Name: Küçük Eklembacaklılardan Hemolenf Toplamak için Kesin ve Ölçülebilir Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 39 s
Description: Öğrenin küçük eklembacaklılardan hemolenf toplama yöntemini, SBPH kullanarak arbovirus vektör etkileşimlerini araştırmak için. Bu basit ve uygun maliyetli teknik, protein konsantrasyonlarını hassas şekilde ölçerek biyolojik araştırmalara değerli katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (No. 2022YFD1401700) ve Çin Ulusal Bilim Vakfı (No. 32090013 ve No. 32072385) tarafından desteklenmiştir.

1. Böcek yetiştiriciliği
<ol><li>Bu deneyde kullanılan SBPH'leri pirinç fidelerinde yükseltin (Oryza sativa cv. Nipponbare). Bir inkübatöre (65 mm x 200 mm) 20 pirinç fidesi dikin ve 16 saat ışık / 8 saat karanlık fotoperiyot altında 25 ° C'de büyütün.</li>
</ol>2. Hemolenf toplanması için SBPH'lerin diseksiyonu
<ol><li>SBPH'leri bir santrifüj tüpüne koyun ve 10-30 dakika boyunca bir buz banyosuna yerleştirin. NOT: SBPH'leri buz banyosuna 10 dakikadan daha kısa bir süre koymayın, aksi takdirde böcekler canlanabilir.</li>
	<li>Dondurulmuş bir SBPH'yi, karnı yukarı bakacak şekilde stereomikroskop altında (bkz. Malzeme Tablosu) bir cam slayt üzerine (bakınız Malzeme Tablosu) yerleştirin. Odağı böceğin altı bacağına ayarlayın.</li>
	<li>Ultra ince uçlu iki yüksek hassasiyetli cımbız hazırlayın ( bkz. Yerinde tutmak için böceğin vücuduna bastırmak için bir cımbız kullanın ve diğerini bacaklardan birini böcekten dikkatlice çekmek için kullanın. NOT: Sert kabuklu böcekler için, bacaklardan birini kesmek için oftalmik bir neşter kullanılabilir.</li>
	<li>Hemolenfin yaradan dışarı akmasını sağlamak için böceğin göğsüne bir cımbızla hafifçe bastırın. NOT: Hemolenf, görünür beyaz topaklaşma olmadan şeffaf damlacıklar halinde sunulur. Yağ vücut kontaminasyonunu temsil eden herhangi bir beyaz topaklanma varsa lipiti atın.</li>
</ol>3. Mikropipetler kullanılarak hemolenf toplanması
<ol><li>Bir mikropipet hazırlayın. Pipet ampulünün içine 1 μL hacimli bir kılcal boru (bkz. Malzemeler Tablosu) yerleştirin (bkz. Doğru ölçümler için, ölçek çizgisinin görünür olduğundan emin olun. NOT: Pipet ampulünün üst kısmında küçük bir delik gereklidir.</li>
	<li>Hemolenf toplarken, mikropipetin pipet ampulünü tutun ve kılcal tüpü böcek yarasına yakın yerleştirin. Kılcal damarın ucuna hemolenfe dokunarak yaradan yayılan hemolenfleri toplayın.</li>
	<li>Kılcal borunun içindeki sıvı istenen kireç çizgisine ulaştığında emme işlemini durdurmak için pipet ampulünün üstündeki küçük deliği parmağınızla hafifçe tıkantın. NOT: Lipit kontaminasyonunu ve tüp tıkanmasını önlemek için sürekli ve hızlı bir şekilde 1 μL hemolenf örneği toplayın.</li>
	<li>Toplanan hemolenfin 100 μL PBS tamponuna (137 mmol/L NaCI, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/L Na 2 HPO 4, 1,4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4) boşaltılması için pipet ampulüne basın. NOT: Kılcal boru PBS tamponuna yerleştirilir.</li>
	<li>Başka bir 1 μL hemolenf örneği toplarken yeni bir kılcal tüpe geçin.</li>
</ol>4. Coomassie Mavi boyama
<ol><li>3. aşamada açıklanan protokollere göre 3. aşama larvalarından aynı hacimde (1 μL) 3 hemolenf örneği toplayın ve toplanan hemolenfleri toplam 100 μL hacim yapmak için PBS tamponuna boşaltın.</li>
	<li>Seyreltilmiş hemolenf numunelerinin 100 μL'sine 25 μL 5x protein yükleme tamponu (250 mmol/L Tris-HCI [pH 6.8], %10 W/V SDS, %0.05 W/V Bromofenol Mavisi, %50 W/V gliserol, %5 W/V β-merkaptoetanol) ekleyin ve proteinleri denatüre etmek için ısıtın.</li>
	<li>Proteinleri ayırmak için kaynatılmış numunelerin 20 μL'sini %10'luk bir SDS-PAGE protein jeline yükleyin (bkz.</li>
	<li>Jeli bir Coomassie Blue çözeltisinde (1 g Coomassie Brilliant Blue R-250'yi 250 mL izopropanol, 100 mL buzul asetik asit ve 650 mL ddH2O ile karıştırın ve filtre kağıdı kullanarak herhangi bir partikülü filtreleyin) oda sıcaklığında 1 saat boyunca lekeleyin ve ardından jeli 1 saat boyunca renk çözücü çözelti (100 mL asetik asit, 400 mL metanol, 500 mL ddH2O).</li>
</ol>5. Protein konsantrasyonu tayini
<ol><li>İki katlı seyreltme yöntemini kullanarak 10 mg/mL sığır serum albüminini (BSA) PBS tamponu ile 5 mg/mL, 2,5 mg/mL, 1,25 mg/mL, 0,625 mg/mL ve 0,3125 mg/mL'ye seyreltin.</li>
	<li>Adım 5.1'de 5 μL PBS tamponunu ve her bir BSA çözeltisi konsantrasyonunu aspire edin, 1 mL 1x Bradford boya reaktifi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Kontrol olarak Bradford boya reaktifinde PBS tamponunu kullanın ve OD = 595 nm'de sıfırı kullanın. Kalan protein konsantrasyonlarının her birinin absorbans değerlerini ölçün ve standart bir eğri yapın.</li>
	<li>Larval, dişi veya erkek SBPH'lerden 100 μL PBS tamponuna 1 μL hemolenf ekleyin ve ardından hemositleri çıkarmak için numuneleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüye edin.</li>
	<li>90 μL süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aspire edin ve süpernatantın absorbans değerlerini adım 5.2'deki talimatlara göre ölçün.</li>
	<li>Hemolenf örneklerinin protein konsantrasyonlarını standart eğrinin regresyon denklemine göre hesaplayın. Deneylere üç teknik replika ile üç biyolojik replika ekleyin.</li>
</ol>6. Mikroskobik tespitler
<ol><li>Farklı gelişim aşamalarında 10-15 SBPH'den hemolenf toplamak için mikropipetler kullanın. Toplanan hemolenf, 20 μL% 4 paraformaldehit çözeltisi içeren bir tüpe ekleyin (bkz. Hemolenfi sabitlemek için karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Silanla kaplı bir slaytın ortasına 20 μL sabit hemosit pipeti atın (bkz.</li>
	<li>Damlacığı bir sürgü kurutma rafında kurutun. NOT: Aşırı kurutmadan kaçınınız.</li>
	<li>Numuneyi altın antifade reaktifi 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile örtün (bakınız Malzeme Tablosu ) ve slaytı ters çevrilmiş bir mikroskop altında inceleyin (bakınız Malzeme Tablosu).</li>
</ol>7. Hücre nicelleştirme
<ol><li>SBPH'lerden bir mikropipet ile 1 μL hemolenf toplayın ve 20 μL PBS tamponunda çözün.</li>
	<li>Hemolenf numunelerini PBS tamponu ile beş kat seyreltin.</li>
	<li>Pipet 20 μL hemolenf çözeltisini hücre sayma odasının merkezine yerleştirin (bkz. Damlacığı bir kapak kayması ile örtün (bkz.</li>
	<li>Hücre sayım odasındaki beş karedeki hücreleri ters çevrilmiş bir mikroskop altında sayın (Ek Şekil 1). Deneylerin her birine üç teknik replika ile üç biyolojik replika ekleyin. Hücreler/μL = beş orta karenin toplam sayısı × 5 × seyreltme faktörü × 104</li>
</ol>8. İstatistiksel analizler
<ol><li>İlgili yazılımla istatistiksel analizler yapın (bakınız Malzeme Tablosu). Yeni bir dosya oluşturun ve sütunu seçin, verileri içeri aktarın ve çubuklu bir dağılım grafiği oluşturun.</li>
	<li>Sütun istatistiklerini kullanarak her veri grubu için ortalama ve SD'yi hesaplayın ve gruplar arasındaki farklılıkların önemini değerlendirmek için tek yönlü bir ANOVA aracı kullanın. Üç bağımsız deneyle üç biyolojik kopyadan ortalama ve SD'yi belirleyin.</li>
</ol>

Küçük Eklembacaklılardan Hemolenf Toplanması

<ol><li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li>
<li>Ray, S., Casteel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector-mediated+plant-virus-vector+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Effector-mediated plant-virus-vector interactions.</a> Plant Cell. 34 (5), 1514-1531 (2022).</li>
<li>Islam, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-insect+vector-virus+interactions+under+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Plant-insect vector-virus interactions under environmental change.</a> Science of the Total Environment. 701, 135044(2020).</li>
<li>Cory, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+virus+transmission%3A+Different+routes+to+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Insect virus transmission: Different routes to persistence.</a> Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).</li>
<li>Wang, X. W., Blanc, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+transmission+of+plant+single-stranded+DNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses.</a> Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).</li>
<li>Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+antimicrobial+peptides+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Insect antimicrobial peptides and their applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).</li>
<li>Liu, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+interaction+between+a+plant+virus+and+its+vector+insect+reveals+new+functions+of+hemipteran+cuticular+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).</li>
<li>Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bee+hemolymph+metabolome%3A+A+window+into+the+impact+of+viruses+on+bumble+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees.</a> Viruses. 13 (4), 600(2021).</li>
<li>Jia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+mediated+transmission+of+persistently+transmitted+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses.</a> Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).</li>
<li>Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+and+vertical+transmission+of+West+Nile+Virus+by+Aedes+vexans+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).</li>
<li>Gadhave, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+frequency+of+horizontal+and+vertical+transmission+of+cucurbit+leaf+crumple+virus+in+whitefly+Bemisia+tabaci+Gennadius%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius.</a> Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).</li>
<li>Logan, R. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+and+horizontal+transmission+of+cell+fusing+agent+virus+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222(2022).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transovarial+transmission+of+a+plant+virus+is+mediated+by+vitellogenin+of+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949(2014).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).</li>
<li>Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+antiviral+innate+immunity%3A+Pathways%2C+effectors%2C+and+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).</li>
<li>Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+hepatitis+B+virus+replication+by+interferons+and+Toll-like+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).</li>
<li>Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+dengue+virus+circumvents+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">How dengue virus circumvents innate immunity.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2860(2018).</li>
<li>Gilliam, M., Shimanuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+of+hemolymph+of+the+larval+honey+bee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L).</a> Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909(2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant+virus+ensures+viral+stability+in+the+hemolymph+of+vector+insects+through+suppressing+prophenoloxidase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation.</a> mBio. 11 (4), e01453(2020).</li>
<li>Vidano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phases+of+maize+rough+dwarf+virus+multiplication+in+the+vector+Laodelphax+striatellus+%28Fall%C3%A9n%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén).</a> Virology. 41 (2), 218-232 (1970).</li>
<li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laodelphax+striatellus+Atg8+facilitates+Rice+stripe+virus+infection+in+an+autophagy-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner.</a> Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).</li>
<li>Zhang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+monooxygenases+CYP6AY3+and+CYP6CW1+regulate+Rice+black-streaked+dwarf+virus+replication+in+Laodelphax+striatellus+%28Fallen%29%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen).</a> Viruses. 13 (8), 1576(2021).</li>
<li>Ribeiro, C., Brehelin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+haemocytes%3A+What+type+of+cell+is+that%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Insect haemocytes: What type of cell is that.</a> Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).</li>
<li>Butolo, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+quality+method+for+hemolymph+collection+from+honeybee+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae.</a> PLoS One. 15 (6), e0234637(2020).</li>
<li>Nesa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+potential+of+a+ponericin-like+peptide+isolated+from+Bombyx+mori+L.+hemolymph+in+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Scientific Reports. 12 (1), 15493(2022).</li>
<li>Mahmoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-injected+Musca+domestica+larval+hemolymph%3A+Cecropin+upregulation+and+potential+anticancer+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect.</a> Molecules. 27 (5), 1570(2022).</li>
<li>Patton, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((salivary+gland%2C+and+hemolymph+collection+from+Ixodes+scapularis+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3894(2012).</li>
<li>Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolymph+amino+acid+variations+following+behavioral+and+genetic+changes+in+individual+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae.</a> Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).</li>
<li>Fiorotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disclosing+hemolymph+collection+and+inoculation+of+metarhizium+blastospores+into+Rhipicephalus+microplus+ticks+towards+invertebrate+pathology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59899(2019).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Hemolenf, eklembacaklılardaki dolaşım sisteminin ortamıdır ve arbovirüsler ancak düşmanca hemolenf ortamında hayatta kalabiliyorlarsa diğer eklembacaklı dokuları istila edebilirler. Yüksek kaliteli bir hemolenf örneği toplamak, hemolenfte meydana gelen vektör-virüs etkileşimlerini incelemenin ilk adımıdır. Böcek hemolenfinin, ön bacakta bir yara, baş bölgesinde küçük bir kesi veya karın bölgesinde bir gözyaşı yarası 26,27,28,29 dahil olmak üzere böceğin vücudundaki çeşitli bölgelerden elde edilebileceği bildirilmiştir.<s...

Hem hayvan hem de bitki virüsleri eklembacaklılar tarafından bulaşabilir ve bu virüsler insan sağlığı için ciddi bir tehdit oluşturmakta ve tarımda muazzam ekonomik kayıplara neden olmaktadır 1,2,3. Önemli olarak, eklembacaklılarda dolaşım sistemi ve bağışıklık sisteminin hayati bir unsuru olarak görev yapan eklembacaklı hemolenfi, arboviral bulaşmanın düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Eklembacaklı bağırsaklardan edinilen virüsler, ancak olumsuz hemolenf ortamından başarıyla kaçtıktan sonra diğer dokulara taşınır 4,5,6,7. Eklembacaklı hemolenfteki virüslerin yaşam döngüsü, sıvı plazmasında virüs sağkalımını, hemosit içine girişi ve diğer dokulara taşınmasını içerir ve hemolenf 8,9,10,11,12'de çeşitli virüs-vektör etkileşim mekanizmaları meydana gelir. Örneğin, RSV'nin SBPH tarafından dikey iletimi, SBPH vitellogenin proteini ile RSV (pirinç şeridi virüsü) kapsid proteini13,14 arasındaki moleküler etkileşime bağlıdır. Bazı virüsler, spesifik vektör faktörlerini15,16,17,18 bağlayarak hemolenfin bağışıklık tepkisinden kaçabilir. Bu nedenle, eklembacaklıların hemolenfindeki vektör-virüs etkileşimlerinin araştırılması, arbovirüs iletiminin daha iyi anlaşılması için önemlidir.
Planthoppers, leafhoppers ve bazı sivrisinekler gibi bazı küçük böceklerin hemolenfi, büyüklükleri nedeniyle toplanması zordur. Bu sorunu çözmek için, hemolenfin mikro hacmini çıkarmak için doğrudan böcek gövdesine bir şırınga iğnesi sokmak, ince uçlu cımbızla yara bölgesinden eksüda toplamak ve doğrudan santrifüjleme dahil olmak üzere hemolenf toplamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemler, hemolenf 19,20,21 içindeki göreceli gen ekspresyon seviyelerinin ve viral titrelerin ölçülmesini sağlamıştır. Bununla birlikte, hemosit sayımı, protein nicelleştirme ve enzim aktivitesi analizi için gerekli olan hemolenf hacmini ölçmek için etkili bir yöntem şu anda bu küçük böcekler için mevcut değildir.
SBPH (küçük kahverengi planthopper), vücut uzunluğu yaklaşık 2-4 mm olan bir tür küçük böcek vektörüdür. SBPH, RSV, mısır kaba cüce virüsü ve pirinç siyah çizgili cüce virüsü22,23,24 dahil olmak üzere çeşitli bitki virüslerini iletebilir. SBPH ve RSV arasındaki etkileşim son on yılda derinlemesine incelenmiştir. SBPH'lerle çalışmayı kolaylaştırmak için, hemolenf toplamak için yeni ve basit bir yöntem geliştirdik. Kılcal kuvvetler prensibine dayanan bu yöntem, böceğin hemolenfini kesin ve ölçülebilir bir şekilde elde etmek için ölçek işaretli bir kılcal damar kullanır. Bu, küçük böceklerden belirli bir hemolenf hacmini verimli bir şekilde toplamamıza ve küçük vektörlerin hemolenf ortamını daha ayrıntılı olarak incelememize olanak tanır.

<table><tbody><tr><td>% 10 SDS-PAGE protein jeli</td><td>Bio-rad</td><td>4561035</td><td>Protein ayırma ve tespiti</td></tr><tr><td>%4 paraformaldehit</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td>Hücrelerin veya dokuların fiksasyonu için&nbsp;</td></tr><tr><td>Bradford boya reaktifi</td><td>Bio-rad</td><td>5000205</td><td>Protein konsantrasyonu tespiti</td></tr><tr><td>Kılcal</td><td>Hirschmann</td><td>9000101</td><td>Hemolenf toplamak için</td></tr><tr><td>Hücre sayma odası</td><td>ACMEC</td><td>AYA0810</td><td>Hemosit sayımı</td></tr><tr><td>Cam slayt</td><td>Gitoglas</td><td>10127105A</td><td>Böcekleri tutmak için</td></tr><tr>Silan <td>Sigma</td> S4651-72EA<td>ile kaplanmış cam slayt</td><td></td><td>Mikroskop örneklerini tutmak için</td></tr><tr>DAPI <td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>ile altın antifade reaktifi</td><td>Çekirdek boyama</td></tr><tr><td>Mikroskop kapak camı</td><td>Gitoglas</td><td>10212424C</td><td>Mikroskobik gözlem için</td></tr><tr><td>Pipet ampulü</td><td>Hirschmann</td><td>9000101</td><td>Hemolenf toplamak için</td></tr><tr><td>Prism 8.0 yazılımı</td><td>GraphPad Yazılımı</td><td>/</td><td>İstatistiksel analizler</td></tr><tr><td>Stereomikroskop&nbsp;</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>Böcek diseksiyonu için</td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>Tianld</td><td>P5622</td><td>Böcek diseksiyonu için</td></tr><tr><td>Zeiss ters mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Observer Z1</td><td>Hemositler gözlemi</td></tr></tbody></table>

küçük eklembacaklılardan hemolenf toplamak için kesin ve Ölçülebilir bir yöntem

A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods

Artropodların, virüs bulaşması için gerekli olan hemolenfleri aracılığıyla tıbbi ve tarımsal öneme sahip çeşitli virüsleri ilettiği bilinmektedir. Hemolenf koleksiyonu, virüs-vektör etkileşimlerini incelemek için temel teknolojidir. Burada, Laodelphax striatellus'u (küçük kahverengi planthopper, SBPH) bir araştırma modeli olarak kullanarak küçük eklembacaklılardan hemolenfin nicel toplanması için yeni ve basit bir yöntem açıklıyoruz, çünkü bu eklembacaklı pirinç şeritli virüsün (RSV) ana vektörüdür. Bu protokolde, işlem, donmuş eklembacaklıların bir bacağını ince uçlu cımbızla hafifçe sıkıştırarak ve hemolenfin yaradan dışarı bastırılmasıyla başlar. Daha sonra, kılcal kuvvetler prensibine göre transüdatif hemolenfin yaradan toplanması için bir kılcal damar ve bir pipet ampulünden oluşan basit bir mikropipet kullanılır. Son olarak, toplanan hemolenf daha fazla çalışma için belirli bir tampon içinde çözülebilir. Küçük eklembacaklılardan hemolenf toplamak için kullanılan bu yeni yöntem, arbovirüsler ve vektör-virüs etkileşimleri hakkında daha fazla araştırma yapmak için yararlı ve etkili bir araçtır.

