Name: Nesiller Arası Epigenetik Kalıtımın Analizi C. elegans Floresan Raportör ve Kromatin İmmünopresipitasyon (ChIP) Kullanılarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Öğrenin C. elegans'ta RNAi kalıtımını ve kromatin modifikasyonlarını floresan raportör ve ChIP kullanarak incelemeyi. Bu yöntem epigenetik araştırmalarda tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Araçları geliştiren ve paylaşan ve bu makalede çalışmalarına atıfta bulunulan C. elegans topluluğundaki laboratuvarlara teşekkür etmek istiyoruz. Bazı suşlar, NIH Araştırma Altyapısı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlanmıştır. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) Projesi tarafından A.L.S.'ye (PJT-175245) hibe ile desteklenmiştir. CL, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) lisansüstü bursu (PGS-D) tarafından desteklenmektedir.

Caenorhabditis elegans'ta Epigenetik Kalıtım ve ChIP

<ol><li>Alcazar, R. M., Lin, R., Fire, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+dynamics+of+heritable+silencing+induced+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).</li>
<li>Ashe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+can+trigger+a+multigenerational+epigenetic+memory+in+the+germline+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans.</a> Cell. 150 (1), 88-99 (2012).</li>
<li>Buckley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+Argonaute+promotes+multigenerational+epigenetic+inheritance+and+germline+immortality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality.</a> Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).</li>
<li>Vastenhouw, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+silencing+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term gene silencing by RNAi.</a> Nature. 442 (7105), 882(2006).</li>
<li>Lee, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+piRNAs+mediate+the+genome-wide+surveillance+of+germline+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts.</a> Cell. 150 (1), 78-87 (2012).</li>
<li>Luteijn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+stable+Piwi-induced+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).</li>
<li>Sapetschnig, A., Sarkies, P., Lehrbach, N. J., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+siRNAs+mediate+paramutation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 11 (3), e1005078(2015).</li>
<li>Shirayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+initiate+an+epigenetic+memory+of+nonself+RNA+in+the+C.+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline.</a> Cell. 150 (1), 65-77 (2012).</li>
<li>Minkina, O., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+heritable+germline+silencing+directs+somatic+silencing+at+an+endogenous+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus.</a> Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).</li>
<li>Seroussi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+epigenetic+regulation+by+C.+elegans+nuclear+RNA+interference+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).</li>
<li>Lev, I., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9me3+is+required+for+inheritance+of+small+RNAs+that+target+a+unique+subset+of+newly+evolved+genes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes.</a> eLife. 8, e40448(2019).</li>
<li>Woodhouse, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifiers+SET-25+and+SET-32+are+required+for+establishment+but+not+long-term+maintenance+of+transgenerational+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance.</a> Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).</li>
<li>Houri-Zeevi, L., Teichman, G., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+resets+ancestral+heritable+small+RNA+responses%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Stress resets ancestral heritable small RNA responses.</a> eLife. 10, e65797(2021).</li>
<li>Houri-Ze'evi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+mechanism+determines+the+duration+of+the+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 165 (1), 88-99 (2016).</li>
<li>Spracklin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNAi+inheritance+machinery+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).</li>
<li>Perales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+epigenetic+inheritance+is+negatively+regulated+by+the+HERI-1+chromodomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein.</a> Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).</li>
<li>Shukla, A., Perales, R., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+coordinate+poly%28UG%29+tailing+to+prevent+aberrant+and+perpetual+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing.</a> Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).</li>
<li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+GeneticsWormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology.</a> WormBook. , https://www.ncbi.nim.nih.gov/books/NBK19711/ (2006).</li>
<li>Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+nematodes+for+live+imaging+using+an+agarose+pad+produced+with+a+Vinyl+Record%5BTitle%5D)+AND+%22microPublication+Biology%22%5BJournal%5D)">Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record.</a> microPublication Biology. 2018, (2018).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Askjaer, P., Ercan, S., Meister, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+techniques+for+the+analysis+of+chromatin+and+nuclear+organization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).</li>
<li>Gu, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+siRNA+in+Caenorhabditis+elegans+generates+a+transgenerational+sequence-targeted+histone+H3+lysine+9+methylation+footprint%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint.</a> Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).</li>
<li>Kalinava, N., Ni, J. Z., Peterman, K., Chen, E., Gu, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+the+downstream+effects+of+germline+nuclear+RNAi+reveals+that+H3K9me3+is+dispensable+for+heritable+RNAi+and+the+maintenance+of+endogenous+siRNA-mediated+transcriptional+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+%26+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Epigenetics & Chromatin. 10, 6(2017).</li>
<li>Kalinava, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+heterochromatin+factor+SET-32+plays+an+essential+role+in+transgenerational+establishment+of+nuclear+RNAi-mediated+epigenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing.</a> Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).</li>
<li>Lev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MET-2-dependent+H3K9+methylation+suppresses+transgenerational+small+RNA+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance.</a> Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2001).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+Argonaute+protein+promotes+the+inheritance+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi.</a> Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).</li>
<li>Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+requirements+for+inheritance+of+RNAi+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans.</a> Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).</li>
<li>Houri-Zeevi, L., Korem Kohanim, Y., Antonova, O., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+rules+explain+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).</li>
<li>Burton, N. O., Burkhart, K. B., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNAi+maintains+heritable+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).</li>
<li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrde+pathway+mediates+small-RNA-directed+histone+H3+lysine+27+trimethylation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J. M., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+coupled+to+detection+by+quantitative+real-time+PCR+to+study+transcription+factor+binding+to+DNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).</li>
</ol>

