Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme
21 Nisan 2023
Bu protokol, vahşi tip farelerde korteksi bozulmadan bırakırken iki foton mikroskobu ile tek nöron aktivitesinin görüntülenmesi ve kısmi korteks mutant farelerde geniş alan mikroskobu ile tüm SC'nin görüntülenmesi dahil olmak üzere, uyanık farelerin superior colliculus'unda (SC) kalsiyum yanıtlarını görüntüleme prosedürünü detaylandırır.
Araştırmam nöral kodlama ve görsel işleme mekanizmalarına odaklanıyor. Beyinde, özellikle de altta yatan nöro-mekanizmaların altındaki superior colliculus'ta çeşitli bilgilerin nasıl kodlandığını cevaplamaya çalışıyoruz. Görsel işlemeyi anlamak için bilim adamları, nöronal morfoloji, antegrad ve retrograd izleme, IL dizileme, nöro modelleme, makine öğrenimi gibi çeşitli yaklaşımları birleştirir, iyi anlaşılır.
Buradaki zorluk, kafatasını SSA'nın üzerinden çıkarmak, kesmek ve kemikte daha büyük bir parça halinde bırakmaktır, çünkü kemik duraya bağlı olduğu için başarısız olması muhtemeldir. İki fotoğrafı geniş alanlı bir kalsiyum görüntüsünde birleştirerek, son çalışmamız fare SC'sinde hem tek hücre çözünürlüğünde hem de küresel ölçekte hareket yönünün fonksiyon mimarisini ortaya çıkardı. Benzer tercihe sahip nöronların, burun hareketinde yukarı doğru küreselin altında 500 mikrometreye kadar yamalar oluşturduğunu bulduk.
Protokolümüzle iki araştırma boşluğunu ele alıyoruz. İlk olarak, araştırmacılar korteksi kırmadan tek bir hücre çözünürlüğünde fare SC'de uzun süreli döküm görüntüleme yapabilirler. İkinci olarak, araştırmacılar geniş alan mikroskobu kullanarak tüm SC boyunca nöroaktiviteyi kaydedebilirler.
Protokolümüz, farelerde sağlam bir korteks ile posterior medial SC'yi tek hücre çözünürlüğünde görüntülemek için bir ölçü sağlar. Ayrıca, kronik görüntüleme için enfeksiyonu azaltan SC'yi ortaya çıkarmak için biyouyumlu bir fiş kullanıyoruz. Sonuçlarımız, geniş bir görsel alanda görsel bilginin sinirsel kodlamasını incelemek için bir yol sağlar.
Optogenetik ile birlikte, SC'deki nöroaktiviteyi modüle eden farklı beyin bölgelerinden gelen yarı girdiler incelenebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma; yabanıl tip farelerde korteks korunarak tek nöron aktivitesini yakalamak için iki foton mikroskobisi, kısmi korteks mutant farelerinde ise tüm SC'yi görüntülemek için geniş alan mikroskobisi kullanarak, uyanık farelerin superior kollikulusundaki (SC) kalsiyum yanıtlarının görüntülenmesi için bir protokol sunmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Görüntüleme Teknikleri
- Görsel İşleme
Arka Plan
- Superior colliculus, görsel bilgi işlemede kritik bir rol oynar.
- SC'deki nöronal kodlamayı anlamak, görsel işlem mekanizmalarının aydınlatılması için temeldir.
- Önceki görüntüleme yöntemleri kortikal bütünlüğü bozabilir ve bu durum uzun süreli kayıt çalışmalarını karmaşıklaştırabilir.
- Bu protokol, görüntüleme için minimal invaziv bir yaklaşım sunarak bu zorlukları gidermeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Fare SC'sinde uzun süreli kalsiyum görüntüleme için güvenilir bir yöntem oluşturmak.
- Korteksi bozmadan tüm SC genelinde nöroaktivite kaydını kolaylaştırmak.
- Görsel bilginin SC'de nöronal düzeyde nasıl temsil edildiğine dair anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Çalışmada iki fotonlu ve geniş alanlı mikroskopi teknikleri kullanılmaktadır.
- Kalsiyum görüntüleme için GCaMP6m ekspres etmek amacıyla adeno-ilişkili bir virüs kullanılarak yabanıl tip ve mutant fare modellerinden yararlanılmıştır.
- Temel metodolojiler arasında kafa plakası implantasyonu, SC'yi açığa çıkarmak için cerrahi yaklaşımlar ve kronik görüntüleme için bir vakum başlığı kullanımı yer almaktadır.
- Viral enjeksiyon sonrası, görüntüleme başlamadan önce üç haftalık bir iyileşme süresi gözlemlenmektedir.
- Detaylı cerrahi adımlar, çevre dokulara verilen hasarın minimumda tutulmasını sağlar.
Temel Sonuçlar
- Protokol, SC içindeki hareket yönü tercihlerine bağlı nöron aktivitesinin ayrıntılı olarak incelenmesini sağlar.
- Bulgular, benzer tercihler sergileyen nöronların kümelenebildiğini ve bunun geniş alanlar genelindeki görsel sinyal işlemesini etkilediğini göstermektedir.
- Kortikal bütünlük korunurken kronik görüntüleme gerçekleştirilebilir, bu da nöronal dinamiklerin süregelen çalışmalarını kolaylaştırır.