Mikropipet modeli ve hemolenf koleksiyonu Eylemi kılcal borunun kılcal kuvvetlerine dayanan basit bir mikropipet geliştirdik. Mikropipet, kılcal bir tüp ve bir pipet ampulünden oluşur (Şekil 1A). Kılcal borular 1 μL ila 20 μL arasında değişen farklı hacim boyutlarında mevcuttur ve kılcal boru hacimleri gereksinimlere göre seçilir. Daha küçük hacimli kılcal tüpler önerilmez, çünkü daha küçük hacimli tüplerin ekstra ince açıklıkları hemolenf gibi sıvıların emilimini zorlaşt...

Daha sonraki analizler için ölçülebilir hemolenfleri küçük eklembacaklılardan verimli bir şekilde toplamak için bir yöntem tarif ediyoruz.

Küçük Eklembacaklılardan Hemolenf Toplamak için Kesin ve Ölçülebilir Bir Yöntem

Arthropods are known to transmit a variety of viruses of medical and agricultural importance through their hemolymph, which is essential for virus ...

Araştırmamız arbovirüslere, böceklere ve bitki etkileşimlerine odaklanmaktadır. Küçük eklembacaklılardan hemolenf örnekleri elde etmek, böcek kaynaklı hastalıklar üzerine yapılan araştırmalar için teknik bir zorluk teşkil etmektedir. Bu protokol, bu soruna karşı koymak için kesin ve ölçülebilir bir teknik göstermektedir.Arbovirüslerin iletimindeki son araştırma gelişmeleri, virüslerin konakçı bariyerini kırmak için birkaç önemli vektör faktörünü manipüle edebileceğini keşfetmiştir. Bu protokol, hemolenfin hassas bir şekilde ölçülmesini sağlayan basit, uygun maliyetli ve değerli bir tekniktir. Bu yöntem aynı zamanda virüsler ve vektörler arasındaki etkileşimleri başlatmak için değerli bir teknoloji sunar.Yaklaşan araştırmamız, vektör-böcekler tarafından virüs bulaşmasının moleküler mekanizmalarını anlamaya odaklanırken, yeni operasyonel teknikleri keşfedecek ve geliştirecektir.

a-precise-quantifiable-method-for-collecting-hemolymph-from-small

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Amerikan at nalı yengeci, Limulus Polyphemus'un, tartışmalı, büyük miktarda herhangi bir omurgasız kan için en uygun bir kaynağıdır. Kan genel dolaşımı, granül amebocyte ve plazma, hemosiyanin, C-reaktif protein ve α2-makroglobulin sadece üç bol protein sadece tek bir hücre tipi, kompozisyon basit. Kan kalpten toplanır ve kan hücreleri ve plazma santrifüj ile ayrılır.

Amerikan Horseshoe Yengeç, Limulus Polyphemus&#39;un Kan Toplama

Korunmuş insülin sinyalizasyonu meyve sineği bulundu...

İnsülin Enjeksiyon ve Yetişkin İnsülin Hassasiyet Tedbir hemolimf Ekstraksiyon Drosophila melanogaster</em

A açıklanmıştır sivrisinek hemocytes toplamak ve leke henüz doğru yöntem basitleştirilmiş. Bizim metodumuz Aedes sivrisinek hemocytes temiz hazırlıkları izole etmek için yüksek enjeksiyon teknikleri doğruluk ile perfüzyon sadeliği birleştirir. Bu yöntem çalışmaları gerektiren türleri hemocytes bilgi ve bolluk kolaylaştırır.

Yellow Fever Sivrisinek Hemocytes Toplama ve Boyama için Protokol Aedes aegypti</em

Böcek hemocytes böcek tüm gelişim aşamalarında immün ve non-immün hem de pek çok önemli fonksiyonları, yürütmek. Hemocyte türleri ve işlev Bizim bugünkü bilgi böcek genetik modeller üzerinde çalışmalar geliyor. Burada, biz, ayıklanması ve niceleme yabani tırtıllar gelen hemocytes görselleştirmek için bir yöntem mevcut.