Tüm yazarlar, açıklanacak herhangi bir çelişkileri olmadığını onaylar.

Bu protokolde, dsRNA, C. elegans18'de standart bir yöntem haline gelen besleme yoluyla tanıtılır. RNAi kalıtım deneyleri için besleme yaklaşımı, büyük bir P0 popülasyonu 2,11,12,22,23,24,25 elde etmek için kolay bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, RNAi maruziyetinin zamanlaması ve süresi, transgen susturmanın etkinliğini etkiler26 ve RNAi bakterilerinin konsantrasyonu, kalıtsal RNAi susturmanınkalıcılığını etkiler 1. Bu nedenle, standartlaştırılmış RNAi bakterileri ve solucan büyümesi, tutarlı bir GFP susturma seviyesi ve kalıtım süresi elde etmek için önemlidir. Burada embriyolar RNAi plakaları üzerine kaplanır, böylece P0 hayvanları yumurtadan RNAi bakterilerine maruz kalır. Alternatif yaklaşımlar, senkronize L1 24,27 veyaL4 25 evre hayvanlarını RNAi-NGM plakalarına kaplamıştır. Ek olarak, açlık ve diğer stresler RNAi kalıtımının13 sürdürülmesini etkilediğinden, gıda arzının aşırı kalabalıklaşmasını ve tükenmesini önlemek için plakalar izlenmelidir. Beslenme yoluyla RNAi'yi başlatmaya bir alternatif olarak, öncü C. elegans RNAi kalıtım çalışmalarından bazıları, dsRNA konsantrasyonunun daha fazla kontrolünü sağlayangonad enjeksiyonu yoluyla RNAi'yi indükledi 1,28.
Bu protokolde, her nesil, daha önce tarif edildiği gibialkalin hipoklorit muamelesi ile bir popülasyon olarak kabul edilir 16,22,23,24. Hipoklorit arıtımı, F1 neslinin ebeveyn ortamından22 RNAi bakterileri ile kontamine olmamasını sağlar ve olası istenmeyen popülasyon darboğazını önler. Bununla birlikte, toplu geçiş de bir sınırlama olabilir, çünkü bireysel hayvanlar farklı kalıtım modellerinesahip olabilir 1,29. Her nesli oluşturmak için alternatif bir yöntem, tek tek hayvanlarıseçmektir 1,2,9,11,25. Bu yaklaşım, soylar içindeki fenotiplerin izlenmesine ve genetik çaprazlamaların dahil edilmesine izin verir. Soy analizi, düşük penetranslı fenotipler için de avantajlı olabilir12.
Floresan protein ekspresyonu, RNAi kaynaklı susturma 2,3,4,12,14,15,16,25,30'un güçlü ve kullanışlı bir okumasıdır. Bu protokolde açıklandığı gibi, GFP ifadesi manuel olarak AÇIK veya KAPALI 11,12,15,16,25 olarak puanlanabilir. Manuel puanlama,nitel yoğunluk seviyeleri 3,4,14 atanarak daha da iyileştirilebilir. Alternatif olarak, mikroskopi görüntülerinin 11,12,14,25,27 otomatik yoğunluk puanlaması veya canlı hayvanların akış sitometrisi floresan ölçümü2 kantitatif ve yüksek verimli bir okuma sağlayabilir. Bununla birlikte, raportör ifadesi germ hattı ile sınırlı olduğundan, otomatik yaklaşımların bir uyarısı, özellikle çalışma anormal germ hattı gelişimine sahip mutantları