Name: Antikor Bazlı Terapötik Moleküllerin Kütle Hesaplaması için Açık Kaynaklı Bir Çerçeve (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Keşfedin, monoklonal antikor bazlı terapötik proteinler için mAbScale yazılımı ile doğru kütle hesaplaması yapmayı. Bu açık kaynak çerçeve, biyofarmasötik geliştirmede verimliliği artırır ve hassasiyeti sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, veri doğrulama konusundaki yardımı için Robert Schuster'e teşekkür eder.

mAbScale için üst düzey iş akışı Şekil 2'de gösterilmiştir. Her adımın daha karmaşık iç karar dalları, döngüleri ve kombinatorikleri vardır. Hesaplama sürecini açıklayan ayrıntılı bir algoritmik iş akışı Ek Şekil 1'de sunulmuştur. Uygulama çıktısı, kullanıcı tarafından seçilen klasöre bir elektronik tablo biçiminde kaydedilir. Çıktı dosyası, kullanıcı girişi, moleküler ağırlık hesaplamaları ve ortalama izotopik kütle türevleri için referanslar olarak kategorize edilebilen birden çok ayrı çalışma sayfasından oluşur (örnek çıktı ek tablolarda verilmiştir). Kullanıcı girişi çalışma sayfaları, protein amino asit dizilerini ve kullanıcı tarafından girilen diğer bilgileri, temel bileşimi ve farklı moleküler ağırlıkları hesaplamak için kullanılan ortalama element kütlelerini ve glikan kütlelerini içerir. Moleküler ağırlık hesaplama sayfaları, çeşitli formların kimyasal bileşimini, glikozilasyon ve kimyasal modifikasyon ile ve olmadan indirgenmiş kütleyi ve glikozilasyon ve kimyasal modifikasyon ile ve olmadan bozulmamış kütleyi içerir. Yarı antikorlar, istenen heterodimere göre tanımlanması ve ölçülmesi gereken birincil safsızlıklar olduğundan, kullanıcı kullanıcı giriş sayfasına iki farklı HC ve/veya iki farklı LC girerse, yarı antikor kütleleri içeren sayfalar otomatik olarak oluşturulacaktır. mAbScale kaynak koduna aşağıdaki depodan erişilebilir: https://github.com/kkhatri99/mAbScale.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig02.jpg"> Şekil 2: Uygulamayı kullanarak temel bileşimlerin ve kütlelerin hesaplanmasında yer alan adımlara genel bakış. Renk kodlaması, Ek Şekil 1'de açıklanan süreç akışına bağlanmak için kullanılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
1. mAbscale uygulamasını açma
<ol><li>Yürütülebilir dosyanın simgesine çift tıklayarak yazılım uygulamasını açın.</li>
</ol>2. Sıra girişi
<ol><li>Ağır zincir ve hafif zincir dizilerini 1 ile işaretlenmiş ilgili metin kutularına boşluk bırakmadan girin.<ol><li>bsAb'ler için, 2 ile işaretlenmiş ikinci metin kutusu kümesine ek ağır veya hafif zincirler ekleyin. Aynı ağır zincirlere ve hafif zincirlere sahip mAb'ler için 2'yi boş bırakın.</li>
		<li>Bu ağır zincir terminal varyantları uygunsa, N-Terminal Cyclization ve/veya C-Terminal Clipping onay kutularını işaretleyin.</li>
		<li>ADC molekülleri için bağlayıcı ve yük dahil olmak üzere tüm kimyasal modifikasyonları Ağır Zincir Kimyasal Mod ve/veya Hafif Zincir Kimyasal Mod metin kutularına ekleyin.<ol><li>Değişiklikleri, CaCl2 gibi temel bileşimler olarak belirtin. Modifikasyon, ilgili protein alt birimine veya zincirine eklenecektir. NOT: Bir kimyasal bileşim, temel bileşimin önüne bir - işareti eklenerek bir alt birimden veya zincirden de çıkarılabilir. Örneğin, -H2O, bir su molekülünü alt birim bileşiminden ve kütlesinden çıkaracaktır.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Disülfür bağlarının sayısının belirtilmesi
<ol><li>Toplam Disülfür Sayısı olarak işaretlenmiş metin kutusunda protein moleküllerindeki disülfid bağlarının sayısını belirtin.</li>
	<li>İndirgenmemiş HC disülfidlerin sayısını İndirgenmemiş HC disülfitler metin kutusuna ve indirgenmemiş LC disülfitlerin sayısını İndirgenmemiş LC disülfitler metin kutusuna girin, indirgeme derecesine bağlı olarak (tam ve kısmi). NOT: mAb alt birimlerinin indirgenmiş kütle analizi, disülfüre bağlı ağır ve hafif zincirlerin indirgenmesini/ayrılmasını içerir.</li>
	<li>mAb hafif zincirinde glikozilasyon varsa, Hafif Zincir Glikosile Edildi onay kutusunu işaretleyin.</li>
</ol>4. Çıktı klasörünü ayarlama ve uygulamayı çalıştırma
<ol><li>Çıktı Klasörü metin kutusu için bir çıktı klasörü seçmek üzere Gözat düğmesine tıklayın.</li>
	<li>Çıktı dosyası adını dosya uzantısı olmadan (otomatik olarak .xlsx olarak kaydedilir) Excel Dosyası (dahili yok) metin kutusuna girin.</li>
	<li>Uygulamayı başlatmak için Gönder düğmesine tıklayın. Çıktı dosyası belirlenen klasörde bulunabilir. NOT: Temel kütleler ve glikanların listesi, sırasıyla (Ek Kodlama Dosyası 1) ve Glikan .csv (Ek Kodlama Dosyası 2) Element_Mass.csv sınırlandırılmış metin dosyaları düzenlenerek özelleştirilebilir. Uygulamanın yürütülmesi için bu dosyaların mAbScale.exe (Ek Kodlama Dosyası 3) yürütülebilir dosyasıyla aynı klasöre yerleştirilmesi gerekir. Uygulama, bir yürütmeden sonra otomatik olarak kapatılacaktır. İkinci bir hesaplama gerekiyorsa kullanıcının uygulamayı yeniden başlatması gerekir.</li>
</ol>

