Name: Murin Artrit Dokusundan Primer Sinovyal Makrofaj ve Fibroblastların İzolasyonu ve Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Öğrenin, iltihaplı artrit dokusundan primer sinovyal makrofaj ve fibroblast izolasyonu için geliştirilmiş bu yöntemi. RTQ-PCR ile doğrulanan yüksek saflıkta hücreler, romatoid artrit patogenez mekanizmalarının araştırılmasına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Tıbbi Araştırma Destek Bölümü, İleri Araştırma Destek Merkezi (ADRES) personeline ve Ehime Üniversitesi Proteo-Bilim Merkezi (PROS) Bütünleştirici Patofizyoloji Bölümü üyelerine teknik yardımları ve yardımcı destekleri için teşekkür eder. Bu çalışma kısmen Japonya Bilimi Teşvik Derneği (JSPS) KAKENHI hibeleri JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (NS'ye) ve JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (YI'ye); Osaka İnatçı Hastalıklar Tıbbi Araştırma Vakfı, Nakatomi Vakfı, Japon Kemik ve Mineral Araştırmaları Derneği (JSBMR) Yükselen Yıldızlar Hibesi, Sumitomo Vakfı, SENSHIN Tıbbi Araştırma Vakfı, Mochida Memorial Vakfı (NS'ye); ve Takeda Bilim Vakfı Tıbbi Araştırma hibesi, UCB Japonya (UCBJ) proje hibesi ve JSBMR Frontier Scientist hibesi 2019 (YI'ye).