- Görüntü verilerinin optogenetikle birleştirilmesi, beynin diğer bölgelerinden gelen modülatör girdilerin araştırılmasına olanak tanır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, SC'de kalsiyum sinyalleri analiz etmek için sağlam bir yöntem oluşturarak görsel işleme mekanizmalarının anlaşılmasına önemli katkı sağlamaktadır.
- Belirtilen görüntüleme teknikleri, uyanık hayvanlarda nöronal aktivitenin boylamsal çalışmalarında ilerlemeler vaat etmektedir.
- Bu tür metodolojiler, nöronal mekanizmaların ve bunların görsel davranış ile bozukluklar üzerindeki etkilerinin araştırılmasını geliştirecektir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörle İlgili Yönetici Özeti
Fare üst kolikulusunda (SC) yüksek çözünürlüklü kalsiyum görüntüleme, görsel işlemenin temelini oluşturan nöral kodlamanın doğrudan sorgulanmasına olanak tanıyarak hedef doğrulama aşamasında mekanistik risklerin azaltılmasını destekler. Uyanık hayvanlarda hem tek hücre ve hem de tüm yapı aktivitesini yakalayabilme yeteneği, translasyonel nörobilim ve nörofarmasötik portföyler için öngörücü güven sağlar. Bu çift ölçekli yaklaşım, erken keşif kararlarını güçlendirir ve görsel sistem hedefleri için alt aşamadaki analiz gelişimine bilgi sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Hücresel ve ağ düzeylerinde görsel işlem devrelerinin fonksiyonel haritalanmasını sağlar.
- SC'deki kalıtımsal ve de novo nöral kodlamayı ayırt ederek mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Hedef seçimi ve doğrulamasına bilgi sağlayacak nicel nöral aktivite verileri sunar.
- Hastalıkla ilgili sistemlerde görsel özellik kodlamasının hipotez odaklı sorgulanmasını kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Nöronal yanıtların tekrarlanabilir ölçümü için valide edilmiş görüntüleme platformları kurar.
- Görsel yolak modellerinde bileşik taramasına uygun, kantitatif ve ölçeklenebilir okumalar sağlar.
- Çalışmalar ve ekipler arası karşılaştırılabilirlik için assay koşullarının standardizasyonuna olanak tanır.
- Nöroaktif bileşikler için sağlam fenotipik tarama assaylerinin geliştirilmesini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Nöral aktivite ölçümlerini, görsel fonksiyonun translasyonel biyobelirteçleri ile hizalar.
- Keşif aşamasındaki nöral kodlamadan, görsel sistem müdahalelerinin preklinik doğrulamasına kadar süreklilik sağlar.
- In vivo fonksiyonel verilere dayanarak görsel yolak hedeflerinin riskle uyumlu şekilde ilerletilmesine olanak tanır.
- Optogenetik entegrasyon kullanarak devre modülasyonunun mekanistik çalışmalarını destekler.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu görüntüleme protokolü; SC'de hipotez testlerini, yolak açıklığa kavuşturmayı ve kantitatif analizleri mümkün kılarak erken keşif ile preklinik araştırmalar arasında köprü kurar. Hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya ve translasyonel çalışmalara kadar olan entegrasyon için konumlandırılmıştır.
- Keşif Biyolojisi: SC'de nöral kodlamanın ve yolak fonksiyonunun doğrudan ölçümünü kolaylaştırır.
- Tarama: Analiz geliştirme ve bileşik değerlendirme için tekrarlanabilir, kantitatif görüntüleme çıktıları sağlar.
- Analizler: Nöronal aktivite hakkında yüksek içerikli veriler sunarak deneysel koşulların istatistiksel karşılaştırmasını destekler.
- Translasyonel Araştırma: İn vivo nöral aktiviteyi, görsel sistem bozuklukları için potansiyel biyobelirteçlerle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Diğer beyin bölgelerine ve araştırma sorularına uyarlanabilir, yeniden kullanılabilir bir görüntüleme platformu sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır ve görsel işlemleme araştırmalarındaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Çalışmalar arasında tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik için görüntüleme iş akışlarını standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Sürecin erken aşamalarında sağlam fonksiyonel veriler sağlayarak karar verme mekanizmalarını ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Görsel sistem hedeflerinin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini sağlar ve ilerleme kararlarını nicel kanıtlarla destekler.
Uygulama Hususları
- In vivo görüntüleme, cerrahi hazırlık ve veri analizi konularında uzmanlık gerektirir.
- İki fotonlu ve geniş alanlı mikroskopi platformlarına ve destekleyici altyapıya erişim gereklidir.
- Hayvan kullanımı, viral iletim ve görüntüleme protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Kaynağın desteklediği şekilde, protokol modifikasyonları ile diğer beyin bölgelerine uyarlanabilir.
- Kronik çalışmalar için uzun süreli görüntüleme stabilitesi ve hassas hedefleme pratik hususlardır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:41
Preparation of a Suction Cup and Plugs for Calcium Imaging in Mouse
4:30
Viral Construct (AAV) Injection in Mouse Superior Colliculus for Calcium Imaging
5:48
Implantation of the Headplate in Mouse for Calcium Imaging
6:40
Implanting the Plug in the Mouse for Calcium Imaging
8:06
Two‐Photon Calcium Imaging of Mouse Superior Colliculus Neurons
9:37
Wide‐Field Calcium Imaging of Mouse Superior Colliculus Neurons