Biyoterapötik Varlıkların Doğru Kütle Hesaplaması için Python Tabanlı Bir Araç

<ol><li>Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+trends+for+monoclonal+antibody+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).</li>
<li>Kintzing, J. R., Filsinger Interrante, M. V., Cochran, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+for+developing+next-generation+protein+therapeutics+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies for developing next-generation protein therapeutics for cancer treatment.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 37 (12), 993-1008 (2016).</li>
<li>Wang, M. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2%3A+Structure%2C+biology%2C+and+structure-based+therapeutics+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2: Structure, biology, and structure-based therapeutics development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269(2020).</li>
<li>ICH Q8 (R2) Pharmaceutical Development - Scientific Guideline. European Medicines Agency. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline">https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline</a> (2018).</li>
<li>Donnelly, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+and+benchmarks+for+intact+protein+analysis+for+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Best practices and benchmarks for intact protein analysis for top-down mass spectrometry.</a> Nature Methods. 16 (7), 587-594 (2019).</li>
<li>Gadgil, H. S., Pipes, G. D., Dillon, T. M., Treuheit, M. J., Bondarenko, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+mass+accuracy+of+high+performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+of+intact+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Improving mass accuracy of high performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry of intact antibodies.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 17 (6), 867-872 (2006).</li>
<li>Beck, A., Sanglier-Cianférani, S., Van Dorsselaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosimilar%2C+biobetter%2C+and+next+generation+antibody+characterization+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biosimilar, biobetter, and next generation antibody characterization by mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4637-4646 (2012).</li>
<li>Camperi, J., Goyon, A., Guillarme, D., Zhang, K., Stella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-dimensional+LC-MS%3A+the+next+generation+characterization+of+antibody-based+therapeutics+by+unified+online+bottom-up%2C+middle-up+and+intact+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Multi-dimensional LC-MS: the next generation characterization of antibody-based therapeutics by unified online bottom-up, middle-up and intact approaches.</a> Analyst. 146 (3), 747-769 (2021).</li>
<li>Liu, H., May, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide+bond+structures+of+IgG+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Disulfide bond structures of IgG molecules.</a> mAbs. 4 (1), 17-23 (2012).</li>
<li>Jakes, C., Füssl, F., Zaborowska, I., Bones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+biotherapeutics+using+protein+a+chromatography+coupled+to+orbitrap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of biotherapeutics using protein a chromatography coupled to orbitrap mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (40), 13505-13512 (2021).</li>
<li>Robotham, A. C., Kelly, J. F. Chapter 1 - LC-MS characterization of antibody-based therapeutics: Recent highlights and future prospects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobotham%2C+AC+%22Approaches+to+the+Purification%2C+Analysis+and+Characterization+of+Antibody-Based+Therapeutics%22">Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics</a>. Matte, A. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 1-33 (2020).</li>