içeriyorsa, susturulmuş GFP ekspresyonu olan hayvanlar ile germ hattı olmayan hayvanlar arasında ayrım yapmaları gerektiğidir. GFP floresansına alternatif olarak, RNAi hedef pre-mRNA ve mRNA seviyeleri 2,16,23,24'ü ölçmek için ters transkripsiyon (RT)-qPCR kullanılabilir. Bu yaklaşım, RNA'yı hedef alan susturmanın daha doğrudan bir okumasını sağlar ve özellikle susturmanın görünür bir fenotip üretmediği diğer RNAi hedefleri için yararlıdır. Yapay GFP raportörlerinin kullanılmasının bir sınırlaması, eksojen ve endojen dizilerin nesiller arası RNAi11'de diferansiyel olarak düzenlenmesidir. Bu nedenle, sıcaklığa duyarlı embriyonik öldürücü alel oma-1(zu405)1,11,16,25 gibi endojen hedeflerle yapılan çalışmalar, floresan transgen raportörlerine tamamlayıcı bir yaklaşım olarak düşünülmelidir.
ChIP'nin RNAi kalıtım testleri bağlamında analizi, tedaviler ve replikasyonlar arasında karşılaştırma yapılmasını gerektirir. İlk olarak, numuneler arasındaki başlangıç malzemesindeki farklılıkları hesaba katmak için, ChIP sinyali, 'Giriş yüzdesi' ile aynı lokusta Giriş sinyaline normalleştirilir. Bir histon H3 ChIP'nin paralel olarak işlenmesi, herhangi bir histon modifikasyon değişikliğinin nükleozom yoğunluğundaki değişikliklere karşılık gelip gelmediğini belirlemeye yardımcı olacaktır. Ek olarak, ChIP çok adımlı bir süreç olduğundan, verimlilik numuneler arasında değişebilir. Uygun pozitif ve negatif kontrol lokuslarının seçimi, numuneler ve deneyler arasındaki sinyal-gürültü oranını değerlendirmek ve karşılaştırmak için yararlıdır. Ek olarak, numuneler arasındaki karşılaştırmaları kolaylaştırmak için, RNAi hedefindeki ChIP DNA qPCR eşik döngüsü değerleri genelliklebir kontrol odağı 3,11,15,23,30,31'e normalleştirilir. RNAi tedavisinin etkilerini değerlendirmek için, tedavi RNAi'sindeki ChIP sinyalinin kontrol veya RNAi olmayan koşullara oranı da karşılaştırılır. Mevcut yaklaşımın bir sınırlaması, ChIP'nin bütün hayvanlarla gerçekleştirilmesidir, RNAi tedavisine verilen yanıt ise germ hattına özgü olabilir. Bu uyarının üstesinden gelmek için bir yaklaşım, izole germ hattı çekirdeklerini kullanarak ChIP gerçekleştirmektir. ChIP'yi optimize etmek için ek teknik hususlar da başka bir yerde kapsamlı bir şekilde tartışılmıştır32,33.
Genel olarak, bu RNAi kalıtımı ve ChIP protokolü, nesiller arası epigenetik düzenlemeyi daha fazla keşfetmek için diğer tekniklerle entegre edilebilecek ayrıntılı ve uyarlanması kolay bir temel sağlar. Örneğin, kromatin manzarasının hem RNAi hedefine yakın hem de genom çapında bir ölçekte daha ayrıntılı bir görünümü için ChIP DNA'dan (ChIP-seq) yüksek verimli dizileme kütüphaneleri oluşturulabilir.

