Name: Retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için metanol bazlı tam montajlı preparat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 47 s
Description: Öğrenin, retinal ganglion hücrelerini incelemek için metanol bazlı tam montajlı retina preparasyonu ve uzun süreli saklama yöntemini. Bu teknik, sinirsel hastalıkların mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Hubei Anahtar Laboratuvarları Açılış Projesi (hibe no. 2021KFY055), Hubei Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (hibe no. 2020CFB240) ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (hibe no. 2042020kf0065) tarafından finanse edilmiştir.

Aksi belirtilmedikçe tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Kullanılan tüm C57BL / 6J fareleri, Wuhan Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Merkezi'nden elde edildi ve ilgili tüm deneyler Wuhan Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etiği Komitesi tarafından onaylandı. Farelerin acısını en aza indirmek için tüm çabalar gösterildi.
1. Gözlerin enükleasyonu ve sabitlenmesi
<ol><li>Fareleri karbondioksit boğulması ile ötenazi yapın ve dişsiz cımbız kullanarak göz küresini nazikçe süklee edin.</li>
	<li>Göz küresini fosfat tamponlu salin (PBS) içinde bir kez durulayın.</li>
	<li>Göz küresine fiksasyonu hızlandırmak ve sabitleme verimliliğini artırmak için mikroskop altında korneada bir şırınga iğnesi ile göz küresini delin (göz merceği WF: 10x/22; sürekli büyütme hedefi: 0.67x-4.5x).</li>
	<li>% 4 paraformaldehit (PFA) içeren 24 delikli bir plakaya aktarın.</li>
	<li>Göz küresini 45 dakika boyunca% 4 PFA'ya sabitleyin ve ardından fazla PFA'yı hemen çıkarmak için 1x PBS'ye aktarın (üç kez, 5 dakika / zaman yıkayın).</li>
</ol>2. Retina izolasyonu ve düzleşmesi
<ol><li>Göz küresini bir cam slayta aktarın ve diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin (göz merceği WF: 10x/22; sürekli büyütme hedefi: 0.67x-4.5x).</li>
	<li>Forsepsleri bir elinizde tutun ve göz küresi hareketini önlemek için korneanın kenarını sıkıştırmak için kullanın. Diseksiyon makasını tutmak için diğer elinizi kullanın ve korneanın etrafını korneoskleral limbus boyunca yaklaşık 1 mm derinlikte kesin. Lensi ve vitreus gövdesini çıkarın.</li>
	<li>Optik diski merkezde tutun ve diseksiyon makası kullanarak, retinayı dört kadran boyunca radyal olarak kesin ve retinanın yarıçapının yaklaşık 2 / 3'üne ulaşın.</li>
	<li>Skleral kenarlardan birini dişli forseps kullanarak kelepçeleyin. Öte yandan, skleranın kenarını dişsiz forsepslerle tutun ve skleranın dişli forseps tarafından sabitlendiği yerden skleranın tabanına doğru hareket edin. Retinayı dikkatlice soyun.</li>
	<li>Retinayı yıkamak ve ıslatmak için bir pipet (200 μL) kullanarak PBS'yi çekin ve ardından fazla PBS'yi küçük bir emici kağıt parçasıyla çıkarın. Gerekirse, retinayı küçük kıllı bir fırçayla hafifçe düzleştirin.</li>
	<li>Yavaş yavaş pipet soğuk metanol (-20 ° C'lik bir dondurucuda önceden soğutulur) retinanın iç yüzeyine damla damla düşer (retina metanol tarafından tamamen kaplanabildiği sürece metanol hacmi sabit değildir). Retina beyaza döner ve artan azim geliştirir.</li>
	<li>Retinayı nazikçe düzleştirin ve artık pigment zarları ve vitreus gövdesi gibi safsızlıkları küçük kıllı fırçalarla temizleyin. Küçük kıllı fırçalar kullanarak retinayı ters çevirin ve yukarıda belirtilen işlemi tekrarlayın.</li>
	<li>Metanol ile muamele edilmiş retinayı 24 delikli bir plakanın kuyucuğuna aktarın ve metanole batırılmış halde tutun.</li>
	<li>Acil immün boyama için 1-2 saat boyunca -20 ° C'de saklayın veya retinayı metanol içinde bırakın ve uzun süreli depolama için -20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Metanolü 24 delikli plakadan çıkarın ve retinayı 1x PBS ile durulayın.</li>
</ol>3. RGC'lerin immünofloresan boyanması
<ol><li>Retinayı plastik bir Pasteur pipet ile 24 delikli bir hemaglutinasyon plakasına dikkatlice aktarın ve% 5 PBS-TX-BSA'da (100 mL 1x PBST çözeltisi içinde çözülmüş 5 g sığır serum albümin tozu; PBST, oda sıcaklığında 4 saat veya 4 ° C'de bir gecede 10 mL Triton X-100 ila 2.000 mL 1 x PBS ilave edilerek oluşturulur. Ganglion tarafını yukarıda tutun.</li>
	<li>PBS-TX-BSA'yı çıkarın ve retinayı 48-96 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin, 1:400 seyreltme kullanarak seçilen birincil antikorun (kobay anti-RBPMS antikoru) 100 μL'sini ekleyin.</li>
	<li>Birincil antikoru çıkarın ve retinayı 1x PBS ile üç kez (her biri 20 dakika) durulayın, oda sıcaklığında çalkalayın.</li>
	<li>Retinayı, karşılık gelen ikincil antikorun 100 μL'si (bakınız Malzeme Tablosu), siyanin Cy3 affiniPure eşek anti-gine domuzu IgG (H + L) ile 1:400 seyreltme kullanarak gece boyunca 4 ° C'de hafifçe sallayarak inkübe edin.</li>
	<li>Retinayı 1x PBS ile üç kez durulayın (her biri 20 dakika).</li>
	<li>Retinayı, ganglion hücre tabakası yukarı bakacak şekilde slayt üzerine düz bir şekilde yerleştirin, retinanın etrafına bir pipetle uygun miktarda anti-floresan söndürme maddesi bırakın ve slaytı bir kapak kayması ile örtün (kabarcıklara sahip olmamaya dikkat edin). NOT: Uygun miktarda anti floresan söndürücüyü belirlemek için, tüm retinayı kapladığından emin olun. Bundan sonra, retinanın yüzmesine ve kolayca hareket etmesine izin vermeden slaytı örtün.</li>
	<li>Hareket etmesini önlemek için slaytın her tarafını bir sızdırmazlık maddesi ile kapatın. Numuneleri -20°C'de saklayın ve ışıktan koruyun.</li>
	<li>Retinayı floresan / konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin.</li>
</ol>