<li>Valeja, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+mass+baseline+resolution+for+an+intact+148+kDa+therapeutic+monoclonal+antibody+by+fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Unit mass baseline resolution for an intact 148 kDa therapeutic monoclonal antibody by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8391-8395 (2011).</li>
<li>Fornelli, L., Ayoub, D., Aizikov, K., Beck, A., Tsybin, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle-down+analysis+of+monoclonal+antibodies+with+electron+transfer+dissociation+orbitrap+fourier+transform+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Middle-down analysis of monoclonal antibodies with electron transfer dissociation orbitrap fourier transform mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (6), 3005-3012 (2014).</li>
<li>Berglund, M., Wieser, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+compositions+of+the+elements+2009+%28IUPAC+Technical+Report%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pure+and+Applied+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isotopic compositions of the elements 2009 (IUPAC Technical Report).</a> Pure and Applied Chemistry. 83 (2), 397-410 (2011).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ame2012+atomic+mass+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Physics+C%22%5BJournal%5D)">The Ame2012 atomic mass evaluation.</a> Chinese Physics C. 36 (12), 1603-2014 (2012).</li>
<li>Peri, S., Steen, H., Pandey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPMAW--A+software+tool+for+analyzing+proteins+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">GPMAW--A software tool for analyzing proteins and peptides.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (11), 687-689 (2001).</li>
<li>Tipton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+intact+protein+isoforms+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (29), 25451-25458 (2011).</li>
<li>De Leoz, M. L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interlaboratory+study+on+glycosylation+analysis+of+monoclonal+antibodies%3A+Comparison+of+results+from+diverse+analytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">interlaboratory study on glycosylation analysis of monoclonal antibodies: Comparison of results from diverse analytical methods.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 19 (1), 11-30 (2020).</li>
<li>Cymer, F., Beck, H., Rohde, A., Reusch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+monoclonal+antibody+N-glycosylation+-+Structure%2C+function+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Therapeutic monoclonal antibody N-glycosylation - Structure, function and therapeutic potential.</a> Biologicals. 52, 1-11 (2018).</li>
<li>Baker, P. R., Trinidad, J. C., Chalkley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+site+localization+scoring+integrated+into+a+search+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Modification site localization scoring integrated into a search engine.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10 (7), (2011).</li>
<li>Chalkley, R. J., Clauser, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+site+localization+scoring%3A+Strategies+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Modification site localization scoring: Strategies and performance.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (5), 3-14 (2012).</li>
</ol>

Bu yazılım Apache 2.0 lisansı altında yayınlanmaktadır. Telif Hakkı (2022) GlaxoSmithKline Research & Development Limited'e aittir. Tüm hakları saklıdır. Apache Lisansı, Sürüm 2.0 ("Lisans") kapsamında lisanslanmıştır; bu dosyayı Lisansa uygun olmayan bir şekilde kullanamazsınız. Lisansın bir kopyasını http://www.apache.org/licenses/LICENSE-2.0 adresinden edinebilirsiniz. Yürürlükteki yasalar gerektirmedikçe veya yazılı olarak kabul edilmedikçe, Lisans kapsamında dağıtılan yazılım, açık veya zımni herhangi bir garanti veya koşul olmaksızın "olduğu gibi" dağıtılır. Lisans kapsamındaki izinleri ve sınırlamaları yöneten belirli diller için Lisansa bakın. L.C. bir GlaxoSmithKline (GSK) çalışanıdır. T.H. ve K.K. bu yazılımı GSK'nın çalışanları olarak geliştirdiler ve şu anda sırasıyla Merck ve Moderna'nın ortakları.