Epigenetik kalıtım, gen düzenleyici bilgilerin nesiller boyunca aktarılmasına izin verir ve bu nedenle ebeveynlerin çevresinin veya deneyimlerinin soylarını etkilemesine izin verebilir. C. elegans'ta, eksojen çift sarmallı RNA (dsRNA) tarafından başlatılan germ hattı gen susturması, orijinal tetikleyiciyemaruz kalmayan döllerde birden fazla nesil için kalıtsal olabilir 1,2,3,4. RNA interferansı (RNAi) kalıtımı olarak adlandırılan bu süreç, C. elegans'ta piRNA tarafından başlatılan çok kuşaklı susturma2,5, paramutasyon/RNAe (RNA kaynaklı epigenetik susturma)6,7,8 ve çok kopyalı dizi tarafından başlatılan susturma9 dahil olmak üzere, küçük RNA ve kromatin düzenleme makineleri için örtüşen ancak farklı gereksinimleri olan birkaç ilgili epigenetik susturma fenomeninden biridir . C. elegans eksojen RNAi'de dsRNA, hedef mRNA'larını tanımak için birincil Argonaute proteinleri ile bir kompleks içinde hareket eden küçük enterferans yapan RNA'lara (siRNA'lar) işlenir. Bu hedefleme, hem sitoplazmik hem de nükleer susturma yolları yoluyla hedef mRNA'yı susturmak için ikincil Argonotlar ile ilişkili ikincil siRNA'ların amplifikasyonuna yol açar. Germ hattı eksprese edilen RNAi hedefleri için, nükleer ikincil Argonaute HRDE-1 ve ek nükleer RNAi faktörleri, yeni ortaya çıkan transkriptleri hedef alır, bu da transkripsiyonel baskılama ve H3K9me310 dahil olmak üzere baskılayıcı kromatin işaretlerini biriktirmek için histon metiltransferazların işe alınmasına neden olur. Histon H3K9me3, RNAi kalıtımı11,12 ile germ hattı ile eksprese edilen yeşil floresan protein (GFP) transgenlerinin kalıtsal susturulmasının kurulmasını destekler.
Bu protokolün amacı, RNAi kalıtımı için bir raportör olarak germ hattında bir GFP-histon füzyon proteinini eksprese eden bir transgen kullanmak ve kromatin immünopresipitasyon ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (ChIP-qPCR) kullanarak raportör transgen lokusunda histon modifikasyonlarındaki değişiklikleri test etmektir. Bu protokol, raportör susturmayı başlatmak için standartlaştırılmış bir plaka bazlı RNAi besleme yaklaşımını açıklar. Ayrıca, alkalin hipoklorit tedavisi ('ağartma') ile gravid yetişkinlerden utero embriyoları izole ederek hayvanların nesiller arasında geçirilmesi için ayrıntılı bir zaman çizelgesi sağlar. Floresan mikroskobu ile popülasyonun bir alt kümesinde GFP susturma sıklığının izlenmesi ve histon H3K9me3 ChIP-qPCR için yöntemler ve temsili veriler de açıklanmaktadır. Raportör tabanlı RNAi kalıtım deneyleri, epigenetik düzenlemede genetik ve çevresel faktörlerin rollerini işlevsel olarak incelemek için oldukça izlenebilir bir sistem sağlar 13,14 ve bu tür raportörleri kullanan genetik taramalar, hem 2,3,15 için gerekli olan genleri hem de16,17 nesiller arası epigenetik kalıtım süresini negatif olarak düzenleyen genleri tanımlamıştır.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Bioshop</td><td>AMP201</td><td>Ultra saf suda 100 mg/mL'lik bir çözelti yapın. Filtreyle sterilize edin ve -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Anti-H3K9me3 Tavşan Poliklonal Antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td>Konsantrasyon partiye bağlıdır (0.9 - 1 mg / mL).</td></tr><tr><td>Anti-Histon H3 Tavşan Poliklonal Antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>Konsantrasyon partiye bağlıdır (0.7 - 1 mg / mL).</td></tr><tr><td>Çamaşır suyu (%6 Sodyum hipoklorit)</td><td>Lavo</td><td>02358107</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans GFP RNAi Reporter NA</td><td></td><td>SX1263</td> ile suşu<td>, Sapetschnig ve ark. 2015 (ref. 7). Cambridge Üniversitesi, E. Miska laboratuvarından bir hediye.</td></tr><tr><td>Karbenisilin</td><td>BioShop</td><td>CAR544</td><td>Ultra saf suda 25 mg / mL'lik bir çözelti yapın. Filtreyle sterilize edin ve -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G Manyetik Boncuklar</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td></td></tr> <tr><td> E. coli suşu HT115 (DE3)</td> <td>Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)</td> <td>HT115 (DE3)</td><td></td></tr> <tr><td> E. coli suşu OP50-1</td><td>Caenorhabdit Genetik Merkezi (CGC)</td> <td>OP50-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M, pH 8.0)</td> <td>Floresan</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>canlandırıcı Stereoskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit (%37)</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td>1,25 M'lik bir çözelti yapın ve 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>HEPES-KOH (1 M, pH 7.5)</td><td>Teknova</td><td>H1035</td><td></td></tr><tr><td>Hidrofobik Baskılı Slaytlar, 10 kuyu</td><td>VWR</td><td>100488-904</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (Oktilfenol etoksilat)</td><td>BioShop</td><td>NON999</td><td>Ultra saf suda %10 (h/h) çözelti hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>IPTG (İzopropil -&beta; -D-tiyogalaktozit)</td> <td>BioShop</td><td>IPT001</td><td>Ultra saf suda 0,2 g / mL'lik bir çözelti yapın. Filtreyle sterilize edin ve -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725122</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Plakaları 100 & mikro ile desteklenmiş; g/mL Ampisilin</td><td>NA</td><td>NA Standart</td><td>laboratuvar tarifi.