ve canlılığı hakkında derinlemesine bilgiler sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Koklear hücre biyolojisi
- İşitme kaybı araştırmaları
Arka Plan
- Bu protokol, koklea eksplant kültürü için kullanılan önceki yöntemleri güncellemektedir.
- İç kulak hücreleri, sensörinöral işitme kaybının incelenmesinde merkezi bir öneme sahiptir.
- Hücresel sağlık ve sinyallemenin değerlendirilmesi için yüksek çözünürlüklü görüntüleme temel bir gerekliliktir.
- Kültür tekniklerindeki ilerlemeler, diseksiyon sırasında meydana gelen hasarı en aza indirmektedir.
Çalışmanın Amacı
- Güvenilir veri elde etmek için koklear eksplant kültürünü optimize etmek.
- Koklear hücrelerdeki moleküler mekanizmaların araştırılmasını kolaylaştırmak.
- İşitme kaybı modellerinde yapısal analizi ve ilaç taramasını desteklemek.
Kullanılan Yöntemler
- Bu çalışma, standartlaştırılmış bir organ kültürü platformu kullanmaktadır.
- Sıçan kohlear eksplantları dikkatle izole edilmiş ve kontrollü bir ortamda kültüre edilmiştir.
- Adımlar arasında diseksiyon, kültür kaplarına aktarım ve düşük-orta koşullarda yapıştırma işlemleri yer almaktadır.
- İnkübasyon süreleri, gözlem sırasında eksplant canlılığı ve stabilitesi için kritiktir.
- Dönen disk konfokal mikroskopi gibi yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri kullanılmıştır.
Ana Sonuçlar
- Eksplantlar hem normal hem de stresli koşullar altında yapılarını korudular.
- Hayatta kalan tüy hücreleri ile apoptoza girenler birlikte tanımlandı.
- Tüy hücreleri ve spiral ganglion hücreleri arasında önemli etkileşimler gözlemlendi.
- Hücre canlılığını ve diferansiyasyonunu değerlendirmek için MYO7A ve Tuj 1 gibi markerlar kullanıldı.
Sonuçlar
- Bu geliştirilmiş protokol, koklea içindeki hücresel etkileşimlerin ve mekanizmaların daha kapsamlı bir şekilde incelenmesine olanak tanır.
- Uygulanan metodolojiler, dikkatli diseksiyonun ve kültür koşullarının önemini vurgulamaktadır.
- Bu çalışmalardan elde edilen bulgular, işitme kaybı ve rejeneratif mekanizmalar üzerine yapılacak gelecekteki in-vivo araştırmalara ışık tutabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Tam neonatal koklear eksplantlar, sensörinöral işitme kaybının altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaların incelenmesi için güçlü bir in vitro model sağlar. Bu platform, tüy hücresi ve nöron canlılığının yüksek içerikli analizine olanak tanıyarak, erken aşama hedef doğrulama ve mekanistik risk azaltma süreçlerinde öngörüsel güvenilirliği destekler. Yöntemin optimize edilmiş iş akışı ve tekrarlanabilirliği, onu işitme kaybı terapötiklerinde portföy önceliklendirme ve translasyonel araştırmalar için değerli bir araç haline getirmektedir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Kontrollü bir sistemde, tüy hücresi ve spiral ganglion nöron etkileşimlerinin doğrudan sorgulanmasına olanak tanır.
- İşitme kaybıyla ilgili yolak ve toksisite çalışmalarına izin vererek mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler.
- Kantitatif görüntüleme ve moleküler belirteç analizi yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını kolaylaştırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Tekrarlanabilir ototoksisite ve ilaç tarama çalışmaları için standartlaştırılmış bir eksplant platformu sağlar.
- Konfokal görüntüleme ve hücreye özgü belirteçler (örneğin, MYO7A, Tuj 1) aracılığıyla kantitatif çıktılar sunar.
- Analiz ölçeklenebilirliğine ve platformun birden fazla deneysel koşulda yeniden kullanımına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Sensorinöral işitme kaybı ve ototoksisite değerlendirmesi için hastalıkla ilişkili modellerle uyumludur.
- In vitro mekanistik çalışmalardan terapötik hipotezlerin in vivo doğrulanmasına kadar olan sürekliliği destekler.
- Hücresel yanıtlar hakkında öngörücü veriler sağlayarak riskten arındırılmış ilerleme kararlarını kolaylaştırır.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu eksplant modeli, erken keşif ile preklinik araştırmalar arasında köprü kurarak; tek bir iş akışı içerisinde hipotez testine, yolak analizine ve bileşik değerlendirmesine olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Koklear hücre sağkalımı ve sinyal iletim mekanizmalarına yönelik hipotez odaklı çalışmaları destekler.
- Tarama: Bileşik ve toksisite taramaları için tekrarlanabilir, kantitatif veriler sağlar.
- Analitik: Hücre canlılığının ve apoptozun yüksek çözünürlüklü görüntülemesine ve belirteç tabanlı kantifikasyonuna olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: İşitme kaybı araştırmalarında preklinik süreklilik için hastalıkla ilişkili bir sistem sunar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: İşitsel araştırmalardaki çeşitli deneysel tasarımlara ve doku türlerine uyarlanabilir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Eksplant hazırlığını kolaylaştırır, kültür koşullarını standartlaştırır ve tekrarlanabilirliği artırır.
- Stratejik Değer: Erken aşama işitme kaybı programlarında karar alma süreçlerini ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Koklear patolojiyi hedefleyen terapötik adayların risk ayarlı önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Optimum eksplant hazırlığı ve analizi için mikrodiseksiyon ve konfokal görüntüleme konusunda uzmanlık gerektirir.
- Çok kuyucuklu kültür sistemlerine ve hücre tanımlama için doğrulanmış moleküler markörlere erişim gerektirir.
- Diseksiyon, kültür ve görüntüleme protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Protokol modifikasyonları ile çeşitli kemirgen modellerine ve potansiyel olarak diğer doku eksplantlarına uyarlanabilir.
- Eksplant bütünlüğünü korumak ve güvenilir kantitatif çıktılar sağlamak için dikkatli uygulama esastır.