mAbScale, kütle ve element hesaplamaları için yapı taşlarını değiştirme esnekliğine sahip sezgisel bir kullanıcı arayüzü sağlar. Kullanıcıların, uygulamayı kullanmak, doğru kütleleri elde etmek ve sonuçları yorumlamak için hedef molekül hakkında temel bir anlayışa sahip olmaları beklenir. Örneğin, bozulmamış veya azaltılmış kütle çıktı sayfası, çok sayıda bozulmamış veya azaltılmış kütle sırası nedeniyle bunaltıcı olabilir, çünkü varsayılan glikan veritabanı, terapötik antikorların Fc kısmında yaygın olarak bulunan 88 N-...

Son yirmi yılda, biyoterapötikler modern ilaç endüstrisinin temel dayanağı haline geldi. SARS-CoV2 salgını ve yaşamı tehdit eden diğer koşullar, biyofarmasötik moleküllerin daha hızlı ve daha geniş bir şekilde geliştirilmesine olan ihtiyacıdaha da artırmıştır 1,2,3.
Biyoterapötik moleküler ağırlık, diğer analitik tahlillerle kombinasyon halinde molekülün tanımlanması için kritik öneme sahiptir. Sağlam ve azaltılmış alt birim kütleleri, QTPP'de (Kalite Hedef Ürün Profili)4 açıklandığı gibi, kaliteyi korumayı amaçlayan kontrol stratejilerinin bir parçası olarak keşif ve geliştirme yaşam döngüleri boyunca kullanılır.
Biyofarmasötik endüstrisindeki analitik gelişme, büyük ölçüde bozulmamış kütle analizi için kütle ölçümlerine ve peptit haritalama veya çok özellikli yöntem (MAM) izleme kullanılarak derin karakterizasyona dayanır. Modern kütle spektrometresi (MS) platformlarını kullanan bu tekniklerin merkezinde, yüksek çözünürlüklü doğru kütle (HR/) ölçümleri sağlama yeteneği vardır. Çoğu HR/cihazı, kütle aralığına göre ölçeklenen 0,5-5 ppm aralığında kütle doğruluğu sağlar. Bozulmamış büyük moleküller için kütleleri doğru bir şekilde ölçme yeteneği, büyük moleküllü terapötiklerin hızlı ve güvenli bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Büyük moleküller için tipik deney koşulları (&gt;10 kDa) kullanılarak izotopik çözünürlük elde edilemediğinden, karşılaştırma ve tanımlamaiçin ortalama kütleler hesaplanmalıdır 5,6.
Tipik bir bozulmamış veya alt birim protein kütle spektrumu, translasyon sonrası modifikasyonlardan (PTM) kaynaklanan çeşitli moleküler formlar ve klipler veya dizi varyantları gibi herhangi bir birincil yapı farklılığı hakkında kompozit bilgiler içeren genel proteoform profilini temsil eder. Bu ölçümlerin nispeten kolay ve yüksek verimli doğası, onları karakterizasyon ve proses içi izleme kontrolleri için çekici kılmaktadır 7,8. Bu deneyler için veri analizi genellikle kullanıcının moleküler formlar (PTM'ler veya diğer moleküler formlar aralığı) için arama alanını tanımlamasını gerektirir. Glikosile edilmiş proteinler için, bu arama alanı büyük ölçüde glikoform heterojenliği tarafından yönlendirilir. Çoklu PTM'lerin, disülfür bağ konfigürasyonlarının ve birincil yapı boyunca diğer varyasyonların kombinasyonları, olası tüm moleküler formların hesaplanmasını sıkıcı bir görev haline getirir. Bu nedenle, olası moleküler formların manuel olarak hesaplanması, insan hatası potansiyeli yüksek, zaman ve kaynak tüketen bir süreçtir.
Burada, mAbs, bsAbs, ADC'ler vb. gibi biyoterapötik moleküllerin en önemli özellikleri göz önünde bulundurularak geliştirilmiş bir kütle hesaplama aracı sunuyoruz. Araç, kütlelerin ve temel bileşimlerin tutarlı bir şekilde hesaplanması için arama alanı değişkenlerinin kolayca birleştirilmesine olanak tanır. Bu aracın modüler yapısı, daha da geliştirilmesini ve diğer modaliteler için kütle hesaplaması ve kütle eşleştirmesine uygulanmasını sağlayacaktır.
GUI modülü, kullanıcının Şekil 1'de gösterildiği gibi kütle hesaplaması için girişi belirlemesine izin verir; Spesifik olarak, kullanıcı hafif ve ağır antikor zincirleri için tek harfli amino asit dizileri girer. Ağır zincirli N-terminal siklizasyonu ve C-terminal lizin kırpma için yaygın değişiklikler onay kutuları olarak dahil edilmiştir. Ayrıca, kimyasal formül/element bileşimi, ilgili Chem Mod metin kutusu aracılığıyla bu protein zincirlerine eklenebilir/çıkarılabilir. Bu, kullanıcıya, bir ADC durumunda birden fazla translasyon sonrası modifikasyon veya küçük moleküllü bir yük içeren bir temel bileşim ekleme esnekliği sağlar. Çoğu terapötik mAb, hafif zincirdeki glikozilasyon bölgelerini uzaklaştırmak için tasarlandığından, hafif zincirdeki glikozilasyon isteğe bağlı bırakılır ve GUI'deki bir onay kutusu kullanılarak belirtilebilir.