Vahşi Tırtıllar gelen Hemocytes ayıklamak için basit bir protokol

Drosophila hemolenf, larva ve yetişkin aşamalarında vücutta dolaşan hem kan hem de interstisyel sıvı görevi görür. Bu video, dolaşımdaki hücreleri ölçmek için larva hemolenfini toplamak için bir protokolü açıklamaktadır.

Kütikül Bozulması: Drosophila Larvalarından Hemolenf Toplamak İçin Bir Yöntem

Bu video, Drosophila larvalarının hematopoetik ceplerinde hemosit yeniden yapışmasını değerlendiren hemosit bozukluğu testini göstermektedir. Mekanik bozukluk, yerleşik hemositleri serbest bırakarak dolaşımdaki hemosit sayısını yükseltir. İyileşme sonrası, yerleşik hemositlerin yeniden yapışması doğrulanır ve bu da geri dönüşümlülüğü gösterir.

Hemositin hematopoietik ceplere yeniden yapışmasını değerlendirmek için bir Hemosit bozukluğu testi

Drosophila kan hücreleri veya hemositler, yerleşik bölgeler ve dolaşım arasında döngü yapar.  Larvada, yerleşik (sapsız) hemositler indüktif mikro ortamlara, Hematopoetik Ceplere lokalize olurken, dolaşımdaki hemositler hemolenf içinde serbestçe hareket eder. Bu protokolün amacı, davranışsal olarak farklı ancak birbirini değiştiren bu iki hemosit popülasyonunun standartlaştırılmış izolasyonu ve miktarının belirlenmesidir.

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Drosophila ve memeli hematopoetik sistem hematopoez çalışmak için Drosophila çekici genetik model yapımı, birçok ortak özellikleri paylaşır. Burada İmmünohistokimyada için önemli larva hematopoetik organ diseksiyonu ve montajını göstermektedir. Ayrıca sirkülasyon hemocytes ve sesil kristal hücreleri dahil olmak üzere çeşitli larva hematopoietik bölmeleri tahlil etmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Bu yöntem, patojen işgali üç boyutlu (3D) modelleri ile böcek hücreye görselleştirmek gösterilmiştir. Hemocytes Drosophila larvaları üzerinden viral veya bakteriyel patojenler, ex vivo veya vivo içindeile bulaşmış. Virüslü hemocytes daha sonra sabit ve görüntüleme için bir confocal mikroskop ve sonraki 3D hücresel yeniden yapılanma ile lekeli.

Hemocytes mikrobiyal enfeksiyon ve çözümleme çekme--dan Drosophila melanogaster larva

Kene hemolymph analizi, bazı patojenlerin hastalığa neden olduğu ve keneler immünolojik olarak bu enfeksiyona nasıl yanıt vereceği konusunda önemli bir bilgi kaynağını temsil eder. Bu çalışmada, mantar propagülleri aşılamak ve Rhipicephalus Microplus tıkanmış kadınlarda hemolymph toplamak gösterilmiştir.

Hemolymph toplama ve Metarhizyum blastosporların omurgasız patoloji çalışmalarına doğru Rhipicephalus Microplus ticks içine inoculation

Bu protokol, genç ve yaşlı Drosophila melanogaster hemositlerin fagositoz bakterilere yeteneğini değerlendirmek ve ölçmek için kullanılan fagositozun in vivo testinitanımlar.

Erişkin Drosophila melanogaster Hemositlerin Yaşa Özgü Fagositik Yeteneğinin In Vivo Fagositoz Islımı Ile Değerlendirilmesi

Öğrenin küçük eklembacaklılardan hemolenf toplama yöntemini, SBPH kullanarak arbovirus vektör etkileşimlerini araştırmak için. Bu basit ve uygun maliyetli teknik, protein konsantrasyonlarını hassas şekilde ölçerek biyolojik araştırmalara değerli katkı sağlar.

Küçük Eklembacaklılardan Hemolenf Toplamak için Kesin ve Ölçülebilir Bir Yöntem

Daha fazla video keşfet