Retinal Ganglion Hücrelerini İncelemek için Fare Retina İzolasyonu ve Metanol Tedavisi

<ol><li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+types+of+retinal+ganglion+cells%3A+Current+status+and+implications+for+neuronal+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li>
<li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).</li>
<li>Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%2C+microglia+and+implications+for+retinal+ganglion+cell+survival+and+axon+regeneration+in+traumatic+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy.</a> Frontiers in Immunology. 13, 860070(2022).</li>
<li>Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cells+resistant+to+advanced+glaucoma%3A+A+postmortem+study+of+human+retinas+with+the+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).</li>
<li>Vidal-Sanz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+glaucomatous+damage%3A+anatomical+and+functional+data+from+ocular+hypertensive+rodent+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).</li>
<li>Kole, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+transcription+factor+3+%28ATF3%29+protects+retinal+ganglion+cells+and+promotes+functional+preservation+after+optic+nerve+crush%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31(2020).</li>
<li>Nadal-Nicolás, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells%3A+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).</li>
<li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+protein+with+multiple+splicing%3A+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li>
<li>Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+strategies+for+retinal+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Fixation strategies for retinal immunohistochemistry.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).</li>
<li>Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moniliform+deformation+of+retinal+ganglion+cells+by+formaldehyde-based+fixatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).</li>
<li>Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+methods+for+three-dimensional+reconstructions+from+confocal+images%3A+I.+Tissue+shrinking+and+axial+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).</li>
<li>Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+a+wide-ranging+panel+of+antigens+in+the+rat+retina+by+immunohistochemistry%3A+Comparison+of+Davidson%27s+solution+and+formalin+as+fixatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).</li>
<li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology%3A+A+comparison+with+Davidson%27s+fixative+and+other+fixation+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li>
<li>Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+fixation+of+the+whole+bodies+of+fish+by+a+double-fixation+method+with+formalin+solution+and+Bouin%27s+fluid+or+Davidson%27s+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).</li>
<li>Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+commercial+and+three+home-made+fixatives+for+the+substitution+of+formalin%3A+A+formaldehyde-free+laboratory+is+possible%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible.</a> Environmental Health. 11, 59(2012).</li>
<li>Tang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+to+visualize+the+goblet+cell-associated+antigen+passages+and+identify+goblet+cells+in+the+intestine%2C+conjunctiva%2C+and+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway.</a> Immunobiology. 227 (6), 152260(2022).</li>
<li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li>
<li>Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+post-fixation+on+visualising+vimentin+in+the+retina+using+immunofluorescence+method%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Morphologica%22%5BJournal%5D)">The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method.</a> Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).</li>
<li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li>
<li>Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+methanol+to+preserve+retinas+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Using methanol to preserve retinas for immunostaining.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).</li>
<li>Kalesnykas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+morphology+after+optic+nerve+crush+and+experimental+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).</li>
<li>Parrilla-Reverter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+of+the+retinal+nerve+fibre+layer+degeneration+after+complete+intra-orbital+optic+nerve+transection+or+crush%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study.</a> Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar, bu çalışmanın nesnelliğini etkileyebilecek herhangi bir bağlantı, üyelik, fon veya finansal varlığın farkında değildir.

Fiksasyon, retinayı korumak için önemli bir adımdır ve morfolojiye dayalı sonraki RGC araştırmalarını etkileyebilir. Başarılı fiksasyon, retinaların yapısını ve durumunu, daha fazla analiz için kritik olan sabitleme ortamına maruz bıraktıkları anda hızla yakalar. Formaldehit, doku ve hücre fiksasyonu ve korunması için en yaygın sabitleme ajanlarından biri olarak kabul edilmesine rağmen, formaldehit tek başına bazı araştırmalar için en uygun kimyasal fiksatif olarak her zaman iyi çalışmaz10,14...

Retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) retinadaki tek projeksiyon nöronlarıdır ve dış görsel bilgileri beyne entegre eder ve iletirler1. Glokom ve travmatik optik nöropati gibi birçok nörodejeneratif hastalık, geri dönüşümsüz hasar ve RGC 2,3 kaybı ile karakterizedir. RGC'lerin morfolojik ve kantitatif değişikliklerinin analiz edilmesi, nörodejeneratif hastalıkların nasıl geliştiğini ve ilerlediğini belirlemede çok önemli bir adımdır 4,5.
Dolaylı immünofloresan testi, proteinlerin dağılımını ve hücre sayımını izlemek için yaygın olarak kabul edilen bir yöntemdir. Laboratuvarda, retina6'nın fizyolojik ve patolojik koşullarını değerlendirmek için RGC'ler üzerinde yapılan deneysel çalışmalarda tam montajlı retinal immünoboyama yaygın olarak kullanılmaktadır. Tüm retinada RGC nicelleştirmesi için kullanılan en yaygın belirteçler arasında Brn3a, çoklu ekleme (RBPMS) ile RNA bağlayıcı protein ve benzeri 7,8 bulunur. RGC'lerin miktarını ve dağılımını karakterize etmek, yüksek kaliteli tam montajlı retinal immün boyama gerektirir. Genel olarak, immün boyama protokollerinde, retina antikorlarda inkübe edilmeden önce kimyasal fiksatiflere daldırılır. İdeal fiksatifler, hücrelerin şeklini, antikorlar için epitopların erişilebilirliğini veya afinitesini veya 9,10 dokusunun doğrusal boyutlarını değiştirmemelidir.
Retinanın karmaşık yapısı nedeniyle, retina kırılganlığı ve katlanması gibi sorunların yanı sıra hücre büzülmesi ve belirsiz çekirdekler gibi bazı yaygın zorluklar, deneysel araştırmalar üzerinde olumsuz bir etkisi olan tam montajlı retina yaması yaparken ortaya çıkmaya eğilimlidir. Ek olarak, tüm retinalar hemen immün boyanmaz, özellikle de değerli kökenli pahalı fiyatlara sahip transgenik farelerin retinaları söz konusu olduğunda, ekstra retinal örneklerin daha fazla kullanım için korunmasını gerektirir.
Uygun fiksatif çözelti dokuyu hızlı bir şekilde düzeltebilir, doku otolizini önleyebilir, doku hücrelerinin normal morfolojisini ve yapısını koruyabilir ve proteinlerin ve diğer maddelerin antijenitesini koruyabilir10. Günümüzde, formaldehit bazlı fiksasyon, ayrılmış retinalar, hemiseke edilmiş göz kapakları ve tüm göz küreleri dahil olmak üzere çeşitli dokularda yaygın olarak kullanılmaktadır10. Doku büzülmesi ve hücrelerin morfolojik değişimi, formaldehit11'e daldırıldıktan sonra karşılaşılan iki kritik zorluktur. Ek olarak, modifiye fiksasyon formülasyonları, retinanın ve hedef hücrelerin orijinal özelliklerinin korunmasını en üst düzeye çıkarmak için giderek daha fazla ortaya çıkmaktadır 9,10. Farklı retina fiksasyon tedavileri retina yapısını, protein immünojenitesini, floresan uyarımını ve zayıflama söndürme döngüsünü farklı şekilde etkileyebilir12,13. Davidson'un çözeltisi ile sabitlenmiş retinalar, formalin ile sabitlenenlere kıyasla morfolojik olarak daha sağlamdır, ancak Davidson'un çözeltisi, mikroglial marker-iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 112 gibi bazı antikorlarla daha az uyumludur. Retinaların kırılgan doğası göz önüne alındığında, araştırmacılar doğal olarak retina bütünlüğünün yanı sıra hedef hücrelerin özelliklerinin ve morfolojisinin uzun süreli depolamadan sonra değişip değişmeyeceğini merak edeceklerdir. Bununla birlikte, fiksasyon solüsyonunun birkaç ay bekletildikten sonra retina ve RGC hücre morfolojisi üzerindeki olası etkileri nadiren bildirilmiştir. Retina fiksasyonunun optimizasyonu, RGC'lerin değerlendirilmesi ve korunması için kritik öneme sahiptir.
Tüm montajlı murin retinal boyama için kullandığımız güvenilir ve teknik olarak basit bir yöntemin ayrıntılı bir tanımını sunuyoruz. Yöntemimiz, retina dokusunun uzun süreli depolanması ihtiyacının yanı sıra florofor oluşumu veya bozulmasının spesifik yönlerini göz önünde bulundurarak, RGC araştırması için retinaların uygun şekilde hazırlanmasını ve depolanmasını vurgulamaktadır.

<table><tbody><tr><td>24 oyuklu hücre kültürü kümesi</td><td>Costar</td><td></td><td>Göz küresi fiksasyonu</td></tr><tr><td>24 oyuklu hemaglutinasyon plakası</td><td>Labedit Şirketi</td><td></td><td>Kuluçka antikoru</td></tr><tr><td>Yapışma mikroskobu slaytları</td><td>Citotest</td><td></td><td>Veya benzeri</td></tr><tr><td>Anti-floresan söndürme mountant</td><td>Servicebio</td><td>G1401</td><td>Floresan söndürme</td></tr><tr><td>BSA'yı (sığır serum albümini) yavaşlatın</td><td>Servicebio</td><td>GC305010</td><td>Engelleme reaktifi</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>OLYMPUS</td><td></td><td>40x objektif lens uygula</td></tr><tr><td>Kavisli makas</td><td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td><td></td><td>Diseksiyon araçları</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>RWD Life science Co., LTD&nbsp;</td><td>77001S</td><td>Diseksiyon araçları</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td><td></td><td>Diseksiyon araçları</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd.</td><td>20210624</td><td>GC&ge; % 99,5</td></tr> <tr><td>Oje</td><td>SecheVite</td><td></td><td>Sızdırmazlık maddesi</td></tr><tr><td>İğneler&nbsp;</td><td>Şangay Nazik İşletmeler Geliştirme Group Co., Ltd.</td><td></td><td>Fiksasyonu hızlandırın</td></tr><tr><td>Paraformaldehit çözeltisi</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td>Göz küresi fiksasyonu</td></tr><tr><td>PBS (fosfat tamponlu tuzlu su pH 7.4)</td><td>Servicebio</td><td>G0002</td><td>Göz küresini durulayın&nbsp;</td></tr><tr><td>Birincil antikor: çoklu uçbirleştirme (RBPMS) ile kobay anti-RNA bağlayıcı</td> <td>proteinFosfoÇözeltiler</td><td>Kat. # 1832-RBPMS</td><td>İmmünofloresan için. 1:400'de kullanılır</td></tr><tr><td>İkincil antikor: Cy3 affiniSaf eşek anti-kobay IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-165-148</td><td>İmmünofloresan için. 1:400</td></tr><tr><td>Düz makasta</td> kullanılır <td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td><td></td><td>Diseksiyon araçları</td></tr></tbody></table>

retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için metanol bazlı tam montajlı preparat