Antikorlar için bozulmamış kütle analizinin tipik bir varyasyonu, zincirler arası disülfür bağlarını azaltarak hafif zincirin ağır zincirden ayrıldığı indirgenmiş bir alt birim kütle analizidir. Kullanılan indirgeyici ajanın gücüne bağlı olarak, zincir içi disülfür bağları parçalanabilir veya bölünmeyebilir. Kullanıcılar, IgG alt tipine bağlı olarak veya sistein konjuge ADC9 durumunda toplam disülfür bağı sayısını girme esnekliğine sahiptir.
Uygulama, kütleleri aşağıdan yukarıya doğru hesaplar, burada temel bileşimler ilk olarak bireysel ağır zincirler ve hafif zincirler için hesaplanır. Daha sonra, ağır zincir (HC) N-terminal siklizasyonu Lys-clipping, hesaplanan temel bileşimlerin ayarlanmasıyla hesaba katılır. Belirtilen herhangi bir kimyasal modifikasyon daha sonra ağır ve/veya hafif zincirlere uygulanır. Analizin türüne ve kullanıcı tarafından belirtilen disülfür-bağ modellerine bağlı olarak, iki polipeptit zinciri için hidrojen sayısı ayarlanır. Glikosile HC ve hafif zincir (LC) (isteğe bağlı) kütleleri, kullanıcının girdisine göre hesaplanır. Son olarak, birden fazla HC ve LC kütlesi birleştirilir ve bozulmamış kütle hesaplaması için disülfür bağ numaraları otomatik olarak güncellenir.
Bozulmamış proteinler gibi daha büyük moleküllerde, tipik çözme gücüne sahip kütle spektrometreleri kullanılırken ilave kütle kusuru nedeniyle monoizotopik kütleler ölçülemez. Bunun yerine, nominal veya ortalama kütlelerölçülür veya rapor edilir 5,10,11,12,13. Ortalama temel kütleler, küratörlüğünde kütleler14,15 için kullanılan kaynağa göre değişebilir. Element kütlelerindeki farklılıklar küçük olsa da, büyük moleküllü moleküler ağırlık hesaplamaları için önemli değerler ekleyebilirler. Yazılım uygulamasında varsayılan olarak kullanılan ortalama element kütleleri Ek Tablo 1'de gösterilmektedir. Biyofarmasötik araştırma ve geliştirme (Ar-Ge) alanı gibi düzenlenmiş ortamlar için, tutarlı moleküler kütlelerin korunması önemlidir, çünkü kütlelerdeki değişiklikler, düzenleyici başvurular sırasında moleküler varlıkta değişiklikler anlamına gelebilir. Element kütlelerinin kullanımında tutarlılığı sağlamak için, yazılım aracına virgülle ayrılmış değer (csv) metin dosyası olarak bir element kütleleri sözlüğü eklenmiştir: Element_Mass.csv (Ek Kodlama Dosyası 1). Benzer şekilde, mAb'lerde tipik olarak görülen glikan bileşimlerinin küratörlüğünde bir listesi dahil edilmiştir: Glikan.csv (Ek Kodlama Dosyası 2). Her iki dosya da çalıştırılabilir bir uygulamayla aynı klasör konumuna kaydedilir ve kullanıcı tarafından belirli bir temel kütle listesi veya glikan kitaplığı kullanacak şekilde değiştirilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig01.jpg"> Şekil 1: mAbScale uygulaması için GUI arayüzü. GUI modülü, kullanıcının kütle hesaplaması için girişi belirlemesine izin verir. Kullanıcı, hafif ve ağır antikor zincirleri için tek harfli amino asit dizileri girer. Ağır zincirli N-terminal siklizasyonu ve C-terminal lizin kırpması için yaygın değişiklikler onay kutuları olarak dahil edilmiştir. Kimyasal formüller/temel bileşimler, ilgili Chem Mod metin kutusu aracılığıyla eklenebilir/çıkarılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>Beraat UPLC sistemi&nbsp;</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>N/A</td><td>Modüler sistem</td></tr><tr><td>Antikor-ilaç konjugatı (ADC)</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>N/A</td><td>Özel molekül</td></tr><tr><td>BEH 200 SEC sütunu&nbsp;</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>176003904</td><td></td></tr><tr><td>Bispesifik mAb</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>N/A</td><td>Tescilli molekül</td></tr><tr><td>Byos</td><td>Protein Metrikleri, Cupertino, CA</td><td>https://proteinmetrics.com/byos/ Sürüm 4.5</td><td></td></tr><tr><td>GPMAW</td><td>GPMAW</td><td>http://www.gpmaw.com/</td><td></td></tr> <tr><td>LC-MS sınıfı su&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>W6-1</td><td></td></tr><tr><td>mAb standardı&nbsp;</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>186009125</td><td>Waters İnsancıllaştırılmış mAb Kütle Kontrol Standardı</td></tr><tr><td>mAbScale</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>Apache Lisansı, Sürüm 2.0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-TOF kütle spektrometresi</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>N/A</td><td>Modüler sistem</td></tr></tbody></table>