</td></tr><tr><td>Levamizol (Tetramisol hidroklorür)</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>Ultra saf suda 200 mM'lik bir çözelti yapın. -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>LiCl (8 M)</td><td>Sigma</td><td>L7026</td><td></td></tr><tr><td>M9 Tampon</td><td>NA</td><td>NA</td><td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4.</td></tr><tr><td>Manyetik Ayırıcı (1,5 mL tüpler)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik Ayırıcı (0,2 mL tüpler)</td><td>Permagen</td><td>MSR812</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Kapağı Camı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12541B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Slayt</td><td>Teknisyeni Seçimi</td><td>LAB-037</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5 M)</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td>ChIP tamponları için.</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td>10 M'lik bir çözelti hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>NGM Plakaları</td><td>NA</td><td>NA %</td><td>1.7 (a/h) agar, %0.3 (a/h) NaCl, %0.25 (a/h) pepton, 1 mM CaCl2, 5 & mu; g/mL kolesterol, 25 mM Potasyum fosfat pH 6.0, 1 mM MgSO4, 50 & mikro; g/mL streptomisin.</td></tr><tr><td>Normal Tavşan IgG (1 mg/mL)</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>2729</td><td></td></tr><tr><td>Petri Kabı (35 mm x 10 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (10X)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid - Kontrol RNAi&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>L4440 (Plazmid #1654)</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid - GFP-taring RNAi&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>L4417 (Plazmid #1649)</td><td>Not, GFP'yi hedefleyen alternatif L4440'tan türetilmiş plazmitler kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Primer çifti [gfp'nin -3.3 kb yukarı akışı]</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>NA</td><td>F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG</td></tr><tr><td>Primer çifti [gfp'nin +1.3 kb aşağı akışı]</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>NA</td><td>F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT</td></tr><tr><td>Primer çifti [clec-18]</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>NA</td><td>F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA</td></tr><tr><td>Primer çifti [gfp ekzon 1]</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>NA</td><td>F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC</td></tr><tr><td>Primer çifti [gfp ekzon 4]</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>NA</td><td>F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA</td></tr><tr><td>PRIMER ÇIFTI [HRP-2]</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>NA</td><td>F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA</td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyl Tableti</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-37084</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Arıtma Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Gerçek Zamanlı PCR Tespit Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNAi-NGM plakaları</td><td>NA</td><td>NA NA</td><td>%1.7 (a/h) agar, %0.3 (a/h) NaCl, %0.25 (a/h) pepton, 1 mM CaCl2, 5 & mikro; g/mL kolesterol, 25 mM Potasyum fosfat tamponu pH 6.0, 1 mM MgSO4, 25 & mikro; g / mL karbenisilin ve 5 mM IPTG.</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodyum tuzu)</td> <td>Sigma</td><td>L5777</td><td>% 10 (a / h) çözelti yapın ve en fazla 1 ay boyunca ışıktan korunarak oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>74255</td><td>%10 (a/h) çözelti hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td>% 5 (a / h) çözelti yapın ve oda sıcaklığında ışıktan korunarak en fazla 1 ay saklayın.</td></tr><tr><td>Sonikasyon Tüpü Evergreen</td><td></td><td>214-3721-010</td><td></td></tr><tr><td>Sonication Tüp Kapağı Evergreen</td><td></td><td>300-2911-020</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q800R3-110</td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin sülfat</td><td>Bioshop</td><td>STP101</td><td>Ultra saf suda 50 mg / mL'lik bir çözelti yapın. Filtreyle sterilize edin ve -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>TAE tamponu (1X)</td><td>NA</td><td>NA 40</td><td>mM Tris, 20 mM asetat, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Uyarı sinyali sayacı tıklayıcısı</td><td>Uline</td><td>H-7350</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin</td><td></td><td>Biyoshop TET701</td><td>Etanolde 5 mg/mL'lik bir çözelti yapın ve -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-205</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Ultra saf suda %10 (h/h) çözelti hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.</td></tr></tbody></table>

