Name: Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Öğrenin, memeli hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu oksijenden bağımsız olarak ölçmek için geliştirilen yeni tahlilleri. Bu yöntemler, hipoksik koşullarda metabolik stres adaptasyonunu incelemek için LC-MS ve stabil izotop izleme tekniklerini kullanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu yazıda üretilen figürler BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu makale hakkında geri bildirim sağladığı için Amy Walker'a minnettarız. J.B.S., Worcester Biyomedikal Araştırma Vakfı Bursu tarafından desteklendi.

DHODH ve SDH Aktivitelerini Ölçmek için Kararlı İzotop İzleme ve LC-MS Analizi

<ol><li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li>
<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2, 16080(2016).</li>
<li>Chandel, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+generated+at+mitochondrial+complex+III+stabilize+hypoxia-inducible+factor-1alpha+during+hypoxia%3A+A+mechanism+of+O2+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: A mechanism of O2 sensing.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25130-25138 (2000).</li>
<li>Cadenas, E., Boveris, A., Ragan, C. I., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+superoxide+radicals+and+hydrogen+peroxide+by+NADH-ubiquinone+reductase+and+ubiquinol-cytochrome+C+reductase+from+beef-heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome C reductase from beef-heart mitochondria.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 180 (2), 248-257 (1977).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li>
<li>Spinelli, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fumarate+is+a+terminal+electron+acceptor+in+the+mammalian+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain.</a> Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).</li>
<li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+redox+cycle+with+complex+II+prioritizes+sulfide+quinone+oxidoreductase-dependent+H%282%29S+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A redox cycle with complex II prioritizes sulfide quinone oxidoreductase-dependent H(2)S oxidation.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (1), 101435(2022).</li>
<li>Warburg, O., Geissler, A. W., Lorenz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+growth+of+cancer+cells+in+media+in+which+glucose+is+replaced+by+galactose%5BTitle%5D)+AND+%22Hoppe-Seyler%27s+Zeitschrift+f%C3%BCr+Physiologische+Chemie%22%5BJournal%5D)">On growth of cancer cells in media in which glucose is replaced by galactose.</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 348 (12), 1686-1687 (1967).</li>
<li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+the+Crabtree+effect%3A+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicological Sciences. 97 (2), 539-547 (2007).</li>
<li>Attardi, G., King, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cells+lacking+mtDNA%3A+Repopulation+with+exogenous+mitochondria+by+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation.</a> Science. 246 (4929), 500-503 (1989).</li>
<li>Bodnar, A. G., Cooper, M., Leonard, J. V., Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory-deficient+human+fibroblasts+exhibiting+defective+mitochondrial+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Respiratory-deficient human fibroblasts exhibiting defective mitochondrial DNA replication.</a> Biochemical Journal. 305, 817-822 (1995).</li>
<li>Gregoire, M., Morais, R., Quilliam, M. A., Gravel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+auxotrophy+for+pyrimidines+of+respiration-deficient+chick+embryo+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">On auxotrophy for pyrimidines of respiration-deficient chick embryo cells.</a> European Journal of Biochemistry. 142 (1), 49-55 (1984).</li>
<li>Mackay, G. M., Zheng, L., vanden Broek, N. J., Gottlieb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+metabolism+using+LC-MS+and+isotope+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell metabolism using LC-MS and isotope tracers.</a> Methods in Enzymology. 561, 171-196 (2015).</li>
<li>Heinrich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+for+natural+isotope+abundance+and+tracer+impurity+in+MS-%2C+MS%2FMS-+and+high-resolution-multiple-tracer-data+from+stable+isotope+labeling+experiments+with+IsoCorrectoR%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Correcting for natural isotope abundance and tracer impurity in MS-, MS/MS- and high-resolution-multiple-tracer-data from stable isotope labeling experiments with IsoCorrectoR.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17910(2018).</li>
<li>Lee, P., Chandel, N. S., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+adaptation+to+hypoxia+through+hypoxia+inducible+factors+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular adaptation to hypoxia through hypoxia inducible factors and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (5), 268-283 (2020).</li>
<li>Bisbach, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Succinate+can+shuttle+reducing+power+from+the+hypoxic+retina+to+the+O%282%29-rich+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Succinate can shuttle reducing power from the hypoxic retina to the O(2)-rich pigment epithelium.</a> Cell Reports. 31 (2), 107606(2020).</li>
<li>Angebault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idebenone+increases+mitochondrial+complex+I+activity+in+fibroblasts+from+LHON+patients+while+producing+contradictory+effects+on+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Idebenone increases mitochondrial complex I activity in fibroblasts from LHON patients while producing contradictory effects on respiration.</a> BMC Research Notes. 4, 557(2011).</li>
<li>Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Methods in Cell Biology. 155, 3-31 (2020).</li>
<li>Iwai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+accumulation+during+ischemia+induces+mitochondrial+damage+in+perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Sodium accumulation during ischemia induces mitochondrial damage in perfused rat hearts.</a> Cardiovascular Research. 55 (1), 141-149 (2002).</li>
