Name: Sığır Hepatik Hücrelerinde Lipid Damlacık Büyüklüğü ve Füzyonunun Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Öğrenin, sığır hepatik hücrelerinde lipid damlacığı boyutu ve füzyonunu Oil Red O boyama ve canlı hücre görüntüleme ile nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu yöntem, yağlı karaciğer hastalığı mekanizmalarını anlamak için kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (U1904116) tarafından ortaklaşa desteklenmiştir.

Tüm prosedürler Henan Tarım Üniversitesi (Henan Eyaleti, Çin) Hayvan Bakım Komitesi'nin etik standartlarına uygun olarak onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir.
1. Sığır hepatosit hücre kültürü
<ol><li>Birincil hepatosit hücreleri17'yi çözün ve oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 400 x g santrifüj yapın. NOT: Primer hepatosit hücreleri kültürlendi ve daha önce yayınlanmış bir rapor17'yi takiben muhafaza edildi.</li>
	<li>Dondurulmuş depolama solüsyonunu bir pipetle atın ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) içeren 1 mL ortam ile askıya alın. Ardından, mililitre başına hücre sayısını hesaplamak için bir hücre sayma odası kullanın ve ardından yukarıdaki hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu hesaplayın ve hücre konsantrasyonunu 1 x 107 hücre / mL'ye ayarlayın.<ol><li>Hücre süspansiyonunu, yukarıdaki ortamın 3 mL'sini içeren 60 mm'lik bir hücre kültürü kabına ekleyin. Hücreleri kültürleyin ve 24 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreler% 80'e büyüdüğünde, ortamı atın ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın, ardından hücreleri sindirmek için 750 μL% 0.25 tripsin ekleyin. Hücreleri 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin, ardından aynı miktarda% 10 FBS ile nötralize edin. Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapmak için hücre süspansiyonunu toplayın.</li>
</ol>2. Yağ kırmızısı O boyama
<ol><li>Cam kapaklar içeren 24 delikli hücre kültür plakasının her bir kuyucuğuna %10 FBS ve DMEM içeren 800 μL kültür ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunun 50 μL'sini alın (adım 1.3'te elde edilen) ve karıştırmak için 950 μL PBS'ye ekleyin. Mililitre başına hücre sayısını hesaplamak için bir hücre sayma odası kullanın ve ardından yukarıdaki hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu hesaplayın. Son olarak, hücre konsantrasyonunu her bir kuyucukta 4 x 104 / mL'ye ayarlayın ve 24 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.</li>
	<li>24 saat sonra, kültür ortamını atın ve PBS ile yıkayın. 1 mg/mL sığır serum albümini (BSA) içeren 800 μL DMEM indüksiyon ortamı ile askıya alın.</li>
	<li>Toplam 100 μL LA'yı 900 μL susuz etanol içinde çözün ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve standart bir çözelti (100 mmol / L) hazırlayın. 24 delikli plakaya 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L ve 200 μmol/L LA gradyanı ekleyin. Her tedaviyi dört kez tekrarlayın. 24 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.</li>
	<li>Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. 20 dakika boyunca 400 μL% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Fiksatif çözeltiyi atın ve PBS ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri 5 dakika boyunca% 60 izopropil alkol ile inkübe edin, sonra atın. Taze hazırlanmış yağ kırmızısı O çalışma solüsyonunu ( bakınız Malzeme Tablosu) (3:2 yağ kırmızısı O:su oranı) 20-30 dakika boyunca ekleyin ve boyama solüsyonunu atın. Fazla boya çözeltisi kalmayana kadar hücreleri PBS ile iki ila beş kez yıkayın.</li>
	<li>300 μL hematoksilin boyama çözeltisi ekleyin (hematoksilin: 1:10 su oranı) ve çekirdeği 1-2 dakika boyunca yeniden boyayın. Boya çözeltisini atın ve hücreleri PBS ile iki ila beş kez yıkayın. Cam kapak kapaklarını 24 delikli plakadan çıkarın ve slaytın üzerine 10 μL tablet sızdırmazlık maddesi (bkz.</li>
	<li>Sızdırmazlıktan sonra, optik mikroskobun yağ merceği altındaki hücrelerin LD'lerini gözlemleyin ve görüntüleyin (bkz. LD'lerin çapını cellSens yazılımı ile ölçün ve LD'lerin sayısını ve boyutunu analiz edin.</li>
</ol>3. LD'lerin boyutunun ve sayısının ölçülmesi