nesiller arası epigenetik kalıtımın analizi c. elegans floresan raportör ve kromatin İmmünopresipitasyon (chip) kullanılarak

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Nesiller arası epigenetik kalıtım (TEI), kodlamayan RNA'lar ve kromatin modifikasyonları gibi faktörler aracılığıyla genom dizisini değiştirmeden germ hattı boyunca bilgi aktarımına izin verir. Nematod Caenorhabditis elegans'ta RNA interferansı (RNAi) kalıtımı olgusu, bu model organizmanın kısa yaşam döngüsünden, kendi kendine yayılmasından ve şeffaflığından yararlanan TEI'yi araştırmak için etkili bir modeldir. RNAi kalıtımında, hayvanların RNAi'ye maruz kalması, ilk tetikleyicinin yokluğunda birden fazla nesil boyunca devam eden hedef lokusta gen susturulmasına ve değişmiş kromatin imzalarına yol açar. Bu protokol, germ hattı ile eksprese edilen bir nükleer yeşil floresan protein (GFP) raportörü kullanılarak C. elegans'ta RNAi kalıtımının analizini açıklar. Muhabir susturma, GFP'yi hedefleyen çift sarmallı RNA eksprese eden bakterilerin hayvanlarla beslenmesiyle başlatılır. Her nesilde, senkronize gelişimi sürdürmek için hayvanlar geçirilir ve raportör gen susturma mikroskopi ile belirlenir. Seçilmiş nesillerde, GFP raportör lokusunda histon modifikasyon zenginleşmesini ölçmek için kromatin immünopresipitasyon (ChIP)-kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) için popülasyonlar toplanır ve işlenir. RNAi kalıtımını incelemek için bu protokol, küçük RNA ve kromatin yolaklarındaki TEI faktörlerini daha fazla araştırmak için kolayca değiştirilebilir ve diğer analizlerle birleştirilebilir.

Germ hattı ile eksprese edilen GFP-histon H2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 raportörünü taşıyan hayvanlar (Şekil 2A) beslenerek GFP RNAi'ye veya kontrol RNAi'ye maruz bırakıldı ve protokolde ve Şekil 1'de açıklandığı gibi geçti. Germ hattındaki nükleer GFP sinyali, her nesildeki popülasyonun bir örneği için bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak manuel olarak puanlandı. Transgenin susturulması, GFP RNAi ile tedavi edilen skorlanmış P0 ve F1 hayvanlarında tamamen nüfuz ediciydi (Şekil 2B). F2 neslinde, GFP susturma kalıtımı sergileyen popülasyonun oranı yaklaşık% 50 idi. F5 kuşağı tarafından, popülasyonun çoğunluğu susturma kalıtımı göstermedi ve F10 kuşağı tarafından, tüm hayvanlar GFP'yi ifade ettiği için kalıtım tespit edilmedi.
RNAi ile indüklenen susturmaya karşılık gelen histon H3K9me3 zenginleşmesindeki değişikliği belirlemek için, GFP RNAi veya kontrol RNAi tedavisini takiben F1 nesil hayvanlarda ChIP-qPCR gerçekleştirildi. Beklendiği gibi, GFP RNAi ile tedavi edilen popülasyon, kontrol RNAi ile tedavi edilen hayvanlara kıyasla GFP hedefinde ve 1.3 kb aşağı akış bölgesinde daha yüksek histon H3K9me3 seviyeleri sergiledi (Şekil 2C). Histon H3K9me3 ChIP'nin özgüllüğü, bu işarette zenginleştirildiği bilinen, ancak yakındaki bir negatif kontrol lokusunda (hrp-2) olmayan bir pozitif kontrol lokusunda (clec-18) zenginleştirme ile desteklenir. Beklendiği gibi tüm qPCR lokuslarında histon H3 zenginleşmesi ve IgG kontrol immünopresipitasyonlarında arka plana yakın zenginleşme de tespit edildi. Raportördeki ChIP zenginleştirmesi clec-18 pozitif kontrol lokusuna normalleştirildiğinde, GFP RNAi üzerinde daha yüksek histon H3K9me3 zenginleşmesi gösterilirken, histon H3 zenginleştirmesi kontrol ve GFP RNAi tedavileri arasında benzerdir (Şekil 2D). GFP RNAi'nin clec-18 lokusundaki histon H3K9me3 veya toplam histon H3 doluluğunu etkilemesi beklenmediğinden, bu normalizasyon, GFP RNAi ve kontrol RNAi numuneleri arasındaki ChIP verimliliğindeki farklılıklar gibi teknik varyasyonlara karşı hafifletir. RNAi tedavileri arasında histon H3K9me3 ve histon H3 seviyelerinin kat değişimi, GFP RNAi kaynaklı susturma üzerine histon doluluğundan bağımsız olarak GFP muhabirine özgü histon H3K9me3 zenginleşmesini gösterir (Şekil 2E).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65285/65285fig02.jpg"> Şekil 2: GFP RNAi kaynaklı susturma, RNAi hedefinde yüksek H3K9me3 zenginleşmesine karşılık gelir. (A) qPCR amplikon bölgeleri etiketli germ hattı ile eksprese edilen GFP RNAi raportörü mjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR] diyagramı. (B) GFP ekspresyonu, 21 ° C'de RNAi tedavilerinden sonra nesiller boyunca puanlandı. Hata çubukları, iki biyolojik kopyadan standart sapmayı temsil eder. (C) İki biyolojik kopyadan F1 genç yetişkinlerde H3K9me3, histon H3 ve IgG kontrolünün ChIP-qPCR'si. clec-18 ve hrp-2, sırasıyla H3K9me3 zenginleştirmesi için pozitif ve negatif kontrol lokuslarıdır. (D) GFP RNAi raporlayıcısında H3K9me3 ve histon H3 zenginleşmesi, clec-18 pozitif kontrol lokusuna normalize edildi. (E) CLEC-18'e normalizasyon ile GFP RNAi ve kontrol RNAi ile tedavi edilen hayvanlar arasında H3K9me3 ve histon H3 zenginleşmesinde değişiklik. Noktalı çizgi, 1'lik bir katlama değişimini temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65285/65285fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, C. elegans'ta RNAi kaynaklı susturma ve ilişkili kromatin modifikasyonlarının epigenetik kalıtımını incelemek için bir RNA girişimini ve ChIP testini açıklar.

Nesiller Arası Epigenetik Kalıtımın Analizi C. elegans Floresan Raportör ve Kromatin İmmünopresipitasyon (ChIP) Kullanılarak

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...

Laboratuvarımızdaki araştırmalar, kromatinle ilişkili proteinlerin, histon modifikasyonlarının ve küçük RNA yolu faktörlerinin gelişim ve nesiller arası epigenetik kalıtım bağlamında birlikte nasıl çalıştığını incelemektedir. Bir GFP raportörü kullanan RNA kalıtım testi çok güçlü bir araç haline geldi. Bu protokol, solucanların hazırlanmasının, puanlanmasının ve geçirilmesinin ve tekrarlanabilir sonuçların üretilmesine yardımcı olabilecek ChIP örneklerinin hazırlanmasının nasıl standartlaştırılacağını açıklar.Germ hattı ile eksprese edilen transgenleri incelerken karşılaşılan deneysel zorluklardan biri, hayvanın germ hattındaki etkileri izole etmektir. Şu anda ChIP için bütün hayvanları kullanıyoruz, ancak gelecekte, özellikle germ hattında kromatini incelemek için tahliller geliştirmek istiyoruz. Laboratuvarımız histon metilasyonu ve bu işaretleri tanıyan proteinler ile ilgilenmektedir.İleriye dönük olarak, transgenlerde RNAi kalıtımı ve endojen dizilerin düzenlenmesi bağlamında bu kromatin okuyucuları ve küçük RNA yolları arasındaki etkileşimi araştırmak istiyoruz.