<li>Murphy, E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+and+mitochondrial+sodium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular and mitochondrial sodium in health and disease.</a> Circulation Research. 104 (3), 292-303 (2009).</li>
<li>Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+analysis+of+mitochondria+from+cultured+cells+and+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52076(2015).</li>
<li>Murphy, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+measuring+reactive+oxygen+species+and+oxidative+damage+in+cells+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo.</a> Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).</li>
<li>Xiao, Y., Meierhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+hydroethidine-based+probes+reliable+for+reactive+oxygen+species+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Are hydroethidine-based probes reliable for reactive oxygen species detection.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 31 (4), 359-367 (2019).</li>
<li>DeBerardinis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+aerobic+glycolysis%3A+Transformed+cells+can+engage+in+glutamine+metabolism+that+exceeds+the+requirement+for+protein+and+nucleotide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Beyond aerobic glycolysis: Transformed cells can engage in glutamine metabolism that exceeds the requirement for protein and nucleotide synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19345-19350 (2007).</li>
<li>Keeley, T. P., Mann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+physiological+normoxia+for+improved+translation+of+cell+physiology+to+animal+models+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Defining physiological normoxia for improved translation of cell physiology to animal models and humans.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 161-234 (2019).</li>
<li>Ast, T., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+and+mammalian+cell+culture%3A+Are+we+repeating+the+experiment+of+Dr.+Ox%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Oxygen and mammalian cell culture: Are we repeating the experiment of Dr. Ox.</a> Nature Metabolism. 1 (9), 858-860 (2019).</li>
<li>Gu, C., Jun, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+hypoxia+decrease+the+metabolic+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Does hypoxia decrease the metabolic rate.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 668(2018).</li>
<li>Voorde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+metabolic+fidelity+of+cancer+models+with+a+physiological+cell+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Advances%22%5BJournal%5D)">Improving the metabolic fidelity of cancer models with a physiological cell culture medium.</a> Scientific Advances. 5 (1), 7314(2019).</li>
<li>Cantor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologic+medium+rewires+cellular+metabolism+and+reveals+uric+acid+as+an+endogenous+inhibitor+of+UMP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Physiologic medium rewires cellular metabolism and reveals uric acid as an endogenous inhibitor of UMP synthase.</a> Cell. 169 (2), 258-272 (2017).</li>
<li>MacPherson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+relevant+T+cell+expansion+media+activate+distinct+metabolic+programs+uncoupled+from+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Clinically relevant T cell expansion media activate distinct metabolic programs uncoupled from cellular function.</a> Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 24, 380-393 (2022).</li>
<li>Torres-Quesada, O., Doerrier, C., Strich, S., Gnaiger, E., Stefan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+cell+culture+media+tune+mitochondrial+bioenergetics+and+drug+sensitivity+in+cancer+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Physiological cell culture media tune mitochondrial bioenergetics and drug sensitivity in cancer cell models.</a> Cancers. 14 (16), 3917(2022).</li>
<li>Chan, S. W., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mtDNA+damage+using+a+supercoiling-sensitive+qPCR+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring mtDNA damage using a supercoiling-sensitive qPCR approach.</a> Methods in Molecular Biology. 554, 183-197 (2009).</li>
<li>Doherty, E., Perl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+mass+by+flow+cytometry+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Reactive+Oxygen+Species%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial mass by flow cytometry during oxidative stress.</a> Reactive Oxygen Species. 4 (10), 275-283 (2017).</li>
<li>Birsoy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+of+the+mitochondrial+electron+transport+chain+in+cell+proliferation+is+to+enable+aspartate+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An essential role of the mitochondrial electron transport chain in cell proliferation is to enable aspartate synthesis.</a> Cell. 162 (3), 540-551 (2015).</li>
<li>Beigneux, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-citrate+lyase+deficiency+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">ATP-citrate lyase deficiency in the mouse.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (10), 9557-9564 (2004).</li>
<li>Gameiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+HIF-mediated+reductive+carboxylation+is+regulated+by+citrate+levels+and+sensitizes+VHL-deficient+cells+to+glutamine+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo HIF-mediated reductive carboxylation is regulated by citrate levels and sensitizes VHL-deficient cells to glutamine deprivation.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 372-385 (2013).</li>
<li>Fendt, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+glutamine+metabolism+is+a+function+of+the+alpha-ketoglutarate+to+citrate+ratio+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reductive glutamine metabolism is a function of the alpha-ketoglutarate to citrate ratio in cells.</a> Nature Communications. 4, 2236(2013).</li>
<li>Lee, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+studies+of+isolated+mitochondria+from+normal+and+diseased+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Biochemical studies of isolated mitochondria from normal and diseased tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1271 (1), 21-28 (1995).</li>
</ol>

Yazarların bildirecek çıkar çatışması yoktur.

Ortaya çıkan araştırmalar, memeli mitokondrilerinin moleküler oksijen tüketmeden işlev görebileceğini gösterdiğinden, araştırmacıların mitokondriyal fonksiyonu doğru bir şekilde ölçmek için OCR ölçümlerinin ötesinde ortogonal tahliller kullanmaları son derece önemlidir. Burada, mitokondriyal NAD + / NADH dengesini, adaptif terminal elektron alıcılarının kullanımını, ATP üretimini, de novo pirimidin biyosentezini ve mitokondriyal türevli ROS'u ölçerek kompleks I, kompleks II, kompleks V ve DHODH aktivitelerini doğrudan değerlendirmek için kullanılabilecek bir dizi tahlil derledik. Özellikle, bu testler mitokondriyal fonksiyonu OCR ölçümlerinden daha doğrudan ölçer. Ayrıca, bu testler araştırmacılara hipoksi sırasında mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için izlenebilir yollar sağlar; bunun için OCR ölçümleri, tercih edilen terminal elektron alıcısı olarak fumaratın kullanılması nedeniyle büyük ölçüde alakasızdır. Son olarak, burada açıklanan proliferasyona dayalı yöntemler, klasik respirometri deneylerinden daha uygun maliyetlidir, bu nedenle memeli sistemlerinde mitokondriyal fonksiyonu incelemek için geniş çapta erişilebilir bir yol sağlar.
Kültürlenmiş hücrelerde mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için bu tahlilleri kullanırken dikkat edilmesi gereken önemli noktalar vardır. Proliferasyon tahlilleri ile ilgili olarak, her hücre hattının iki katına çıkma oranı için tohumlanan hücre sayısını ayarlamak önemlidir. Hücreler en az% 10 birleşime ve üç ila dört katına çıkmasına izin verecek kadar alana sahip olarak tohumlanmalıdır, böylece proliferasyondaki farklılıklar ölçülebilir. Her bir tahlil için bir diğer husus, her bir ETC kompleksinin aktiviteleri için kontrol olarak kullanılan küçük moleküllerin konsantrasyonudur. Farklı hücre hatları bu inhibitörlere karşı farklı hassasiyetler gösterebildiğinden, optimal konsantrasyonu belirlemek için bu küçük moleküllerin dozunu test etmek çok önemlidir.
OCR ölçümleri ve burada açıklanan tüm tahliller de dahil olmak üzere in vitro mitokondriyal fonksiyonu inceleyen testlerin evrensel bir sınırlaması, kültür ortamının metabolik bileşimidir. Standart hücre kültürü ortamı, sistemleri yüzeysel olarak yüksek mitokondriyal fonksiyon seviyelerine önyargılı hale getirme eğilimindedir. Örneğin, suprafizyolojik glutamin seviyeleri, mitokondriyal NADH sentezini besleyen ve sonuç olarak oksidatif fosforilasyonu artıran TCA döngüsü25'in anaplerozunu arttırır. Benzer şekilde, kısmi oksijen basıncı memeli dokularında 3 mmHg ile 100 mmHg (yaklaşık% 0.1 -% 13O2) arasında değişir, ancak in vitro26,27 atmosferiktir (140 mmHg, yaklaşık% 21). Bu fazlaO2, mitokondriyal solunum kapasitesini ve süperoksit üretimini en üst düzeye çıkarır28. Son zamanlarda, kültür medyasını daha fizyolojik29,30 olacak şekilde tasarlamak için çaba sarf edilmiştir. Özellikle, insan plazması benzeri ortamdaki hücrelerin kültürlenmesi, bazı kanser hücre hatlarında mitokondriyal solunumuazaltır 30, T hücrelerinde mitokondriyal ROS31 ve kanser terapötiklerine mitokondriyal adaptasyonlar32. Bu nedenle, kullanılan kültür ortamının bileşimine dikkat etmek ve mitokondriyal fonksiyonu nasıl etkileyebileceğini anlamak çok önemlidir.
Mitokondriyal fonksiyonun yorumlanmasında bir diğer önemli ve evrensel sınırlama, mitokondri sayısındaki farklılıkların potansiyelidir. Bu nedenle, mitokondriyal içeriğin, mtDNA33'ün nicelleştirilmesi, mitokondriyal kütlenin membran potansiyeline duyarsız boyalar34 ile ölçülmesi veya mitokondriyal belirteçlerin batı lekelenmesi yoluyla ölçülmesi kritik öneme sahiptir. Bu kritik bir kontroldür, böylece mitokondri sayısındaki bir azalma, mitokondriyal fonksiyondaki bir azalma ile karıştırılmaz.
Burada açıklanan tahliller için geçerli olan belirli sınırlamalar ve sorun giderme işlemleri de vardır. İlk olarak, farklılaşmış hücrelerin çoğalmadığı göz önüne alındığında, proliferasyona dayalı analizler bu bağlamda mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için yararlı olmayacaktır. DHODH aktivitesini ölçmek için 13C 4-aspartat izleme protokolünün önemli bir sınırlaması, hücrelerdeki aspartat alımının son derece verimsiz olabileceğidir35. Bu potansiyel sınırlamanın üstesinden gelmek için araştırmacılar, 13 C 4-aspartat alımını kolaylaştırmak için aspartat taşıyıcı SLC1A3'ü aşırı ifade edebilirler35.
SDH aktivitesini ölçmek için 13C 5-glutamin izlemeyi kullanan protokolün bir sınırlaması, bu tahlilin hücrelerin ters aktiviteyi ölçmek için M + 3 izotopologlarını zenginleştirmek için indirgeyici karboksilasyon yolunu kullanmalarını gerektirmesidir. Bazı hücre hatları, düşük ATP sitrat liyaz ekspresyonu36, yetersiz HIF stabilizasyonu37 veya çok düşük bir α-KG: sitrat oranı38 nedeniyle indirgeyici karboksilasyon akısı yapamaz. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, SDH'yi ileri ve geri aktiviteleri ölçmek için 13C 4-aspartat izleme kullanılabilir7. Bu tahlilde, SDH ileri aktivitesi fumarat M + 2: süksinat M + 2 oranı ve süksinat M + 4: fumarat M + 4 ile ters reaksiyon ile ölçülebilir. Özellikle, bu izleme, indirgeyici karboksilasyon yolundaki enzimlerin çoğunu atlatır.
DCPIP indirgemesini okuma olarak kullanan karmaşık I aktivite testinin bir sınırlaması, mitokondrinin yapısal olarak sağlam olmamasıdır. Tahlil için NADH alımını sağlamak için mitokondrinin dondurularak çözülmesi işlemi, mitokondriyal membran39'un yapısal bütünlüğünü kesinlikle bozabilir. Bu tahlil, kompleks I aktivitesindeki değişikliklerin bozulmamış hücreler için de doğru olduğundan emin olmak için kompleks I proliferasyon testi gibi testlere paralel olarak yapılmalıdır.
Gelecekteki çalışmalarda, bu tekniklerden bazıları, fareler ve Caenorhabditis elegans gibi model organizmalar kullanılarak in vivo mitokondriyal fonksiyonları ölçmek için uyarlanabilir.Mitokondriyal fonksiyonu in vivo olarak ölçmek için kullanılan mevcut yöntemler, organizma düzeyinde OCR'ye, özellikle fare modellerini kullanırken solunum değişim oranına odaklanmıştır. Bu yöntemin açık bir sınırlaması, oksijenin mitokondriyal ETC'de her yerde bulunan bir terminal elektron alıcısı olarak rolünün ötesinde birçok biyokimyasal ve sinyal fonksiyonuna hizmet etmesidir. Örneğin, oksijen, dioksijenaz ailesindeki enzimlerin katalitik aktivitesi tarafından "tüketilir". Bu enzimler hücresel oksijen tüketim hızına katkıda bulunsalar da, mitokondriyal fonksiyona katılmazlar, düzenlemezler veya yansıtmazlar. Klasik respirometri deneyleri in vitro tipik olarak "mitokondriyal olmayan OCR" yi kontrol ederken, organizma solunum değişim oranı (RER) deneyleri bunu kontrol edemez ve RR'nin in vivo mitokondriyal fonksiyon için bir metrik olarak yorumlanmasını sınırlar. Bununla birlikte, protokollerin DHODH aktivitesini ölçmek için 13C 4-aspartat izleme, 13C5-glutamin izleme yoluyla kompleks II aktivitesi, dokulardan saflaştırılmış mitokondri üzerindeki kompleks I aktivitesi ve mitokondriyal fonksiyonu in vivo olarak ölçmek için MitoB gibi LC-MS dostu bileşikler kullanılarak mitokondriyal ROS kullanmak mümkündür. Mitokondriyal fonksiyonları sorgulamak için yapılan bu doğrudan testler, klasik respirometri deneyleriyle birlikte, araştırmacılara memeli hücrelerinde ve dokularında mitokondriyal fonksiyonun daha kapsamlı ve doğru bir değerlendirmesini sağlar.

Mitokondriyal fonksiyon, memeli hücrelerinde anahtar biyosentetik, biyoenerjik ve sinyal fonksiyonlarını sürdürdüğü için hücresel sağlığın kritik bir metriğidir1. Mitokondriyal fonksiyonların büyük çoğunluğu elektron taşıma zinciri (ETC) boyunca elektron akışı gerektirir ve ETM'deki elektron akışındaki bozulmalar ciddi mitokondriyal hastalığa neden olur2. ETC, iç mitokondriyal membrana gömülü bir dizi indirgeme ve oksidasyon (redoks) reaksiyonundan oluşur ve bu elektron transfer reaksiyonları, ATP sentezini, termojenez gibi fizyolojik süreçleri, de novo pirimidin biyosentezi gibi biyosentetik yolları ve NADH gibi ko-faktörlerin redoks durumunun dengesini desteklemek için kullanılabilecek serbest enerjiyi serbest bırakır. ETC kompleksi I ve III, sırayla HIF, PI3K, NRF2, NFκB ve MAPK6 gibi sinyal anahtar yollarını düzenleyen reaktif oksijen türleri (ROS) 3,4,5 üretir. Sonuç olarak, ETM'deki elektron akışı ölçümleri klasik olarak memeli hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon için bir vekil olarak kullanılır.
Respirometri deneyleri, memeli hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için sıklıkla kullanılır. O2, memeli ETC için en yaygın terminal elektron alıcısı olduğundan, indirgenmesi mitokondriyal fonksiyon için bir vekil olarak kullanılır. Bununla birlikte, ortaya çıkan kanıtlar, memeli mitokondrilerinin, de novo pirimidin biyosentezi 7, NADH oksidasyonu7 ve hidrojen sülfür8'in detoksifikasyonu dahil olmak üzere ETC'ye bağlı mitokondriyal fonksiyonları sürdürmek için bir elektron alıcısı olarak fumaratı kullanabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, belirli bağlamlarda, özellikle hipoksik ortamlarda,O2 tüketim oranının (OCR) ölçümleri, mitokondriyal fonksiyonun kesin veya doğru bir göstergesini sağlamaz.
Burada, OCR'den bağımsız olarak mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için kullanılabilecek bir dizi tahlili özetliyoruz. Kompleks I-aracılı NADH oksidasyonunu, dihidroorotat dehidrogenaz aracılı de novo pirimidin biyosentezini, kompleks V-bağımlı ATP sentezini, süksinat dehidrogenaz (SDH) kompleksinin net yönlülüğünü ve mitokondriyal kaynaklı ROS'u doğrudan ölçmek için tahliller sunuyoruz. Bu testlerin kültürlü memeli hücreleri üzerinde yapılması amaçlanmıştır, ancak birçoğu in vivo mitokondriyal fonksiyonları incelemek için uyarlanabilir.Özellikle, bu protokolde açıklanan tahliller, mitokondriyal fonksiyonların OCR'den daha doğrudan ölçümleridir. Dahası, OCR'nin gösterge niteliğinde bir ölçüm olmadığı bir bağlam olan hipokside mitokondriyal fonksiyonun ölçülmesini sağlarlar. Birlikte ele alındığında, bu testler, klasik respirometri deneyleri ile birlikte, araştırmacılara memeli hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonun daha kapsamlı bir değerlendirmesini sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 1.5 mL tüp</td><td>Hücre Tedavisi</td><td>667443</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL tüp</td><td>Hücre Tedavisi</td><td>229446</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Hücre Tedavisi</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu plaka</td><td>Hücre Tedavisi</td><td>229112</td><td></td></tr><tr><td>13C 4 aspartat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>604852</td><td></td></tr><tr><td>13C5-Glutamin</td><td>Cambridge İzotop Laboratuvarları</td><td>285978-14-5</td><td></td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpü</td><td>Hücre Tedavisi</td><td>667411</td><td></td></tr><tr><td>50 mL santrifüj tüpü</td><td>Hücre Tedavisi</td><td>667421</td><td></td></tr><tr><td>150 mm doku kültürü kabı</td><td>Hücre Tedavisi</td><td>229651</td><td></td></tr><tr><td>1x Fosfat tamponlu salin</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>2,6- diklorofenolindofenol</td><td>Honeywell</td><td>33125</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Karbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37999</td><td></td></tr><tr><td>Antimisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ascentis Express C18</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53825-U</td><td></td></tr><tr><td>Şişe üstü filtre 500 mL, 0.22 ve mikro; m, PES 9 9 mm membran çapı</td><td>Hücre Tedavisi</td><td>229717</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Brequinar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0113</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kaldırıcı, Çift Uçlu Düz ve Dar Bıçaklı</td><td>Hücre Tedavisi</td><td>229305</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap -105 Soğuk Tuzak</td><td>Labconco</td><td>7385020</td><td></td></tr><tr><td>Komple Proteaz İnhibitörü Tabletler</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>4693116001</tr><tr><td>Coulter Karşı Bardaklar</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-694</td><td></td></tr><tr><td>Desilobinon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7911</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Santrifüj 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>2231000908</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Santrifüj 5910 Ri</td><td>Eppendorf</td><td>5943000343</td><td></td></tr><tr><td>Galaktoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glikozsuz DMEM</td><td>Gibco</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin İçermeyen DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>Isıyla İnaktive Edilmiş Fetal Sığır Serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HPLC sınıfı% 35 Amonyum hidroksit</td><td>Thermo Scientific</td><td>460801000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC dereceli Asetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900667</td><td></td></tr><tr><td>HPLC dereceli Kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>HPLC dereceli formik asit</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>HPLC dereceli İzopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>HPLC dereceli MeOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>900688</tr><tr><td>HPLC dereceli Su</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Osteosarcome Hücre Hattı 143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td></td></tr><tr><td>İzoton tamponu</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546719</td><td></td></tr><tr><td>K 2 HPO<> sub 4 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MitoSox Kırmızı</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>N-asetil-L-sistein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Oligomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Doku Öğütücü, Boyut 21</td><td>Kimble</td><td>885502-0021</td><td></td></tr><tr><td>Piruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Pirüvat içermeyen DMEM ortamı</td><td>Gibco</td><td>11965175</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Kütle Spektrometresi</td><td>Thermo Scientific</td><td>726030</td><td></td></tr><tr><td>ReCO2ver İnkübatör</td><td>Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı Santrifüj Masaüstü Vakum Konsantratörü</td><td>RIP</td><td>7310020 A</td><td></td></tr><tr><td>Tampon</td><td>Millipore Sigma</td><td>20188</td><td></td></tr>, <tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr>, <tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC 5 & mu; m 150 x 2,1 mm analitik kolon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.50460.0001</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC koruma kiti</td><td>Millipore Sigma</td><td>1.50438.0001</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit, Peletler</td><td>Millipore Sigma</td><td>567530-250GM</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW, TRACEFINDER 5.1 SP3</td><td>Termo Bilimsel</td><td>OPTON-31001</td><td></td></tr><tr><td>Tert-bütil hidroperoksit çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>25-200-114</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-S01-A-02</td><td></td></tr><tr><td>Z2 Coulter Parçacık sayısı ve boyutu analizör</td><td>Beckman Coulter</td><td>BZ10131270</td><td></td></tr></tbody></table>