<ol><li>Görüntü yakalama: Bilgisayarı ve mikroskop anahtarını art arda açın, slaytı yükleme platformuna yerleştirin, görüntü analiz yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu) ve görüntüyü görüntülemek için bilgisayarı bağlayın.<ol><li>Görüntüleri düşük güçte bulun ve görüntüleme slaytına uygun miktarda sedir yağı damlatın. Gözlem faktörünü 100x'e ayarlayın, otomatik pozlamayı ayarlayın ve uygun görüş alanını ayarlayarak görüntüleri yakalayın. Görüntüleme için her grup için üç boyalı hücre slaytı seçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Çap ölçümü: Çapları ölçmek için her görüntü için rastgele 60 LD seçin. Her görüntünün ölçümünden sonra, görüntüleri kaydedin ve LD'lerin ortalama boyutunun ve dağılım oranının daha sonraki analizi için ölçüm sonuçlarını bir tabloya çıkarın.</li>
	<li>Miktar ölçümü: Her boyanmış ve fotoğraflanmış slayt için üç görüntü seçin ve her resimde miktar ölçümü için rastgele üç hücre seçin. Hücrenin etrafındaki LD sayısını sayıp analiz edin ve hücredeki ortalama LD sayısını hesaplayın.</li>
</ol>4. LD füzyonunun dinamik gözlemi
<ol><li>Adım 1.1-1.3'te belirtilen hücre kültürü adımlarını izleyin. Hücreler% 80'e kadar büyüdüğünde, ortamı atın ve PBS ile durulayın, ardından 3 dakika boyunca 750 μL tripsin ile sindirin. Daha sonra, 750 μL ortam ekleyin, oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
	<li>Hücreleri 1 mL kültür ortamında askıya alın, sayın ve hücre konsantrasyonunu 35 mm'lik bir tabakta 5 x 105 hücre / mL'ye ayarlayın. 37 °C'de kültür ve 24 saat boyunca %5 CO2 .</li>
	<li>Hücreler% 80'e büyüdüğünde, ortamı 24 saat boyunca DMEM + 150 μmol / L LA olarak değiştirin ve LD'leri biriktirmek için kültüre 37 ° C'de ve% 5 CO2'de bir inkübatörde devam edin.</li>
	<li>24 saat sonra, kültür ortamını çıkarın. Yapışkan hücreleri PBS ile yıkayın ve karanlıkta 30 dakika boyunca 10 μg / mL BODIPY 493/503 nötr floresan probu (bkz. Kuluçkadan sonra, kültür kabındaki hücreleri PBS ile üç kez yıkayın ve DMEM + 150 μmol / L LA ekleyin. NOT: 10 μg/mL BODIPY boyama sırasında ve sonrasında ışığa maruz kalmaktan kaçının; 1 mg/mL BODIPY PBS (1:100) ile seyreltildi.</li>
	<li>LD'lerin dinamik değişikliklerini gözlemlemek için kültür kabını canlı hücre istasyonunun mikroskobunun oluğuna yerleştirin (bkz.<ol><li>Güç, iletim ışık kaynağı, mikroskop güç kaynağı, cıva lambası floresan ışık kaynağı, şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamera güç kaynağı, bilgisayar ana bilgisayar güç kaynağı, CO 2 valfi ve CO2 inkübatörünü açın.</li>
	</ol></li>
	<li>Yükleme platformundaki oluğa damıtılmış su ekleyerek havalandırma deliğinden geçmediğinizden emin olun.</li>
	<li>Bilgisayarı açın ve "NIS-Elements" ı çalıştırın. İlk olarak, 4x objektif lenste uygun görüş alanını bulun, ardından art arda 40x objektif lense ayarlayın. Örneği mikroskopta gözlemlemek için E100'ü ve örneği bilgisayarda önizlemek ve fotoğraflamak için L100'ü seçin. NOT: E100 ve L100, canlı hücre iş istasyonundaki mikroskop ayar düğmeleridir (bkz. Malzeme Tablosu), sırasıyla göz merceğini ve bilgisayar ekranını temsil eder.</li>
	<li>Floresan kanalı (örneğin, Ph-40x, Floresein izotiyosiyanat [FITC], deklanşör) ve deney için beklenen çekim süresi gibi parametreleri tasarlayın. Her iki görüntü arasındaki 5 dakikalık çekim aralığı ve toplam 6 saatlik çekim süresi dahil olmak üzere çekim süresini zamanında ayarlayın. NOT: Uzun süreli çekimlerde mükemmel netleme sistemi (PFS) netleme sabitleme işlevinin kullanılması gerekir. Bunun için önce görüş alanını ve netleme uzunluğunu ayarlayın, ardından bilgisayar ekranında PFS'ye tıklayın ve son olarak ince netleme spiralini ayarlayın.</li>
	<li>Farklı kanal modları, tek kanal veya tümü seçin, farklı bir görüş alanı seçin, önizleme'yi tıklayın, görüş alanını ayarlayın, bu parametreleri ayarlayın ve çekime başlamak için koşmaya başla'yı tıklayın. Önce 5 dakika boyunca bir test çekimi yapın; Operasyon normal olduktan sonra uzun zaman alabilir.</li>
	<li>Çekim gerçekleştirildikten sonra, verileri 'avi' formatında bir videoya dışa aktarmak için Dosya > Farklı Kaydet > Kaydet türü > avi formatını seçin. Veri programını kaydetmek ve fotoğrafları dışa aktarmak için '.nd2' görüntü biçimini kullanın.</li>
	<li>Makineyi kapatmak için, ters sırada kapatın.</li>
</ol>5. İstatistik ve sonuç analizi
<ol><li>Tek yönlü ANOVA kullanarak verileri analiz edin. Sonuçları ortalama ± standart hata olarak raporlayın.</li>
</ol>