antikor bazlı terapötik moleküllerin kütle hesaplaması için açık kaynaklı bir Çerçeve

An Open-Source Framework for Mass Calculation of Antibody-Based Therapeutic Molecules

Biyoterapötik kitleler, kimliği ve yapısal bütünlüğü doğrulamanın bir yoludur. Bozulmamış proteinlerin veya protein alt birimlerinin kütle spektrometresi (MS), biyofarmasötik gelişimin farklı aşamaları için kolay bir analitik araç sağlar. Proteinin kimliği, MS'den gelen deneysel kütle, teorik kütlenin önceden tanımlanmış bir kütle hatası aralığında olduğunda doğrulanır. Protein ve peptit moleküler ağırlıklarının hesaplanması için çeşitli hesaplama araçları mevcut olsa da, bunlar ya biyoterapötik varlıklara doğrudan uygulama için tasarlanmamıştır, ücretli lisanslar nedeniyle erişim sınırlamalarına sahiptir veya protein dizilerinin ana sunuculara yüklenmesini gerektirir. 
Monoklonal antikorlar (mAb), bispesifik antikorlar (bsAb) ve antikor-ilaç konjugatları (ADC) dahil olmak üzere terapötik glikoproteinlerin ortalama veya monoizotopik kütlelerinin ve temel bileşimlerinin kolayca belirlenmesini sağlayan modüler bir kütle hesaplama rutini geliştirdik. Bu Python tabanlı hesaplama çerçevesinin modüler yapısı, bu platformun gelecekte aşılar, füzyon proteinleri ve oligonükleotidler gibi diğer modalitelere genişletilmesine izin verecektir ve bu çerçeve, yukarıdan aşağıya kütle spektrometrisi verilerinin sorgulanması için de yararlı olabilir. Grafik kullanıcı arayüzüne (GUI) sahip açık kaynaklı bağımsız bir masaüstü uygulaması oluşturarak, özel bilgilerin web tabanlı araçlara yüklenemediği ortamlarda kullanımla ilgili kısıtlamaların üstesinden gelmeyi umuyoruz. Bu makale, bu aracın, mAbScale'in algoritmalarını ve farklı antikor bazlı terapötik modalitelere uygulanmasını açıklamaktadır.