analysis-transgenerational-epigenetic-inheritance-c-elegans-using

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Bu makale, nematod embriyogenezisin erken olayların görselleştirme için kullanılan bir...

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Bu protokol, ultraviyole (UV) ışınlaması kullanılarak transgenik ekstrakromozomal dizilerin Caenorhabditis elegans genomuna entegrasyonu için hızlı ve düşük malzeme tüketen bir prosedürü tanımlar. Ayrıca, bu protokol özellikle ekstrakromozomal dizileri yüksek oranda ileten transgenik hatlar için çok uygundur.

Yüksek İletim Hızına Sahip Ekstrakromozomal Dizileri C. elegans Genomuna Entegre Etmek İçin Hızlı Bir Protokol

Germ hattı toksisitesini değerlendirmek için kullanılan nematod Caenorhabditis elegans'ta yüksek verimli bir kimyasal testin ayrıntılı adımlarını açıklıyoruz. Bu tahlilde, kimyasal maruziyeti takiben germ hattı fonksiyonunun bozulması, anöploid embriyolara özgü bir floresan raportör kullanılarak izlenir.

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Kromatin çevre düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu için gerekli temel bir işlemdir. Burada, biz gen ekspresyonu kromatin değiştirme alımı yoluyla kontrol etmek için bir yöntem tarif gene özgü ve geri dönüşümlü bir şekilde makine.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Bu yöntem hücre hatlarında ÇHC2 aracılı kromatin etki alanlarının oluşumunu takip etmek için tasarlanmıştır ve yöntem diğer birçok sistemlere uyarlanabilir.

Kromatin Etki Alanlarının De novo Oluşumunu İnceleme Yöntemi

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Caenorhabditis elegans'ın mikrosporidian parazit Nematocida parisii tarafından enfeksiyonu, solucanların aynı patojene karşı oldukça dirençli yavrular üretmesini sağlar. Bu, kötü anlaşılmış bir epigenetik fenomen olan kalıtsal bağışıklığın bir örneğidir. Mevcut protokol, genetik olarak izlenebilir bir solucan modelinde kalıtsal bağışıklığın incelenmesini açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans Mikrosporidia Enfeksiyonu Modelinde Kalıtsal Bağışıklığın İncelenmesi

Burada, model nematod C. elegans'ın germ hattında eksprese edilen genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum raportörü kullanarak döllenme ve erken embriyogenez sırasında kalsiyumu görselleştirmek için protokoller ve araçlar sunuyoruz.

C. elegans'ta Döllenme ve Erken Gelişim Sırasında Kalsiyum Geçişlerinin İn Vivo Olarak Görüntülenmesi

Burada, sadece 30 μL solucan pelleti kullanılarak L4-aşama Caenorhabditis elegans tüm solucanında uygulanacak hızlı ve basit bir ATAC-seq protokolünü sunuyoruz.

Bütün Caenorhabditis elegans L4 larvalarda kromatin erişilebilirlik profili

Caenorhabditis elegans germ hattında endogen floresan etiketleme için CRISPR/Cas9 mikroenjeksiyon iş akışı, in vivo protein lokalizasyon analizi için homozigot knock-in çizgileri elde etmek.

Caenorhabditis elegans'ta CRISPR/Cas9 aracılı Endojen Floresan Etiketleme Germline-Spesifik Genlerin

Öğrenin C. elegans'ta RNAi kalıtımını ve kromatin modifikasyonlarını floresan raportör ve ChIP kullanarak incelemeyi. Bu yöntem epigenetik araştırmalarda tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

Nesiller Arası Epigenetik Kalıtımın Analizi C. elegans Floresan Raportör ve Kromatin İmmünopresipitasyon (ChIP) Kullanılarak

Daha fazla video keşfet