Lipid Damlacık Boyutu ve Füzyonunun Oil Red O ve BODIPY Kullanılarak Canlı Hücre Görüntülemesi

<ol><li>Fujimoto, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+just+fat%3A+the+structure+and+function+of+the+lipid+droplet%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Not just fat: the structure and function of the lipid droplet.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838(2011).</li>
<li>Grasselli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+potential+translational+value%3A+The+effects+of+3%2C5-L-diiodothyronine%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine.</a> Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).</li>
<li>Herdt, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruminant+adaptation+to+negative+energy+balance%3A+Influences+on+the+etiology+of+ketosis+and+fatty+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinics+of+North+America%3A+Food+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).</li>
<li>Pino-de la Fuente, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+regulation+of+hepatic+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism.</a> Life Sciences. 298, 120522(2022).</li>
<li>O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mega-stokes+pyrene+ceramide+conjugates+for+STED+imaging+of+lipid+droplets+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells.</a> Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).</li>
<li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lipid+droplet+fusion+and+growth+by+CIDE+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29.+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).</li>
<li>Tütüncü Konyar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+insoluble+polysaccharides+and+neutral+lipids+in+the+developing+anthers+of+an+endangered+plant+species%2C+Pancratium+maritimum%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Systematics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum.</a> Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).</li>
<li>Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+BODIPY+%28493%2F503%29+to+visualize+intramuscular+lipid+droplets+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358(2011).</li>
<li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+neutral+lipids+by+oil+red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).</li>
<li>Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+characterization+of+intracellular+lipids+in+situ+by+Nile+Red+red%2Fyellow+emission+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio.</a> Micron. 39 (7), 819-824 (2008).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+of+polarity-sensitive+fluorescent+dyes+based+on+the+BODIPY+chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22Dyes+and+Pigments%22%5BJournal%5D)">The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore.</a> Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).</li>
<li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42(2015).</li>
<li>Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+fluorescent+probes+for+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets.</a> Materials. 11 (9), 1768(2018).</li>
<li>Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, É <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diseases%2C+reproductive+performance%2C+and+changes+in+milk+production+associated+with+subclinical+ketosis+in+dairy+cows%3A+A+meta-analysis+and+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review.</a> Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).</li>
<li>Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+elevated+nonesterified+fatty+acids+and+%CE%B2-hydroxybutyrate+concentrations+with+early+lactation+reproductive+performance+and+milk+production+in+transition+dairy+cattle+in+the+northeastern+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States.</a> Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).</li>
<li>Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+experimental+steatosis+in+vitro%3A+hepatocyte+cell+culture+in+lipid+overload-conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62543(2021).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nonesterified+fatty+acids+on+the+synthesis+and+assembly+of+very+low+density+lipoprotein+in+bovine+hepatocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro.</a> Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).</li>
<li>Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+and+their+interactions+with+other+organelles+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937(2021).</li>
<li>Sanjabi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+hypertrophy%3A+a+crucial+determining+factor+in+insulin+regulation+by+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes.</a> Scientific Reports. 5, 8816(2015).</li>
<li>Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subtle+balance+between+lipolysis+and+lipogenesis%3A+a+critical+point+in+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis.</a> Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).</li>
<li>Yang, A., Mottillo, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+lipolysis%3A+from+molecular+mechanisms+of+regulation+to+disease+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics.</a> Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).</li>
<li>Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+and+liver+disease%3A+from+basic+biology+to+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).</li>
<li>Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+myocellular+fat+stores%3A+lipid+droplet+dynamics+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).</li>
<li>Sarnyai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cis-and+trans-monounsaturated+fatty+acids+on+palmitate+toxicity+and+on+palmitate-induced+accumulation+of+ceramides+and+diglycerides%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626(2020).</li>
<li>Ricchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+lipid+accumulation+and+apoptosis+in+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).</li>
<li>Fei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+phosphatidic+acid+in+the+formation+of+%26%2334%3Bsupersized%26%2334%3B+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A role for phosphatidic acid in the formation of &#34;supersized&#34; lipid droplets.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002201(2011).</li>
<li>Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BODIPY-based+probes+for+the+fluorescence+imaging+of+biomolecules+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+fluorescent+dye+BODIPY+in+the+study+of+lipid+dynamics+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Molecules. 23 (7), 1594(2018).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Patolojik durumlara bağlı olarak, hepatik LD'ler boyutlarında ve sayılarında muazzam değişikliklere uğrarlar. LD'ler hepatosit hücrelerinde yaygın olarak bulunur ve karaciğer sağlığı ve hastalığında önemli bir rol oynar18. LD'lerin miktarı ve büyüklüğü, LD'lerin biyogenezi üzerine yapılan güncel araştırmaların temelidir19. Hücreler ve dokular için LD'lerin büyüklüğü ve sayısı, enerji depolama ve serbest bırakma yeteneklerini yansıtır. LD'lerin dinamik değişiklikleri lipid m...