Farklı mAb tiplerini temsil etmek için çeşitli mAb'ler seçildi. Fc bölgesinde aynı ağır zincirlere, özdeş hafif zincirlere ve bir N-bağlı glikozilasyon bölgesine sahip geleneksel bir mAb'yi temsil etmek için ticari olarak temin edilebilen bir mAb standardı seçildi. Uygulama kullanımını genişletmek için ek bir hafif zincir N-bağlı glikozilasyona sahip bir mAb, bispesifik bir mAb ve bir antikor-ilaç konjugatı (ADC) mAb da seçildi. Bu örnek mAb'lerin kimyasal bileşimi, hesaplanan kütlesi, ölçülen kütlesi ve kütle hatası <st...

Bu makale, monoklonal antikor bazlı protein terapötikleri için kitlelerin hesaplanması için bir yazılım uygulaması olan mAbScale'in kullanımını açıklamaktadır.

Antikor Bazlı Terapötik Moleküllerin Kütle Hesaplaması için Açık Kaynaklı Bir Çerçeve

Biotherapeutic masses are a means of verifying identity and structural integrity. Mass spectrometry (MS) of intact proteins or protein subunits provides ...

Büyük protein molekülleri için doğru kütle hesaplamasının zorluğu, ölçümle ilişkili kütle kusurudur. Sonuç olarak, yalnızca ortalama kütleler ölçülebilir. Küçük elementel kütle farklılıkları birikebilir ve monoklonal antikorlar gibi büyük paraterapötik moleküllerde önemli tutarsızlıklara neden olabilir.Aracımız, MAP'ler, bispesifikler ve antikor ilaç konjugatları gibi antikor bazlı terapötikler için tutarlı kütle hesaplamasındaki zorluğu açıkça ele almaktadır. Ticari biyofarmasötik geliştirme alanındaki araştırmacılar, özel bilgilerin katılımı nedeniyle harici sunucularla iletişime bağlı olmayan manuel hesaplamalara veya araçlara güvenmek zorundadır. Mevcut araçlar ya bir lisans gerektirir ya da biyofarmasötik geliştirmenin özel ihtiyaçları göz önünde bulundurularak oluşturulmamıştır.MapScale, kullanıcılar ve geliştiriciler için kullanıcı dostu bir arayüz ve uyarlanabilir açık kaynak çerçevesi sunar. Element kütlelerinin ve değişiklik listelerinin birden çok versiyonunun korunmasını destekler ve hesaplamalarda tutarlılığı korumak için liste paylaşımına izin verir. Kod, özel bilgileri korumak için dahili sunucular veya kontrollü erişime sahip bulut tabanlı dağıtım kullanılarak kurumsal düzeyde paylaşılabilir.

an-open-source-framework-for-mass-calculation-antibody-based

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, bir akış odasındaki antijen-antikor etkileşimlerini incelemek için kütle fotometrisinin kullanımını gösteriyoruz. Odaklanmış ışık, moleküllerin kütlesine bağlı olarak farklı şekilde dağılır. Bir dedektör, saçılan ışığı toplar ve moleküler kütlelerle ilişkili olan çeşitli yoğunluklarda noktalar olarak girişim modelini oluşturur.

Antijen-antikor etkileşimlerini tek molekül düzeyinde incelemek için kütle fotometrisi

Bir yöntem olup, aynı anda antijenlere karşı yüz Faj gösterimli birleştirici sentetik antikor kütüphanelerinden, ölçeklenebilir, yüksek verimli seçimleri yürütmek için görsel eşliğinde tarif edilmektedir. Bu paralel yaklaşımı kullanarak, standart bağışıklık tahlillerinde işlevsel çeşitli antijenler için yüksek bir çekim ve özelliğe gösteren antikor fragmanları izole ettik.

Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

Bu protokol, bir memeli ekspresyon sistemi içinde terapötik bir antikor üretimini tarif eder. Tarif edilen yöntemler, afinite kromatografisi kullanılarak, büyük ölçekli kültür ve saflaştırma ayarlamak vektör DNA, kararlı transfeksiyonu ve bir insan embriyonik böbrek 293 hücre hattı serumsuz adaptasyon hazırlanmasını içerir.

Laboratuar ölçekli üretim ve terapötik bir antikor ile saflaştırılması

Antikor-conjugates için (ACs) birleştiğinde Viral kaynaklı peptidler, moleküler yükleri artan tümör hücre birikmesi ile teslim etme potansiyeli nedeniyle ivme kazanıyor bir yaklaşım var. Peptid konjügasyon, AC ve hücre içi yük birikimi ve tümör hedefleme değerlendirmek için ortak yöntemleri kullanarak, bu protokolü anahtar ilk geliştirme aşamalarında araştırmacılar yardımcı olur.

Antikor conjugates ilk değerlendirilmesi ile Viral kaynaklı peptidler hücresel birikimi artan ve tümör hedefleme artırmak için değiştirilmiş

Burada bağışıklık fenotipik ve fonksiyonel (hücre içi sitokin indüksiyon) değerlendirmek için bir tek hücreli proteomik yaklaşım tarif değişiklikler periferik tam kan örneklerinde, kitle sitometresi ile analiz.

Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

Lizin cyclopropene türevi antikorlar birleşmeyle antikor-uyuşturucu conjugates oluşturmak için tetrazine taşıyan moleküller siteye özgü, hızlı ve verimli bağlantı sağlar.

Genetik bir kanonik olmayan Amino asit antikor-uyuşturucu üretimi için kodlama Conjugates bir hızlı Bioorthogonal tepki

Burada, analiz ve görselleştirme yapısı ve bütün antikor kapsayacağını Anayasası için iletişim kuralları açıklar. Bu büyük yeni nesil sıralama kullanarak antikor RNA dizisi edinimi içerir.

Fare ve insan antikoru kapsayacağını tarafından yeni nesil sıralama

Bu çalışma, ilaç-peptit etkileşimlerini tanımlamak için bir strateji sunmayı amaçlamaktadır. Strateji, bir kuvars-kristal mikro denge (QCM) biyosensörüne dayanan ilaç tanıyan kısa peptitlerin biyopannasyonunu ve ardından ilaç tanıma ve ilaç bağlayıcı bölgelerin proteinler üzerinde ek açıklama için elde edilen bilgileri nicel olarak değerlendirmek için biyoinformatik analizini içerir.

İlaç-protein Etkileşimlerinin Küresel Doğrulanması için Biyosensör Tabanlı Yüksek Verimli Biyopanning ve Biyoinformatik Analiz Stratejisi

Burada, antitümör antikorların önemli bir kanser hücresi öldürme mekanizması olan ADCC mekanizmasını modüle eden bileşikleri tanımlamak için bir yöntem sunuyoruz. NK hücrelerinin sitotoksik etkisi, Trastuzumab varlığında meme kanseri hücre sferoidlerinde ölçülür. Görüntü analizi, sferoidlerdeki canlı ve ölü öldürücü ve hedef hücreleri tanımlar.

Bir Tümör Sferoid Modelinde Antikora Bağımlı Hücresel Sitotoksisitenin Ölçülmesi: İlaç Keşfi Uygulaması

Uyumlu esneklik proteini fonksiyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Burada, düzenli ve düzensiz protein işlevi sürücü hızlı yapısal değişiklikleri algılama için hidrojen döteryum değişimi bağlanmış zamana bağımlı elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi kullanılmasını tarif eder.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Keşfedin, monoklonal antikor bazlı terapötik proteinler için mAbScale yazılımı ile doğru kütle hesaplaması yapmayı. Bu açık kaynak çerçeve, biyofarmasötik geliştirmede verimliliği artırır ve hassasiyeti sağlar.

Antikor Bazlı Terapötik Moleküllerin Kütle Hesaplaması için Açık Kaynaklı Bir Çerçeve

Daha fazla video keşfet