Hayvanları içeren deneyler, Ehime Üniversitesi Hayvan Deneyleri Komitesi tarafından onaylandı ve Ehime Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yönergesi'ne (37A1-1*16) uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Aletlerin, reaktiflerin ve kültür ortamının hazırlanması
<ol><li>Kültür ortamını aşağıdaki gibi hazırlayın: Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (DMEM) fetal sığır serumu (FBS) ve %1 antibiyotik-antimikotik solüsyon (anti-anti) ile takviye edin.</li>
	<li>Sindirim ortamını aşağıdaki gibi hazırlayın: kültür ortamını 1 mg / mL kollajenaz tip IV ile destekleyin. Kullanmadan hemen önce kollajenaz konsantrasyonunu ayarlayın.</li>
	<li>Tip IC kollajeni 1 mM HCl çözeltisi ile 0.15 mg / mL konsantrasyona seyreltin. Seyreltilmiş kollajen çözeltisi ile sel kültürü kapları (40 veya 60 mm çapında). Oda sıcaklığında 6-12 saat sonra, kollajen çözeltisini bulaşıklardan çıkarın ve oda sıcaklığında kurutun. Kollajen kaplı bulaşıklar oda sıcaklığında en az 1 hafta saklanabilir. Önceden kaplanmış bulaşıkları kullanmadan önce fosfat tamponlu salin (PBS) veya orta ile yıkayın.</li>
	<li>Makas, tırtıklı uçlu cımbız ve ince uçlu cımbız gibi steril cerrahi aletler hazırlayın. Kullanmadan önce p etanole batırın.</li>
</ol>2. Farelerde sinovit dokusunun hazırlanması ( Şekil 1A)
<ol><li>Arka pençelerinde enflamatuar artritli bir fare hazırlayın. NOT: Bu protokol için kollajen antikoru kaynaklı artrit (CAIA) veya K/BxN serum transfer artriti (STA) olan doğumdan 7-8 hafta sonra dişi C57BL / 6 fareler (18-20 g) kullanıldı8. SM'leri şişmemiş (yani sağlıklı) dokudan izole etmek, hücre sayısı yetersiz olduğu için zor olabilir.</li>
	<li>Fareleri 80 mg / kg ketamin ve 16 mg / kg ksilazin intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. Fareleri% 70 etanol ile temizleyin.</li>
	<li>Kalbi ortaya çıkarmak için göğüs bölgesini makasla kesin. Kalbin sağ kulak kepçesini makasla kesin ve ardından kalbin tepesinden sol ventriküle 23 G'lık bir kelebek iğne batırın, ardından periferik kanı manuel olarak çıkarmak için bir şırınga kullanarak 15-20 mL steril PBS reflüsü uygulayın (yaklaşık 1 mL / 2 s).</li>
	<li>Makas kullanarak cildi keserek ve tırtıklı uçlu cımbız kullanarak cildi çekerek arka pençeleri süsleyin. NOT: Bu adımdan sonra numunelerin taşınması için cımbız kullanılması tavsiye edilir. Fare kıllarının yapışmasını önlemek için süslenmiş dokuya parmaklarınızla dokunmayın.</li>
	<li>Metatarsofalangeal eklemleri çekerek yerinden çıkarın, ardından ayak parmaklarını çıkarmak için makas kullanarak eklemlerin bağlarını kesin.</li>
	<li>Ayak bileğine yakın alt bacak kaslarının tendonlarını makas kullanarak kesin. Tendonu cımbızla kavrayın ve tibiayı ortaya çıkarmak için alt bacaktaki kasları proksimal olarak soyun. Fibulayı çıkarın.</li>
	<li>Diz eklemini çekerek yerinden çıkarın, ardından şişmiş arka pençe ile tibiayı ayırmak için makas kullanarak eklemlerin bağlarını kesin. Numuneleri adım 3.1'e kadar işlenene kadar buz gibi soğuk kültür ortamında (0,3 mL/cm2) tutun.</li>
</ol>3. Sinovit dokusunun sindirimi ( Şekil 1B)
<ol><li>Numuneden kaçınarak kültür ortamını aspire edin ve ardından taze kültür ortamı (0.3 mL/cm2) ekleyin. Yıkama işlemini üç veya dört kez tekrarlayın. NOT: Bu adımdan itibaren, numunelerin taşınması temiz bir tezgahta veya güvenlik kabininde aseptik olarak gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>Stereomikroskop altında (10x-20x büyütmede) kültür ortamında ince uçlu cımbız kullanarak çekerek numunelerin tüm eklemlerini yerinden çıkarın. İnce uçlu cımbız bu adımda uygundur. Kaval kemiğini ve mümkün olduğunca çok sayıda damarı, tendonu ve bağı çıkarın. Yerinden çıkarken kemikleri kırmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Numune başına iki adet 15 mL'lik tüp hazırlayın. Çıkık kemikleri yumuşak dokularla birlikte cımbızla ilk 15 mL'lik tüpe aktarın. Her iki arka pençeden elde edilen numune başına 4 mL sindirim ortamı tüpe ekleyin.</li>
	<li>Artık hücreleri ve doku parçalarını toplamak için, numunenin bulunduğu ortamı ikinci 15 mL'lik tüpe aktarın. Ortamı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, peleti 1 mL sindirim ortamı ile yeniden süspanse edin ve hücre ve doku parçası çözeltisini hemen hemen tüm dokuyu içeren ilk 15 mL'lik tüpe aktarın (toplam 5 mL sindirim ortamı / arka pençeler).</li>
	<li>Numuneyi 37 °C'de 60-120 dakika hibridizasyon fırınında çalkalayarak sindirin. NOT: Numuneleri sindirmek için en uygun zamana karar verilmelidir. Süre, ayak bileklerindeki ve kollajenazlardaki şişliğin derecesine bağlıdır. Çoğu durumda, 60-120 dakika yeterlidir. 60 dakikalık inkübasyondan sonra, sindirilmiş numunenin bir kısmını pipetleme ile toplayın ve mikroskop altında gözlemleyin. Sindirim yetersizse, inkübasyon devam etmeli ve sindirim her 30 dakikada bir kontrol edilmelidir.</li>