Hepatositlerde lipid damlacığı (LD) birikimi, karaciğer fibrozisi ve hepatosellüler karsinoma ilerleyebilen alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının (NAFLD) tipik özelliğidir. Yağlı karaciğer hastalığının en erken belirtisinin, hepatosit1'in sitoplazmasında LD birikimi ile karakterize steatoz olduğu bulunmuştur. Karaciğer steatozu her zaman LDs2'nin artmış sayısı ve / veya genişlemiş boyutu ile ilişkilidir. LD'lerin, çekirdek olarak trigliseritten (TG) oluşan endoplazmik retikulumdan (ER) üretildiği ve proteinler ve fosfolipitlerle çevrili olduğu düşünülmektedir3. TG depolamasından sorumlu hücre altı organel olarak, LD'ler boyutları, sayıları, lipit kompozisyonları, proteinleri ve diğer organellerle etkileşimleri ile ilgili farklı özellikler sergilerler ve bunların hepsi hücre enerjisi homeostazını etkiler4. TG seviyesi LD'lerin boyutu ile pozitif ilişkilidir ve daha yüksek bir hücre içi TG içeriği daha büyük LD'leroluşturabilir 5. LD'ler, TG'nin lokal sentezi, ER'de lipit katılımı ve çoklu LD'lerin füzyonu yoluyla boyut olarak artar6. Büyük LD'ler içeren hücreler (adipositler, hepatositler, vb.), LD füzyonu ile lipit depolanmasını etkili bir şekilde arttırmak için özel bir mekanizmaya sahiptir. LD'lerin dinamik değişiklikleri, hücrenin farklı enerji metabolizması durumlarını yansıtır. Sağlıklı ve anormal hücrelerdeki çeşitli hepatik LD'lerin gözlemlenmesine ve analizine izin veren metodolojiler geliştirmek çok önemlidir.
LD'ler için ana floresan olmayan boyalar Sudan Siyah B ve yağ kırmızısı O. Sudan Siyah B nötr lipitleri, fosfolipitleri ve steroidleri boyar7. Yağ kırmızısı O esas olarak iskelet kası, kardiyomiyositler, karaciğer dokusu, yağ hücreleri, vb.LD'leri boyamak için kullanılır 8 ve farelerde ve insanlarda karaciğer steatozunun kantitatif tespiti için standart bir araç olarak kabul edilir9. LD'lerin dinamik değişimi esas olarak floresan boyama ile gerçekleştirilir. Nil kırmızısı ve BODIPY yaygın olarak kullanılan floresan lipit boyalarıdır10,11. Nil kırmızısı ile karşılaştırıldığında, BODIPY daha güçlü doku geçirgenliğine sahiptir ve LDs12 ile daha iyi bağlanır. BODIPY etiketli LD'ler, canlı hücreleri boyamak ve diğer organellerle kolokalizasyon için kullanılabilir13.
Ruminant hayvanlarda yağlı karaciğer hastalığı insidansı monogastrik hayvanlara göre anlamlı derecede yüksektir14. Geçiş döneminde, süt negatif enerji dengesi durumu yaşarlar3. Büyük miktarlarda esterleştirilmemiş yağ asitleri (palmitik asit, oleik asit, linoleik asit, vb.) sığır hepatositlerinde TG'lere sentezlenir, bu da karaciğer fonksiyonel anormalliğine yol açar ve süt ürünlerinin kalitesini ve üretim verimliliğini büyük ölçüde azaltır15. Bu çalışma, LD'lerin boyut ve sayılarını analiz etmek ve LD füzyon dinamiklerini izlemek için bir protokol sağlamayı amaçlamaktadır. Hepatositler16'ya farklı konsantrasyonlarda linoleik asit (LA) ekleyerek bir LD oluşum modeli oluşturduk ve LD'leri yağ kırmızısı O ile boyayarak işlem sırasında LD'lerin boyutundaki ve sayısındaki değişiklikleri gözlemledik. Ek olarak, LD'lerin hızlı füzyon süreci BODIPY 493/503 ile boyanarak da gözlenmiştir.