memelilerde mitokondriyal fonksiyonu Ölçmek için oksijenden bağımsız tahliller

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Mitokondriyal elektron taşıma zincirindeki (ETC) elektronların akışı, memeli hücrelerinde çok yönlü biyosentetik, biyoenerjik ve sinyal fonksiyonlarını destekler. Oksijen (O2), memeli ETC için en yaygın terminal elektron alıcısı olduğundan,O2 tüketim oranı sıklıkla mitokondriyal fonksiyon için bir vekil olarak kullanılır. Bununla birlikte, ortaya çıkan araştırmalar, bu parametrenin her zaman mitokondriyal fonksiyonun göstergesi olmadığını göstermektedir, çünkü fumarat hipokside mitokondriyal fonksiyonları sürdürmek için alternatif bir elektron alıcısı olarak kullanılabilir. Bu makale, araştırmacıların mitokondriyal fonksiyonuO2 tüketim oranından bağımsız olarak ölçmelerini sağlayan bir dizi protokolü derlemektedir. Bu testler, hipoksik ortamlarda mitokondriyal fonksiyonu incelerken özellikle yararlıdır. Spesifik olarak, mitokondriyal ATP üretimini, de novo pirimidin biyosentezini, kompleks I ile NADH oksidasyonunu ve süperoksit üretimini ölçmek için yöntemler açıklıyoruz. Klasik respirometri deneyleriyle birlikte, bu ortogonal ve ekonomik testler, araştırmacılara ilgi sistemlerindeki mitokondriyal fonksiyonun daha kapsamlı bir değerlendirmesini sağlayacaktır.

DHODH, kompleks I ve kompleks V'nin aktiviteleri proliferasyon testleri kullanılarak değerlendirilebilir. İdrarın kültür ortamından yoksun bırakılması üzerine, hücreler pirimidin biyosentezi için de novo yola daha bağımlı hale gelir. Bu nedenle, hücreler idrarsız bir ortamda çoğalmaya zorlandıklarında, DHODH aktivitesinin brequinar tarafından inhibe edilmesine, idrar içeren bir ortamda kültürlenen hücrelerden daha duyarlıydılar (Şekil 6A). Benzer şekilde, piruvatın kültür ortamından yoksun bırakılması, hücreleri çoğalma için karmaşık I aktivitesine daha bağımlı hale getirir. Bu nedenle, hücreler piruvat içermeyen bir ortamda çoğalmaya zorlandıklarında, rotenon tarafından kompleks I aktivitesinin inhibisyonuna, piruvat içeren bir ortamda kültürlenen hücrelerden daha duyarlıydılar (Şekil 6B). Kompleks V aktivitesi, hücrelerin glikoz yerine galaktoz içeren bir ortamda çoğalması için zorlanarak değerlendirilebilir. Galaktoz glikolizde net sıfır ATP verdiğinden, bu yakıtta büyüyen hücreler karmaşık V aktivitesi yoluyla mitokondriyal ATP sentezine daha fazla bağımlıdır. Bu nedenle, galaktoz içeren bir ortamda çoğalan hücreler, oligomisin tarafından kompleks V inhibisyonuna, glikoz içeren bir ortamda çoğalan hücrelerden daha duyarlıydı (Şekil 6C).
SDH aktivitesi, 13C 5-glutamin izleme kullanılarak ve fumarat ve süksinat izotopologlarına katılımı izlenerek ölçülebilir. Araçla muamele edilen koşullarda, SDH kompleksi ileri aktiviteyi destekledi ve 13 C 4-süksinatın 13 C 4-fumaratın 13 C3-süksinat içine dahiledilmesinden daha yüksekti (Şekil 7). Antimisin ile muamele edilmiş koşullarda, SDH kompleksi ters aktiviteyi destekledi ve 13 C 3-fumaratın 13 C3-süksinat içine dahil edilmesi, 13 C 4-süksinatın 13C 4-fumarat içine dahil edilmesinden daha büyüktü (Şekil 7).
Mitokondri içindeki süperoksit üretimi, süperoksit ile reaksiyona girdikten sonra 2-hidroksi-mitoethidium üreten floresan muhabir MitoSox kullanılarak ölçülebilir. Bu çalışmada, tertbütil hidrojen peroksit varlığında MitoSox ile tedavi edilen hücreler, hücresel ROS'u söndüren bir antioksidan olan NAC'ın eklenmesiyle baskılanan bir şekilde daha yüksek 2-hidroksi-mitoethidium seviyelerine sahipti (Şekil 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig01.jpg"> Şekil 1: Karmaşık V proliferasyon testinin mekanik temeli. Glikoz ve galaktozun glikoliz yoluyla oksidasyonu. Glikoz, glikolizden net iki ATP verirken, galaktoz net sıfır ATP verir, çünkü UDP-galaktoz için UTP sentezi gereklidir. Bu nedenle, galaktozda yetişen hücreler, glikolizden üretilen ATP eksikliği nedeniyle mitokondriyal ATP sentezine daha fazla bağımlıdır. Kısaltmalar: GALK = galaktokinaz; GALT = galaktoz-1-fosfat üridililtransferaz; PGM1 = fosfoglukomutaz 1; GPI = glukoz-6-fosfat izomeraz, UGP = UDP-glukoz pirofosforilaz; GALE = UDP-galaktoz-4-epimeraz; NDK = nükleotid difosfat kinaz; UMPK = idrar monofosfat kinaz; HK = hekzokinaz; PFK = fosfofruktokinaz; ALDO = aldolaz; TPI = triozefosfat izomeraz; GAPDH = gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz; PGK = fosfogliserat kinaz; PGM = fosfoglukutaz; ENO = enolaz; PK = piruvat kinaz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig02.jpg"> Şekil 2: Kompleks I proliferasyon testinin mekanik temeli. Kompleks I aktivitesinin inhibisyonu üzerine değiştirilen metabolik yolakların şeması. Yüksek piruvat ortamında, kompleks I inhibisyonu LDH aracılı NADH oksidasyonu yoluyla atlanır. Düşük piruvat ortamında, bu adaptasyon daha az uygulanabilirdir, bu da hücreleri NADH'yi yeniden oksitlemek için karmaşık I aktivitesine daha bağımlı hale getirir. Kısaltmalar: LDH = laktat dehidrojenaz; TCA döngüsü = trikarboksilik asit döngüsü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig03.jpg"> Şekil 3: 13C 4-aspartat izlemesi üzerine DHODH reaksiyonunun şeması. Brequinar, orotat için dihidroorotat oksidasyonunu inhibe eder, böylece UMP'nin aşağı akış sentezini önler. 13C 4-aspartat, DHODH aktivitesi yoluyla 13C3-UMP'ye dahil edilir. Kısaltmalar: OMM = dış mitokondriyal membran; IMM = iç mitokondriyal membran; DHODH = dihidroorotat dehidrojenaz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig04.jpg"> Şekil 4: 13C 5-glutamin izleme ile ileri ve geri kompleks II aktivitesinin ölçülmesi. İleri kompleks II aktivitesini ölçmek için (solda), 13 C 5-glutaminin 13 C 4-süksinat ve 13C 4-fumarat içine dahil edilmesi izlenir. Ters kompleks II aktivitesini ölçmek için (sağda), 13 C 5-glutaminin 13 C 3-süksinat ve 13C 3-fumarat içine dahil edilmesi izlenir. Kısaltmalar: SDH = süksinat dehidrojenaz; CytC = sitokrom C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig05.jpg"> Şekil 5: MitoSox Kırmızısı'nın süperoksit ile reaksiyonu. MitoSox'un mitokondriyal süperoksitlerle reaksiyonu 2-OH-MitoE2 + 'yı oluşturur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig06.jpg"> Şekil 6: Mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için proliferasyona dayalı testler (A) Bir DHODH inhibitörü olan 5 uM brequinar ile tedavi edilen 143B osteosarkom hücrelerinin çoğalması, ±100 ug / mL idrar ile ortamda. Veriler SEM ± ortalamadır; Koşul başına N = 3. (B) Bir kompleks I inhibitörü olan 2 uM rotenon ile tedavi edilen 143B osteosarkom hücrelerinin ±5 mM piruvat içeren ortamda çoğalması. Veriler SEM ± ortalamadır; Koşul başına N = 3. (C) Kompleks bir V inhibitörü olan 5 uM oligomisin ile tedavi edilen 143B osteosarkom hücrelerinin, tek merkezi karbon kaynağı olarak 10 mM glikoz veya 10 mM galaktoz içeren ortamda çoğalması. Veriler SEM ± ortalamadır; Koşul başına N = 3. * Graphpad Prizma'da tek yönlü bir ANOVA testi kullanarak p &lt; 0,05'i gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig07.jpg"> Şekil 7: Kompleks II aktivitesini ölçmek için 13C 5-glutamin izleme. DMSO ve 500 nM antimisin A ile muamele edilmiş Caki1 ve DLD1 hücrelerinde süksinat oksidasyonu ve fumarat indirgemesi (SDH ters) Veriler SEM ± ortalamayı temsil eder; Koşul başına N = 3. GraphPad Prizma'da eşlenmemiş bir t-testi kullanarak p &lt; 0,05'i gösterir. Kısaltmalar: SDH = süksinat oksidasyonu; SDH ters = fumarat indirgeme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig07large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig08v2.jpg"> Şekil 8: Süperoksiti tespit etmek için LCMS bazlı MitoSox testi. tBuOOH ± NAC varlığında 30 dakika boyunca MitoSox ile tedavi edilen Caki1 hücrelerinden izole edilen 2-OH-Mito E2 + 'nın ekstrakte edilmiş iyon kromatogramı. Kısaltmalar: LCMS = sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi; NAC = N-asetil sistein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig08large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan reaktiflerin, tamponların ve ortamların bileşimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184_Table%201%20Reaction%20Compositions_Revision%20(2).xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Burada, memeli hücrelerinde moleküler oksijen tüketme yeteneklerinden bağımsız olarak mitokondriyal fonksiyonu doğrudan ölçmek için bir tahlil derlemesi sunuyoruz.

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Araştırmamız, mitokondrinin metabolik stresörleri nasıl algıladığı ve adapte ettiği üzerine odaklanmaktadır. Önemli bir metabolik stresör, hücreler oksijene aç kaldığında ortaya çıkan hipoksidir. Düşük oksijenli ortamlarda mitokondriyal fonksiyonu incelemek için daha iyi testler geliştiriyoruz.Hücre ve doku metabolit seviyelerini incelemek için daha yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi kullanıldı. Belirli metabolitlerin kaderini izlemek ve sağlıklı ve hastalıklı memeli fizyolojisi ile ilgili yeni metabolik yolları ortaya çıkarmak için kararlı izotop izleme çalışmaları kullandık. Grup, memeli mitokondrilerinin düşük oksijenli ortamlarda kritik işlevleri sürdürebileceğini bulmuştur.Mekanik olarak, elektron taşıma zinciri için alternatif bir elektronik asa olarak fumarat kullanırlar. Bu protokol, araştırmacıların memeli hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu daha iyi değerlendirmek için kullanabilecekleri birkaç tahlil derlemektedir. Önemli olarak, bu protokoller hipokside mitokondriyal fonksiyonu incelemek için kullanılabilir, çünkü klasik respirometri deneyleri yeterli olmayacaktır.

oxygen-independent-assays-to-measure-mitochondrial-function-in-mammals

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Mitokondri izole fare kalbinde mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek açılması ölçümü için bir spektrofluorometrik protokolü sunulmuştur. Tahlil mitokondri Ca eşzamanlı ölçüm...

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

Örnekler arasındaki mitokondriyal membran potansiyelinin karşılaştırılması, hücresel durum hakkında değerli bilgiler verir. Mitokondriyi izole etmek ve floresan kullanarak inhibitörlere ve ayrıştırıcılara yanıtı değerlendirmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır. Bu protokolün yöntemi ve faydası, bir hücre kültürü ve hücresel stresin hayvan modeli kullanılarak gösterilmiştir.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Sunulan yöntemler, minimum miktarlarda fare iskelet kasından izole mitokondri kullanılarak yapılan bir mikroplaka bazlı respirometrik tahliller koleksiyonunun performansı için adım adım talimatlar sağlar. Bu tahliller, yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelinde mitokondriyal oksijen tüketimindeki mekanik değişiklikleri/adaptasyonları ölçebilir.

Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Burada, daha küçük miktarlarda fare iskelet kasından yüksek kaliteli ve saflaştırılmış mitokondrinin izolasyonuna izin veren daha önce bildirilen bir yöntemin bir modifikasyonunu sunuyoruz. Bu prosedür, mikroplaka bazlı respirometirk testleri sırasında yüksek işlevle solunum yapan yüksek oranda bağlanmış mitokondri ile sonuçlanır.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Bu yazıda, oksijen tüketimi yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri Drosophila permeabilized thoraxes içinde kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu teknik doku klasik mitokondrial yalıtım tekniği için karşılaştırıldığında çok az bir miktar gerektirir ve elde edilen sonuçlar daha fizyolojik ilgilidir.

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

Mitokondrial solunum organizmalar hayatta kalmak için önemlidir; Bu nedenle, oksijen tüketim oranını mitokondrial sağlık mükemmel bir göstergesidir. Bu iletişim kuralı, Bazal ölçmek için piyasada bulunan bir respirometer nasıl kullanılacağını açıklar ve maksimal oksijen tüketimi oranlarında yaşa, sağlam ve serbestçe hareketli Caenorhabditis elegans.

Oksijen tüketimi oranlarında sağlam Caenorhabditis elegans ölçümü

Taze tümör homojenatlarında mitokondriyal oksidatif fosforilasyon ve elektron transfer kapasitesini değerlendirmek için pratik bir protokol ve analitik yaklaşım geliştirdik. Bu protokol, kanser başlangıç, ilerleme ve tedavi yanıtına katkıda bulunan çeşitli mitokondriyal işlevleri incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Eksiz katı tümör homojenatlarının Mitokondriyal fonksiyonunun analitik tayini

Burada, fare iskelet kasından mitokondri izolasyonu için ayrıntılı bir yöntem ve ardından mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak Oksijen Tüketim Hızı (OCR) ile solunum analizi için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu boru hattı, çoklu çevresel veya genetik müdahalelerin mitokondriyal metabolizma üzerindeki etkilerini incelemek için uygulanabilir.

Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

Bu makale, lipid-proksimal bir ortamda çeşitli partner faktörlerle in vitro olarak integral membran proteinlerinin etkileşimlerini ve montajlarını değerlendirmek için bir yöntemi açıklamaktadır.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için İn Vitro

TRNA (UUU) üretimi ve agaroz jel geciktirme testleri ile TcdA enzimi ile kompleks içinde tRNA (UUU) analizi için bir protokol sunulmuştur.

Analiz için Protein-tRNA Agaroz Jel Retardasyon Testleri<em&gt; K</em<sup&gt; 6</sup&gt; Threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Öğrenin, memeli hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu oksijenden bağımsız olarak ölçmek için geliştirilen yeni tahlilleri. Bu yöntemler, hipoksik koşullarda metabolik stres adaptasyonunu incelemek için LC-MS ve stabil izotop izleme tekniklerini kullanır.

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Daha fazla video keşfet