	<li>Çözeltiyi iyice pipetleyin. Hücre çözeltisini bir hücre süzgecinden (40 μm gözenek boyutu) 50 mL'lik bir tüpe süzün.</li>
	<li>Hücre süzgecinden 50 mL'lik tüpe 10 mL kültür ortamı ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı çıkardıktan sonra, 10 mL kültür ortamı ile tekrar süspanse edin. Santrifüjlemeyi tekrarlayın. Süpernatanı çıkardıktan sonra, 2 mL kültür ortamı ile tekrar süspanse edin.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65196/65196fig01.jpg"> Şekil 1: Murin artrit dokusu ve kollajenaz sindirimi örneklemesi prosedürü . (A) (i) İnflamatuar artritli murin arka pençesi. (ii) Arka pençedeki derinin çıkarılması. (iii) Metatarsofalangeal eklemlerin çıkığı ve ayak parmaklarının çıkarılması. (iv) Ayak bileğindeki tendonların kesilmesi. (v) Alt bacaklardaki kasların çıkarılması. (vi) Diz ekleminin çıkığı. (b) Solda; kültür ortamında eksize edilmiş bacaklar. Sağ; kültür ortamında çıkık tarsus ve metatars. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65196/65196fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
4. Sinovyal fibroblastların izolasyonu ( Şekil 2A)
<ol><li>Her iki ayak bileğinden elde edilen tüm hücre süspansiyonlarını kollajen kaplı kap üzerine tohumlayın. NOT: Hücreleri elde etmek için zayıf veya orta derecede şişliği olan ayak bilekleri kullanılıyorsa, 40 mm çapında bir çanak uygulanır. Kollajen kaplı çanak boyutu, her iki ayak bileğinde de şiddetli şişlik varsa 60 mm çapında bir çanak olarak değiştirilebilir.</li>
	<li>Kültür ortamı ekleyin (yaklaşık 222 μL/cm2). % 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak yapışmayan hücreleri toplayın (adım 5.1'de kullanın). Kollajen kaplı kabı kültür ortamıyla yıkayın ve ortamı toplayın. Yapışık hücreleri taze ortamda kültürleyin (Şekil 2B,i). Kollajen kaplı çanağa hızla yapışan hücrelerin çoğu, fibroblastoid (iğ şeklinde) bir morfoloji sergiler.</li>
	<li>Hanks'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) %0.05 tripsin ile muamele edilerek alt birleşen hücrelerin geçişi. Bu yöntemde, ilk genişlemede bile olsa diğer hücrelerin kontaminasyonu sınırlıdır. Daha saflaştırılmış fibroblast benzeri hücreler gerekiyorsa, saflığın arttırılmasına izin vermek için tekrarlanan geçiş yapın; bununla birlikte, adezyon halinde hücrelerin sitoplazmasının genişlemesi de gözlenir (Şekil 2B,ii). Aşırı pasajlar hücrelerdeki naif özelliklerin kaybına etki ettiğinden, 5'ten az pasajlı hücreler kullanın.</li>
</ol>5. Sinovyal makrofajların izolasyonu ( Şekil 2A)
<ol><li>Adım 4.4'ten itibaren tüm yapışmayan hücreleri, kollajen ile kaplanmamış bulaşıklara (40 veya 60 mm çapında) tohumlayın. NOT: Yapışık olmayan hücreler arasında makrofajlar, diğer lenfositler ve sinovit dokusundan kalan fibroblastlar bulunur.</li>
	<li>Toplu hücreleri% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de 1 gün boyunca kültürleyin.</li>
	<li>Yapışmayan lenfositleri çıkarmak için, kültürlenmiş ortamı aspire edin ve ardından taze kültür ortamı ekleyin. Bu işlemi iki veya üç kez tekrarlayın (Şekil 2B,iii).</li>
	<li>Yapışık yığın hücrelerini kültür ortamında 1-2 hafta boyunca kültürleyin, birleşmeyi korurken her 2 günde bir ortam değişir (Şekil 2B, iv). NOT: SF'lerle ko-kültür koşulları altında SM'lerin sayısı yavaş yavaş artar. Bu nedenle, ko-kültür periyodu gerektiği gibi ayarlanmalıdır.</li>
	<li>PBS veya HBSS ile iki kez yıkayın. HBSS'de (yaklaşık 55 μL/cm2) %0.05 tripsin ile 37 ° C'de 3 dakika boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde muamele edin. Fibroblastlar, tripsin tedavisi ile kültür kabından kolayca ayrılır ve makrofajlar, tripsin tedavisine direnç gösterir. Sinovyal makrofajların seçimi için bu özelliği kullanın.</li>
	<li>HBSS'de kültür ortamını (yaklaşık 222 μL /cm2) nazikçe% 0.05 tripsine ekleyin. Bu adımdan sonra, ortamı doğrudan hücrelerin üzerine dökmeyin.</li>
	<li>Ayrılmış hücreleri çıkarmak için, kültürlenmiş ortamı aspire edin ve ardından taze kültür ortamını nazikçe ekleyin. Bu işlemi iki veya üç kez tekrarlayın. Kullanana kadar tabak üzerinde kalan hücreleri taze kültür ortamında tutun (Şekil 2B,v). NOT: Tripsin tedavisini takiben, yapışık hücreler makrofaj benzeri morfolojik özellikler sergiler.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65196/65196fig02.jpg"> Şekil 2: İnflamatuar artrit dokusundan makrofajdan zengin ve fibroblasttan zengin fraksiyonların ayrılması. (A) Makrofajdan zengin ve fibroblasttan zengin hücreleri artrit dokusundan ayırma prosedürünün şeması. (B) Prosedürün aşamalarının temsili faz kontrast görüntüleri, Şekil 2A'da (i) ila (v). Ölçek çubuğu 100 μm'yi temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65196/65196fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

İnflamatuar Artritin Ortaya Çıkarılması: Sinovyal Hücrelerin İşlevlerini Keşfetmek

<ol><li>Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid arthritis.</a> Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).</li>
<li>McInnes, I. B., Schett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).</li>
<li>Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+tissue+macrophages%3A+friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22RMD+Open%22%5BJournal%5D)">Synovial tissue macrophages: friend or foe.</a> RMD Open. 3 (2), (2017).</li>
<li>Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+macrophages%3A+from+ordinary+eaters+to+extraordinary+multitaskers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers.</a> Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).</li>
<li>Alivernini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+synovial+tissue+macrophage+subsets+regulate+inflammation+and+remission+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis.</a> Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).</li>
<li>Saeki, N., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+synovial+macrophage+metabolism+by+synovial+fibroblasts+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188(2020).</li>
<li>Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+protocol+for+the+isolation+and+culture+of+normal+and+arthritogenic+murine+synovial+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts.</a> Protocol Exchange. , (2009).</li>
<li>Saeki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulator+UHRF1+orchestrates+proinflammatory+gene+expression+in+rheumatoid+arthritis+in+a+suppressive+manner%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner.</a> The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).</li>
<li>Midwood, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenascin-C+is+an+endogenous+activator+of+Toll-like+receptor+4+that+is+essential+for+maintaining+inflammation+in+arthritic+joint+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease.</a> Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).</li>
<li>You, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolically+engineered+stem+cell-derived+exosomes+to+regulate+macrophage+heterogeneity+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis.</a> Science Advances. 7 (23), 0083(2021).</li>
<li>Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+propagation+method+for+resident+macrophages+by+co-culture+and+subculture%2C+and+their+isolation+from+various+organs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs.</a> BMC Immunology. 20 (1), 34(2019).</li>
<li>Andrä, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+T-cell+functionality+after+flow+cytometry+sorting+revealed+p38+MAPK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation.</a> Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).</li>
<li>Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sheath+fluid+impacts+the+depletion+of+cellular+metabolites+in+cells+afflicted+by+sorting+induced+cellular+stress+%28SICS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS).</a> Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).</li>
<li>Llorente, I., García-Castañeda, N., Valero, C., González-Álvaro, I., Castañeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+in+rheumatoid+arthritis%3A+dangerous+liaisons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons.</a> Frontiers in Medicine. 7, 601618(2020).</li>
<li>Croft, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+fibroblast+subsets+drive+inflammation+and+damage+in+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis.</a> Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).</li>
<li>Wei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+drives+synovial+fibroblast+identity+and+arthritis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology.</a> Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Burada geliştirilen bu yöntem, hem SF'leri murin artritinden hem de yerleşik makrofajları bir dizi organdan izole etmek için önceki teknikleri geliştirir 7,11. Modifiye yöntem, hem makrofajları hem de fibroblastları enflamatuar sinovyumdan yüksek saflıkta izole edebilir ve basit ve tekrarlanabilir. Yöntem, hücre sıralayıcı gibi karmaşık aletler gerektirmediğinden, herkes bunu gerçekleştirebilir. Ek olarak, mevcut teknik, antikorlarla tedavi ve sıralama ile ilişki...

Romatoid artrit (RA), sinovyumun hiperplazisi ile karakterize, eklem yıkımına yol açan otoimmün bir hastalıktır 1,2. Dokuda yerleşik makrofajlar ve fibroblastlar, eklem homeostazını korumak için sağlıklı sinovyumda bulunur. RA hastalarında, sinovyal fibroblastlar (SF'ler) çoğalır ve monositler de dahil olmak üzere bağışıklık hücreleri, inflamasyonla ilişkili süreçlerolan sinovyum ve eklem sıvısına sızar 1,3,4. Yerleşik makrofajları ve periferik kan monosit kaynaklı makrofajları içeren sinovyal makrofajlar (SM'ler) ve SF'ler anormal bir şekilde aktive olurlar ve RA patogenezinde önemli rollere sahiptirler. Son çalışmalar, SM'ler ve SF'ler arasındaki hücre-hücre etkileşimlerinin RA5,6'nın hem alevlenmesine hem de remisyonuna katkıda bulunduğunu göstermiştir.
RA patogenezini anlamak için, K/BxN serum transfer artriti, kollajen kaynaklı artrit ve kollajen antikoru kaynaklı artrit dahil olmak üzere çeşitli kemirgen inflamatuar artrit modelleri kullanılmıştır. Artritte moleküler fonksiyonları açıklığa kavuşturmak için genellikle hücre bazlı tahliller gereklidir. Bu nedenle, hayvan artrit modellerinden birincil hücreler izole edilmiştir. SF'leri murin artrit dokusundan izole etme yöntemi iyi bilinmektedir ve bu hücreler artrit patogenezinde moleküler mekanizmaların aydınlatılmasına katkıda bulunmuştur 7,8. Öte yandan, kemik iliği kaynaklı makrofajlar, kan monosit kaynaklı makrofajlar ve makrofaj hücre hatları, artrit çalışmaları için sıklıkla makrofaj kaynakları olarak kullanılmıştır 9,10. Makrofajlar mikroçevreleri ile ilişkili işlevler kazanabildiklerinden, genel makrofaj kaynakları artrit dokusuna özgü yanıtlardan yoksun olabilir. Ayrıca murin sinovyum artrit modellerinde bile çok küçük bir doku olduğu için sıralama ile yeterli sinovyal hücre elde etmek zordur. İn vitro çalışmalarda sinovyal makrofajların kullanılmaması artrit çalışmalarında bir sınırlama olmuştur. Sinovyal makrofajları izole etmek ve genişletmek için bir protokolün oluşturulması, RA'daki patolojik mekanizmaların aydınlatılması için bir avantaj olacaktır.
SF'leri izole etmek için önceki yöntemde, SM'ler atıldı7. Bunun yanı sıra, yerleşik makrofajları bazı organlardan izole etmek ve genişletmek için bir yöntem bildirilmiştir11. Bu nedenle, mevcut protokoller kombinasyon halinde değiştirildi. Değişiklik, hem SM'lerin hem de SF'lerin birincil kültürünü yüksek saflıkta elde etmeyi amaçlamaktadır. Bu yöntemin genel amacı, hem SM'leri hem de SF'leri murin artrit dokusundan izole etmek ve genişletmektir.

<table><tbody><tr><td>5.0 g / L Tripsin / 5.3 mmol / L EDTA çözeltisi</td><td>nacalai tesque</td><td>35556-44</td><td>HBSS Antibiyotik ile seyreltilmiş</td></tr><tr><td>&ndash; antimikotik (anti / anti)</td> <td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Kelebek iğne</td><td>TERUMO</td><td>SV-23DLK</td><td>23G</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>40 & m gözenek, Naylon Cellmatrix</td></tr><tr><td>Tip IC</td><td>Nitta jelatin</td><td>637-00773</td><td>Tip IC kollajen</td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü 15</td><td>TPP</td><td>91014</td><td>15 mL tüp</td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü 50</td><td>TPP</td><td>91050</td><td>50 mL tüp</td></tr><tr><td>C. Histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td>Tip IV kollajenaz</td></tr><tr><td>Dulbecco'dan kollajenaz s Modifiye Eagle Medium GlutaMax (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>SIGAM</td><td>173012</td><td>Isı inaktivasyonu yapıldı</td></tr><tr><td>Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS)</td><td>Wako</td><td>085-09355</td><td></td></tr><tr><td>Makas Biyo</td><td>Araştırma Merkezi</td><td>PRI28-1525A</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü kabı 40</td><td>TPP</td><td>93040</td><td>Hücre kültürü için</td></tr><tr><td>Doku kültürü kabı 60</td><td>TPP</td><td>92006</td><td>Hücre kültürü için</td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>KFI</td><td>1-9749-31</td><td>İnce Uçlu</td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>Biyo Araştırma Merkezi</td><td>PRI28-1522</td><td>Tırtıklı uç</td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 305</td><td>ZEISS</td><td>STEMI305-EDU</td><td>Stereomikroskop</td></tr></tbody></table>

murin artrit dokusundan primer sinovyal makrofaj ve fibroblastların İzolasyonu ve kültürü

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Romatoid artrit, eklemlerin kronik iltihaplanmasına yol açan otoimmün bir hastalıktır. Romatoid artrit patogenezinde sinovyal makrofajlar ve sinovyal fibroblastlar merkezi rol oynarlar. İnflamatuar artritte patolojik progresyon ve remisyonun altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak için her iki hücre popülasyonunun fonksiyonlarını anlamak önemlidir. Genel olarak in vitro deneysel koşullar, mümkün olduğunca in vivo ortamı taklit etmelidir. Primer doku kaynaklı hücreler, artritte sinovyal fibroblastları karakterize eden deneylerde kullanılmıştır. Buna karşılık, inflamatuar artritte makrofajların biyolojik fonksiyonlarını araştıran deneylerde, hücre hatları, kemik iliği kaynaklı makrofajlar ve kan monosit kaynaklı makrofajlar kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu tür makrofajların aslında dokuda yerleşik makrofajların işlevlerini yansıtıp yansıtmadığı belirsizdir. Yerleşik makrofajlar elde etmek için, önceki protokoller, inflamatuar artrit fare modelinde sinovyal dokudan hem primer makrofajları hem de fibroblastları izole etmek ve genişletmek için değiştirildi. Bu primer sinovyal hücreler, inflamatuar artritin in vitro analizi için yararlı olabilir.

7-8 haftalıkken dişi C57BL/6 farelerine kollajen antikoru kaynaklı artrit uygulandı. Makrofaj benzeri hücreler ve fibroblast benzeri hücreler, yukarıda tarif edilen prosedüre göre inflamatuar artrit dokusundan bağımsız olarak izole edildi (Şekil 2A,B). Makrofaj benzeri hücreler adım 5.7'den hemen sonra kullanıldı. Fibroblast benzeri hücreler başlangıçta adım 4.4'ten sonra alt birleşim olacak şekilde kültürlendi ve daha sonra yeni bir kültür kabına geçirildi ve ardından kulla...