<table><tbody><tr><td>% 0.25 tripsin</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>reaktifi</td></tr><tr><td>% 4 paraformaldehit</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td>reaktifi</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>invitrojen</td><td>2295015</td><td>reaktifi</td></tr><tr><td>Sedir yağı</td><td>Solarbio</td><td>C7140</td><td>reaktif</td></tr><tr><td>hücre sayma odası</td><td></td><td></td><td>ekipmanı</td></tr><tr><td>hücre kültürü kabı</td><td>Corning</td><td>353002</td><td>Malzeme</td></tr><tr><td>Hücresi SENS Yazılımı&nbsp;</td><td>Olympus IX73</td><td></td><td>yazılımı</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>ekipmanı</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01</td><td>reaktifi</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>2492319</td><td>reaktifi</td></tr><tr><td>hematoksilen</td><td>DingGuo</td><td>AR0712</td><td>reaktifi</td></tr><tr><td>Görüntü görünümü</td><td></td><td></td><td>görüntü analizi sodtware</td></tr><tr><td>linoleik asit</td><td>Solarbio</td><td>SL8520</td><td>reaktif</td></tr><tr><td>Canlı Hücre İstasyonu</td><td>Nikon A1 HD25</td><td></td><td>ekipmanı</td></tr><tr><td>NIS-Elements&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>yazılımı</td></tr><tr><td>yağ kırmızı O</td><td>Solarbio</td><td>G1260</td><td>reaktif</td></tr><tr><td>optik mikroskop</td><td>Olympus IX73</td><td></td><td>ekipman</td></tr><tr><td>Penisilin & Streptomisin 100 kez;</td><td>NCM Biotech</td><td>CLOOC5</td><td>reaktifi</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Su HyClone</td><td>SH30258.01</td><td>reaktif</td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>ekipmanı</td></tr><tr><td>Sızdırmazlık maddesi</td><td>Solarbio</td><td>S2150</td><td>reaktifi</td></tr></tbody></table>

sığır hepatik hücrelerinde lipid damlacık büyüklüğü ve füzyonunun değerlendirilmesi