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinanın projeksiyon nöronları olan retinal ganglion hücreleri (RGC'ler), dış görsel bilgiyi beyne yayar. RGC'lerdeki patolojik değişiklikler çok sayıda retinal dejeneratif hastalık ile yakın ilişki içindedir. Tam montajlı retinal immün boyama, retinanın gelişimsel ve patolojik durumlarını değerlendirmek için RGC'ler üzerine yapılan deneysel çalışmalarda sıklıkla kullanılmaktadır. Bazı koşullar altında, transgenik farelerden alınanlar gibi bazı değerli retina örneklerinin, RGC'lerin morfolojisini veya sayısını etkilemeden uzun süre tutulması gerekebilir. Güvenilir ve tekrarlanabilir deneysel sonuçlar için, etkili bir koruma ortamı kullanmak esastır. Burada, metanolün retinal tüm montaj preparatları ve uzun süreli depolama için yardımcı bir sabit ortam olarak etkisini açıklıyoruz. Kısacası, izolasyon işlemi sırasında, dokuların sabitlenmesine ve geçirgenliklerinin kolaylaştırılmasına yardımcı olmak için retina yüzeyine soğuk metanol (-20 ° C) pipetlenir ve daha sonra retinalar immün boyanmadan önce soğuk metanol (-20 ° C) içinde saklanabilir. Bu protokol, RGC'lerin araştırılması için yararlı ve pratik olan retina izolasyon iş akışını ve doku örneği depolama protokolünü açıklar.

Diseksiyondan sonra, retina düz dört yapraklı bir yonca gibi görünmelidir. Bu çalışmada, yukarıda özetlenen protokol kullanılarak, metanol eklendikten sonra retina beyaza dönmüştür (Şekil 1). Bu arada, retina yumuşaktan esnek ve düze değişti. Daha sonra, RGC'ler anti-RBPMS8 ile etiketlendi. Konfokal mikroskop (göz merceği: 10x; objektif: 40x) kullanılarak tüm montajlı retinada (n = 3) dört görüntü alanı alındı. Metanol işlenmeden önce ve metanolde 12 aylık uzun süreli...

Metanol, retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için yararlı olan retinal tüm montaj preparatları ve uzun süreli depolama için yardımcı bir sabit ortam olarak kullanılabilir.

Retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için metanol bazlı tam montajlı preparat

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Araştırma, RGC'leri araştırmak için yararlı ve pratik olan modifiye edilmiş bir retina izolasyon iş akışı ve doku örneği depolama protokolü sağlamayı amaçlamaktadır. retinalar kırılgan ve katlanır, bu da tam montajlı retinal yama yaparken deneysel araştırmaları sınırlar. Ek olarak, tüm retinalar acil immünoboya gerektirmez.Bazen, ekstra retina örneklerinin daha fazla kullanım için korunması gerekir. RGC araştırması için retinaların uygun şekilde hazırlanmasını ve uzun süreli depolanması ihtiyacını vurgulayan güvenilir ve teknik olarak basit bir tam montajlı retina lekesi yönteminin ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Dejeneratif optik nöropatilerin temel araştırmaları üzerinde çalışmaya devam edeceğiz.Ayrıca, optik sinir hasarı ve kaza rejenerasyonunun moleküler mekanizması ve nörodejeneratif hastalığın tanı ve tedavisi için potansiyel klinik hedefler araştırılacaktır.

methanol-based-whole-mount-preparation-for-investigation-retinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu makale, fare izole retinal hazırlanması incelemek ve kaydetmek için nasıl bir açıklama sağlar. Özellikle, floresan etiketli ganglion hücre popülasyonu ışık yanıtlarını kaydetmek ve daha sonra belirlemek ve morfolojisi analiz nasıl açıklar.

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

Kaynak: Laboissonniere, et. al. Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seq'i. J. Vis. Uzm.  (2017).  Bu video, transgenik bir fare retinasındaki retinal ganglion hücresi (RGC) alt tiplerini tanımlamak için bir floresan izleme tekniğini göstermektedir. İşlem, izole retinanın bir kayıt odasında sabitlenmesini, oksijenli perfüzyon ile hücre canlılığının korunmasını ve izleyicili bir pipet kullanılarak floresan olarak etiketlenmiş RGC'lerin hedeflenmesini içerir.

Fare Retinal Ganglion Hücre Alt Tiplerinin Floresan İzleme ile Tanımlanması

Bu video makalede hücre gövdeleri yama kurulum, usul ve nasıl tüm montaj fare retinae ganglion hücrelerinden dinamik kelepçe kayıtları uygulamaya göstermektedir. Bu teknik, eksitatör ve inhibitör sinaptik girdi kesin katkısının incelenmesi ve nöronal spike için göreceli büyüklüğü ve zamanlaması sağlar.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Yenidoğan fare retina bir anjiyogenez modüle farklı genler ya da uyuşturucu rolleri soruşturma izin anjiyogenez bir iyi karakterize fizyolojik modeli...

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

Burada açıklanan protokol, tam montajlı bir retinal preparatın yapısal değerlendirmesi içindir. Bu, doku diseksiyonunun tanımlarını, hidrofilize politetrafloroetilen (PTFE) membran ekine montajı, floresan işaretleyicilerle bolus yüklemesini ve hücresel ve sinaptik bileşenlerin immünohistokimyasal analizi için karbodiimid ve paraformaldehit ile fiksasyonun karşılaştırılmasını içerir.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

İmmünohistokimya protokolleri retinada, spesifik bir proteinin lokalizasyonu incelemek için kullanılır. Kalsiyum görüntüleme teknikleri retina ganglion hücrelerinin ve bunların akson kalsiyum dinamiklerini incelemek için istihdam edilmektedir.

Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri

Burada, nöronal hücre tiplerinin izolasyondan önce sınıflandırılması ve ardından tek hücreli transkriptomların karakterizasyonu için kombinatoryal bir yaklaşım sunuyoruz. Bu protokol, başarılı RNA Sequencing (RNA-Seq) için numunelerin hazırlanmasını optimize eder ve özellikle hücresel çeşitliliğin daha iyi anlaşılması için tasarlanmış bir metodoloji tanımlar.

Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seqi

Bu protokol, retinadaki sinaptik devreleri ve protein lokalizasyonunu keşfetmeye odaklanarak, önceden gömülü immünoelektron mikroskobunun ayrıntılı adımlarını ana hatlarıyla belirtir.

İmmünoelektron Mikroskobunun Önceden Gömülmesi ile Retina Devrelerinin ve Moleküler Lokalizasyonun İncelenmesi

Bu protokol, tüm retina montajlı fare retinasını izole etme ve tüm retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) etiketlemek için immün boyama gerçekleştirme prosedürünü açıklar. İşlemi, yapay zeka tabanlı yazılım kullanılarak RGC'lerin görüntülenmesi ve otomatik olarak sayılması takip eder ve bu da tüm fare retinasındaki RGC'leri ölçmek için basit, hızlı ve doğru bir yöntem sağlar.

Tam montajlı immün boyama ve fare retinal ganglion hücrelerinin otomatik sayımı

Retina, laminer yapısı boyunca karmaşık uzamsal organizasyon sergiler. Modern mekansal transkriptomik ve dizileme teknikleri, 20 μm kalınlığında doku kesitleri &lt; gerektirir ve bu da retinal araştırma uygulanabilirliklerini sınırlar. Bu taze dondurulmuş kriyoseksiyon yöntemi, düzlemsel uzamsal ilişkileri korurken fare retinasının ince yüz kesitlerini üretir ve laminalar arasında kapsamlı moleküler haritalama sağlar.

En yüz Yüksek Boyutlu Mekansal Moleküler Analiz için Fare Retinasının Kriyoseksiyonu

Burada, NMDA kaynaklı eksitotoksisite altında fare retinalarının anatomik özelliklerini ve fenotiplerini araştırmak için genetik olarak yönlendirilmiş bir alkalin fosfataz (AP) etiketleme yönteminin kullanımını açıklıyoruz. Birkaç retinal ganglion hücresi (RGC) alt tipine özgü raportör hattı ile birlikte, dejeneratif süreç boyunca ölmekte olan RGC'lerde yeni fenotipleri ortaya çıkarıyoruz.

Retinal Ganglion Hücrelerinin Anatomik Özelliklerinin N-metil-D-aspartik Asit (NMDA) ile İndüklenen Eksitotoksisite Altında İncelenmesi

Öğrenin, retinal ganglion hücrelerini incelemek için metanol bazlı tam montajlı retina preparasyonu ve uzun süreli saklama yöntemini. Bu teknik, sinirsel hastalıkların mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için metanol bazlı tam montajlı preparat

Daha fazla video keşfet