Bu çalışma, sinovyal makrofajları ve fibroblastları murin inflamatuar artrit dokusundan izole etmek için modifiye edilmiş bir protokol sunmaktadır.

Murin Artrit Dokusundan Primer Sinovyal Makrofaj ve Fibroblastların İzolasyonu ve Kültürü

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...

Moleküler fonksiyonları açıklığa kavuşturmak için hücre bazlı tahliller gereklidir. Artrit çalışmalarında, primer hücreleri izole etme yöntemi sinovyal fibroblastlarda iyi bilinmektedir, ancak sinovyal makrofajlarda değildir. Bu nedenle, artrit modellerinden hem sinovyal makrofajları hem de sinovyal fibroblastları izole etmek ve genişletmek için bir protokol geliştirdik.Murin artrit dokusundan primer sinovyal fibroblastlar, artrit patogenezinde moleküler mekanizmaların aydınlatılmasına katkıda bulunmuştur. Öte yandan, kemik iliği kaynaklı makrofajlar, kan monosit kaynaklı makrofajlar ve makrofaj hücre hatları, artrit çalışmaları için sıklıkla makrofaj kaynakları olarak kullanılmıştır. Makrofajlar mikroçevreleri ile ilişkili işlevler kazanabildiklerinden, genel makrofaj kaynakları artrit dokusuna özgü yanıtlardan yoksun olabilir.Ayrıca murin sinovyum artrit modellerinde bile çok küçük bir doku olduğu için sıralama ile yeterli sinovyal hücre elde etmek zordur. Sinovyal fibroblastları izole etmek için önceki yöntemde, sinovyal makrofajlar atılmıştı. Bunun yanı sıra, yerleşik makrofajları bazı organlardan izole etmek ve genişletmek için bir yöntem bildirilmiştir.Bu nedenle, murin artrit dokusundan hem sinovyal makrofajları hem de sinovyal fibroblastları izole etmek ve genişletmek için mevcut protokoller kombinasyon halinde değiştirildi. Bu yöntem hem makrofajları hem de fibroblastları inflamatuar sinovyumdan yüksek saflıkta izole edebilir ve basit ve tekrarlanabilir. Bu yöntem, sinovyal fibroblastlarla ko-kültür altında sinovyal makrofajların genişlemesine izin verir.Ayrıca, yöntem, sinovyal fibroblastların daha az geçişle kullanılabilmesi açısından bir avantaj sağlar. Oluşturulan protokol romatoid artritte patolojik mekanizmaların aydınlatılmasında avantaj sağlayacaktır.

isolation-culture-primary-synovial-macrophages-fibroblasts-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, farelerde otoimmün artrit için hücre bazlı bir tedaviyi göstermektedir. Ovalbümin spesifik reseptörlerini eksprese eden iPSC'den türetilmiş T düzenleyici hücrelere, bir adjuvan içinde emülsifiye edilmiş metillenmiş sığır serum albümini (mBSA) enjekte edilir. Murin antijen sunan hücreler (APC'ler) mBSA'yı işler ve T hücrelerine sunar, bu da T hücresi aktivasyonunu ve diz ekleminin sinovyal zarına göçü tetikler. Sonraki enjeksiyonlar sol dizde tek başına mBSA'yı ve sağ dizde mBSA ve...

Bir Murin Modelinde Otoimmün Artrit için Hücre Bazlı Bir Tedavi

Burada besleyici hücreler olmadan lentiviral sistemi kullanılarak, hastaya türetilmiş fibroblast benzeri sinoviyositler insan kaynaklı-pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.

Romatoid Artrit Hastalarının Mafsallar İzole fibroblast benzeri sinoviyosit kullanma Kaynaklı-pluripotent Kök Hücre Üretimi

Minipiglerin sinovyal sıvısı ve kemik iliğinden izole edilen ve şırınga aspirasyonu kullanılarak noninvaziv olarak toplanan mezenkimal kök hücreleri (MSC'ler) kuran bir protokol sunulmuştur. Hücresel fenotipleme, hücre izolasyonu ve MSC'lerden türetilen kemik iliği ve sinovyal sıvıların in vitro kültivasyonu sonrası akış sitometrisi kullanılarak gerçekleştirildi.

Mini-domuzlarda sinovyal sıvı ve Kemik İliği Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Hücresel Fenotiplendirme

Bu yazı basit yalıtım ve Yeni Zelanda beyaz tavşan synovial sıvı mezenkimal kök hücre arınma için basit ve ekonomik Protokolü sunar.

Manyetik aktif hücre stratejileri yalıtmak ve Sinovyal sıvı elde edilen mezenkimal kök hücre bir tavşan modelinden arındırmak için sıralama

Dokulardan çıkarılan RNA veya proteinin verimini ve kalitesini artırmak ve inflamatuar profillerle ilişkili moleküler profillerin analizini sağlamak için sıvı nitrojen dondurucu değirmeni kullanarak murine patilerini işlemek için kriyojenik pulverizasyon yöntemi geliştirilmiştir. Yanıt.

Kollajen Kaynaklı Artrit Modelinde Doku İltihabının Moleküler Yollarını Değerlendirmek Için Fare Patilerinin İşlenmesi için Kriyo-pulverizasyon Protokolü

Burada, murine dalak, kemik iliği, lenf düğümleri ve sinovyal doku içinde hem ekstra hem de hücre içi boyama tahlilleri kullanarak monosit/makrofaj ve T hücrealt kümelerini tanımlamak için ayrıntılı ve tekrarlanabilir akış sitometri protokolünü tanımladık ve murine osteoartritin yerleşik bir cerrahi modelini kullanıyoruz.

Bir Osteoartrit Modelinde Minör Dalak, Kemik İliği, Lenf Düğümleri ve Sinovyal DokuDaki İmmün Hücre Alt Kümelerinin Akış Sitometri Analizi

Sinovyumda akut iltihap, bulaşıcı ve yapısal değişiklikleri değerlendirebilen insan ex vivo transwell sistemi geliştirdik.

Korunmuş fonksiyon ve mimariyle ex vivo insan sinovyal dokusu kullanılarak sinovitin klinik öncesi modeli

Bu prosedür ya da spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar Corti fare organ izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. Ayrıca elektroporasyon Corti eksplant organ dışsal bir muhabir gen ifadesi için bir yöntem göstermektedir.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

İlköğretim hepatositler bir fizyolojik ilgili deneysel sistem biyokimyasal, moleküler ve metabolik fonksiyonlarını değerlendirmek için değerli bir araç sağlar. Biz sürekli to1.0 × 10 kadar yaşayabilir hepatositler üretir yerinde karaciğer perfüzyon, sıçan için güvenilir bir protokol...

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Bu yayında, böylece yalıtma ve sıçangil pankreas kültür birincil pankreatik acinar hücreleri için bir hızlı ve uygun bir prosedürü açıklar. Bu yöntem taze birincil dönüştürülmemiş / Normal ekzokrin pankreas hücrelerinin fizyolojisi incelemek için değerli bir yaklaşım oluşturmaktadır.

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Öğrenin, iltihaplı artrit dokusundan primer sinovyal makrofaj ve fibroblast izolasyonu için geliştirilmiş bu yöntemi. RTQ-PCR ile doğrulanan yüksek saflıkta hücreler, romatoid artrit patogenez mekanizmalarının araştırılmasına olanak tanır.

Murin Artrit Dokusundan Primer Sinovyal Makrofaj ve Fibroblastların İzolasyonu ve Kültürü

Daha fazla video keşfet