Evaluation of Lipid Droplet Size and Fusion in Bovine Hepatic Cells

Lipid damlacıkları (LD'ler), lipid metabolizmasında ve hücrelerde nötr lipid depolanmasında önemli rol oynayan organellerdir. Obezite, yağlı karaciğer hastalığı ve diyabet gibi çeşitli metabolik hastalıklarla ilişkilidirler. Hepatik hücrelerde, LD'lerin boyutları ve sayıları yağlı karaciğer hastalığının belirtileridir. Ayrıca, oksidatif stres reaksiyonu, hücre otofajisi ve apoptoza genellikle LD'lerin boyutlarında ve sayılarında değişiklikler eşlik eder. Sonuç olarak, LD'lerin boyutları ve miktarları, LD biyogenezinin mekanizması ile ilgili mevcut araştırmaların temelini oluşturmaktadır. Burada, yağ asidine bağlı sığır karaciğer hücrelerinde, LD'leri boyamak ve LD'lerin boyutlarını ve sayılarını araştırmak için yağ kırmızısı O'nun nasıl kullanılacağını açıklıyoruz. LD'lerin boyut dağılımı istatistiksel olarak analiz edilmiştir. Küçük LD'lerin büyük LD'lere kaynaşma süreci de canlı hücre görüntüleme sistemi tarafından gözlemlenir. Mevcut çalışma, farklı fizyolojik koşullar altında LD'lerin boyut değişim eğilimini doğrudan gözlemlemenin bir yolunu sunmaktadır.

LD hücrelerinin boyanması Şekil 1'de gösterilmiştir. Kırmızı noktalar hücre LD'lerini yansıtır ve mavi noktalar çekirdekleri yansıtır. LA tedavisinde her resimdeki LD'lerin boyut ve sayısının farklı olduğu görülebilir.
LA dozajındaki artışla birlikte, LD'lerin ortalama çapı ve sayısı, LA konsantrasyonuna bağlı olarak önemli ölçüde artan bir eğilim göstermiştir (Şekil 2). Şekil 2A'da gösterildiği gibi, hüc...

Bu protokol, lipit damlacıklarını (LD'ler) boyamak, yağ asidi kaynaklı yağlı hepatosit modelinde LD'lerin boyutunu ve sayısını hesaplamak ve canlı hücre görüntüleme ile küçük LD'lerin büyük LD'lere kaynaşma sürecini gözlemlemek için BODIPY 493/503'ün nasıl kullanılacağını açıklamaktadır.

Sığır Hepatik Hücrelerinde Lipid Damlacık Büyüklüğü ve Füzyonunun Değerlendirilmesi

Lipid droplets (LDs) are organelles that play an important role in lipid metabolism and neutral lipid storage in cells. They are associated with a variety ...

Araştırmamız, lipit damlacık sayısına ve karaciğer hücrelerinde linoleik asit tarafından indüklenen boyuta odaklanmaktadır. Ek olarak, yağlı karaciğerin mekanizması hakkında bilgi vermeyi amaçlıyoruz. Bu araştırma alanındaki son gelişmeler, indüklenmiş otofajiyi kuran kolin, CCT alfa'nın, sığır hepatik hücrelerinde lipit damlacık boyutunu düzenleyebileceğini düşündürmektedir.Ayrıca, canlı hücre iş istasyonu gözlemleri, fosfolipitlerin lipit damlacık füzyonu üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğunu göstermiştir. Şu anda, gen yardımı, floresan tweezer, sıvı kromatografisi, omik analiz, tek kromatografi, akış sitometrisi ve diğer teknolojiler bu alandaki geniş araştırmaları gruplandırmak için kullanılmaktadır. Deneysel yöntemin bazı sınırlamaları vardır.Örneğin, sınırlı alanlar fenomeni sadece lipit damlacık alanları için ve belirli bir atık uçuşu altında gözlemlenebilir. Yağ Kırmızı O boyama, lipit damlacıklarının görünür boyutunu ölçmek için lipit damlacığı floresan boyamasından daha uygun, daha az pahalı ve daha yaygın olarak kullanılır. Kullanımı kolaydır ve daha az ekipman gerektirir.Dahası, bu fenomen lipit füzyonunu canlı hücre istasyonu aracılığıyla doğrudan gözlemliyoruz. Bu

evaluation-of-lipid-droplet-size-and-fusion-in-bovine-hepatic-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

: 1) hücresel lipid damlacıkları izole maya hücreleri ve 2) insan plasenta sunulmuştur için iki teknikleri. Her iki prosedürlerinin merkezinde damlacıkları ihtiva eden elde edilen yüzer tabaka, hali hazırda, göz ile görselleştirilmiştir ekstre edilmiş ve saflık için Western Blot analizi ile tayin edilebilir yoğunluk gradyan santrifüj vardır.

Hücresel Lipid damlacıklar İzolasyonu: Maya Hücreleri ve insan plasentası itibaren iki Arıtma Teknikleri

De novo lipogenez ve β-yağ asidi oksidasyon hepatosit kilit metabolik, yağlı karaciğer hastalığı da dahil olmak üzere birçok metabolik bozukluklar, içinde tedirgin olan yollar oluşturmaktadır. Burada fare primer hepatositlerin izolasyonu göstermek ve β-yağ asidi oksidasyon ve lipogenez ölçümü açıklar.

Fare İlköğretim Hepatositlerde Yağ Asidi Oksidasyon ve lipogenez Belirlenmesi

Lipid damlacıkları Hepatit C virüsü (HCV), dahil olmak üzere çeşitli patojenlere replikasyonu için önemli organellerdir. Bu ilişkili proteinler kantitatif kütle spektrometresi için lipid damlacıkları izole edilmesi için bir yöntem tarif; bu tür virüs enfeksiyonu, çevresel stres veya ilaç tedavisi gibi koşullar, çeşitli altında kullanılabilir.

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Bu iletişim kuralı bir roman yöntemi lipid damlacık tecrit ve arıtma fare karaciğer, bir iyi kurulmuş endoplazmik retikulum izolasyon kit kullanarak üzerinden kurar.

Bir Well-established organel izolasyon Kit kullanarak hızlı Lipid damlacık yalıtım Protokolü

Bu çalışmada, farklılaştırılmış HepaRG hücrelerinde yağ asidi tuz sodyum oleat ile karaciğer veziküler steatozis inducing için ayrıntılı bir protokol tarif ve tutarlı Anti-Stokes dahil lipid birikiminin tespiti ve ölçülmesi için yöntemler istihdam Raman saçılma (CARS) mikroskobu, sitofluorimetrik analiz, yağ kırmızı O boyama, ve qPCR.

Farklılaşmış HepaRG hücrelerinde veziküler steatozu indükleyen ve karakterize etme

Burada, karaciğer dokusunda lipid damlacık karakterizasyonu için optimize edilmiş bir BODIPY 493/503 floresan tabanlı protokol gösterilmektedir. Ortogonal projeksiyonların ve 3D rekonstrüksiyonların kullanılmasıyla, florofor mikro-veziküler ve makroveziküler steatoz arasında başarılı bir ayrım yapılmasına izin verir ve hepatik steatoz değerlendirmesi için klasik histolojik protokollere tamamlayıcı bir yaklaşımı temsil edebilir.

Hepatik Steatoz Değerlendirmesi için Floresan Boyalı Lipit Damlacıklarının 3D Rekonstrüksiyon ile Analizi

Bu makale, metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığı için bir model olarak oleik asit kaynaklı HepG2 hücrelerinin kullanımını açıklamaktadır.

Metabolik Disfonksiyonla İlişkili Steatotik Karaciğer Hastalığında Yağ Birikiminin İn Vitro Modellenmesi

Bu protokol, senkronize hepatoma hücreleri kullanılarak mitoz sırasında lipid damlacıklarının ve organel dinamiklerinin tekrarlanabilir görselleştirilmesini sağlar.

Hepatoma Hücrelerinde Mitoz Sırasında Lipid Damlası ve Organel Dinamiklerini Görselleştirmek İçin Flüoresans Tabanlı Bir Yöntem

İlköğretim hepatositler bir fizyolojik ilgili deneysel sistem biyokimyasal, moleküler ve metabolik fonksiyonlarını değerlendirmek için değerli bir araç sağlar. Biz sürekli to1.0 × 10 kadar yaşayabilir hepatositler üretir yerinde karaciğer perfüzyon, sıçan için güvenilir bir protokol...

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Biz β-galaktosidaz aktive ifadesi ile SNARE-aracılı membran füzyon olaylar rakamlarla bir hücre füzyonu tahlil geliştirdik.

Enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak SNARE-aracılı membran füzyon analizi

Öğrenin, sığır hepatik hücrelerinde lipid damlacığı boyutu ve füzyonunu Oil Red O boyama ve canlı hücre görüntüleme ile nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu yöntem, yağlı karaciğer hastalığı mekanizmalarını anlamak için kullanılabilir.

Sığır Hepatik Hücrelerinde Lipid Damlacık Büyüklüğü ve Füzyonunun Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet