Name: Sıçan Canlı İskelet Kası Liflerinde Mitokondriyal Yoğunluk ve Boyuna Dağılımın Konfokal Mikroskopi ile Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Keşfedin canlı sıçan iskelet kası liflerinde mitokondriyal yoğunluk ve boyuna dağılım analizini konfokal mikroskopi ile. Bu yöntem, fizyolojik ve patolojik koşullarda mitokondriyal yeniden şekillenmeyi anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Tıp Fakültesi ve Tecnologico de Monterrey Obezite Araştırma Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Şekil 3A , Scientific Image and Illustration yazılımı ile oluşturulmuştur.

Sıçan Kası Mitokondrisinin Konfokal Mikroskobik Analizi

<ol><li>Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+dynamic+mitochondrial+network%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Shaping the dynamic mitochondrial network.</a> BMC Biology. 12, 35(2014).</li>
<li>De Mario, A., Gherardi, G., Rizzuto, R., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondria in health and disease.</a> Cell Calcium. 94, 102357(2021).</li>
<li>Chang, C. R., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+mitochondrial+fission+through+modification+of+the+dynamin-related+protein+Drp1%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of mitochondrial fission through modification of the dynamin-related protein Drp1.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1201, 34-39 (2010).</li>
<li>Willingham, T. B., Ajayi, P. T., Glancy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+specialization+of+mitochondrial+form+and+function+in+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Subcellular specialization of mitochondrial form and function in skeletal muscle cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 757305(2021).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+subpopulations+and+heterogeneity+revealed+by+confocal+imaging%3A+possible+physiological+role%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial subpopulations and heterogeneity revealed by confocal imaging: possible physiological role.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1757 (5-6), 686-691 (2006).</li>
<li>Díaz-Vegas, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+increase+induced+by+RyR1+and+IP3R+channel+activation+after+membrane+depolarization+regulates+skeletal+muscle+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium increase induced by RyR1 and IP3R channel activation after membrane depolarization regulates skeletal muscle metabolism.</a> Frontiers in Physiology. 9, 791(2018).</li>
<li>Boncompagni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+are+linked+to+calcium+stores+in+striated+muscle+by+developmentally+regulated+tethering+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria are linked to calcium stores in striated muscle by developmentally regulated tethering structures.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (3), 1058-1067 (2009).</li>
<li>Reggiani, C., Marcucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+controversial+issue%3A+Can+mitochondria+modulate+cytosolic+calcium+and+contraction+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">A controversial issue: Can mitochondria modulate cytosolic calcium and contraction of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of General Physiology. 154 (9), e202213167(2022).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+T-tubules+and+reduced+synchrony+of+Ca2%2B+release+in+myocytes+from+chronically+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium.</a> Circulation Research. 102 (3), 338-346 (2008).</li>
<li>Al-Qusairi, L., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-tubule+biogenesis+and+triad+formation+in+skeletal+muscle+and+implication+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 26(2011).</li>
<li>Pérez-Treviño, P., Pérez-Treviño, J., Borja-Villa, C., García, N., Altamirano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+T-tubules+and+sarcoplasmic+reticulum+in+ventricular+myocytes+in+early+cardiac+hypertrophy+in+a+pressure+overload+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Changes in T-tubules and sarcoplasmic reticulum in ventricular myocytes in early cardiac hypertrophy in a pressure overload rat model.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (4), 1329-1344 (2015).</li>
<li>Celestino-Montes, A., Pérez-Treviño, P., Sandoval-Herrera, M. D., Gómez-Víquez, N. L., Altamirano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+role+of+T-tubules+disruption+and+decreased+SERCA2+on+contractile+dynamics+of+isolated+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Relative role of T-tubules disruption and decreased SERCA2 on contractile dynamics of isolated rat ventricular myocytes.</a> Life Sciences. 264, 118700(2021).</li>
<li>Song, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphaned+ryanodine+receptors+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Orphaned ryanodine receptors in the failing heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4305-4310 (2006).</li>
<li>Houzelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+mitochondrial+dynamics+in+relation+to+oxidative+capacity+and+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle mitochondrial dynamics in relation to oxidative capacity and insulin sensitivity.</a> Diabetologia. 64 (2), 424-436 (2021).</li>
<li>Call, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulk1-mediated+autophagy+plays+an+essential+role+in+mitochondrial+remodeling+and+functional+regeneration+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ulk1-mediated autophagy plays an essential role in mitochondrial remodeling and functional regeneration of skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 312 (6), C724-C732 (2017).</li>
<li>Fealy, C. E., Grevendonk, L., Hoeks, J., Hesselink, M. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondrial+network+dynamics+in+metabolic+disorders+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondrial network dynamics in metabolic disorders and aging.</a> Trends in Molecular Medicine. 27 (11), 1033-1044 (2021).</li>
<li>Rivera-Alvarez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+session+of+physical+activity+restores+the+mitochondrial+organization+disrupted+by+obesity+in+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">A single session of physical activity restores the mitochondrial organization disrupted by obesity in skeletal muscle fibers.</a> Life Sciences. 256, 117965(2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2022).</li>
<li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeconvolutionLab2%3A+An+open-source+software+for+deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy.</a> Methods. 115, 28-41 (2017).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes%2C+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes, and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).</li>
<li>Ma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%2C+mitochondrial+homeostasis%2C+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467(2020).</li>
<li>Meinild, L. A. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+training+increases+skeletal+muscle+mitochondrial+volume+density+by+enlargement+of+existing+mitochondria+and+not+de+novo+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Exercise training increases skeletal muscle mitochondrial volume density by enlargement of existing mitochondria and not de novo biogenesis.</a> Acta Physiologica. 222 (1), (2018).</li>
<li>Memme, J. M., Erlich, A. T., Phukan, G., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+and+mitochondrial+health%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exercise and mitochondrial health.</a> Journal of Physiology. 599 (3), 803-817 (2021).</li>
<li>Gan, Z., Fu, T., Kelly, D. P., Vega, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondrial+remodeling+in+exercise+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondrial remodeling in exercise and diseases.</a> Cell Research. 28 (10), 969-980 (2018).</li>
<li>Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relations+between+structure+and+function+in+rat+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers.</a> Journal of Cell Biology. 47 (1), 107-119 (1970).</li>
<li>Vincent, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+mitochondrial+ultrastructural+defects+in+mitochondria+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondria myopathy.</a> Scientific Reports. 6, 30610(2016).</li>
<li>Mishra, P., Varuzhanyan, G., Pham, A. H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+is+a+distinguishing+feature+of+skeletal+muscle+fiber+types+and+regulates+organellar+compartmentalization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics is a distinguishing feature of skeletal muscle fiber types and regulates organellar compartmentalization.</a> Cell Metabolism. 22 (6), 1033-1044 (2015).</li>
<li>Cheng, A. J., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+isolation%2C+and+measurement+of+force+and+myoplasmic+free+%5BCa2%2B%5D+in+fully+intact+single+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca2+] in fully intact single skeletal muscle fibers.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function%2C+structure%2C+and+intracellular+organization+in+situ+in+cardiomyocytes+and+skeletal+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal Muscles.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (4), 2252(2022).</li>
<li>Pawley, J. B. Fundamental limits in confocal microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22In%3A+Pawley%2C+J.+%28eds%29+Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">In: Pawley, J. (eds) Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. , Springer, Boston, MA. (2006).</li>
<li>Otsu, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+selection+method+from+gray-level+histogram%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+System+Man+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">Threshold selection method from gray-level histogram.</a> IEEE Transactions on System Man Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Jakobs, S., Stephan, T., Ilgen, P., Brüser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+of+mitochondria+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Light microscopy of mitochondria at the nanoscale.</a> Annual Review of Biophysics. 49, 289-308 (2020).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Mitokondri, yüksek tadilat kapasitesine sahip organellerdir. İçerikleri, yoğunlukları ve dağılımları, mitokondriyal dinamikler1 olarak bilinen mitokondriyal füzyon ve fisyon mekanizmalarının aktivasyonu ve mitokondriyal devir mekanizmaları arasındaki denge yoluyla hızla değiştirilebilir: mitokondriyal biyogenez ve özel mitokondri bozunma yolu, mitofaji21,22. Mitokondriyal içerik ve morfoloji, hücre tipine ve gelişim evresine göre değişebilir ve farklı fizyolojik ve patolojik uyaranlar altında yeniden şekillenebilir 17,22,23,24. Bu nedenle, mitokondriyal morfolojinin incelenmesi yarım yüzyıldan fazla bir süredir geçerlidir25. Özellikle, mitokondrinin elektron mikroskobu ile analizi, birçok çalışmada uygulanan standart teknik olmuştur26.
Konfokal mikroskopi ile yapılan floresan çalışmaları, farklı adaptif ve maladaptif koşullarda iskelet kasında mitokondrinin rolünün daha iyi anlaşılmasına yardımcı olabilecek, farklı lif derinliklerinde mitokondrinin canlı hücre görüntüleme kapasiteleri nedeniyle son birkaç yılda önem kazanmıştır27. Bu çalışmada, canlı iskelet kası liflerinde mitokondri yoğunluğu ve dağılımının konfokal mikroskopi ile analizi için bir metodoloji açıklanmaktadır. Canlı iskelet kası lifleriyle çalışmanın temel zorluklarından biri, izolasyon süreçlerinden mitokondriyal konfokal kayda kadar kasılmayı önlemektir. Bu amaca ulaşmak için, lifleri en az 2 saat boyunca gevşek tutmak için yüksek bir Mg ve ATP Relax çözeltisi17 kullanılır, bu da lif izolasyon işlemini, florofor yükünü ve konfokal mikroskopi ile mitokondriyal sinyalin alınmasını gerçekleştirmek için yeterli zaman verir. Protokolün kritik bir noktası, yüksek hassasiyet ve taze doku gerektirdiğinden liflerin mekanik olarak elde edilmesidir; Bununla birlikte, daha önce kullanılan ve bildirilen bu teknikle sıçan kasından canlı lif demetleri elde etmek mümkündür28. Bozulmamış liflerin elde edilmesi, hücre yapıları arasındaki metabolik ve fonksiyonel karışmayı koruyarak sarkolemmanın ve hücre içi ortamın korunmasına izin verir28,29.
Dokular veya sabit hücrelerle çalışmanın aksine, canlı hücre görüntüleme floresan görüntülerinin konfokal mikroskopi ile elde edilmesi, çeşitli deneysel koşulların etkisinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Mevcut protokol, mitokondriyal yoğunluk ve dağılımdaki değişiklikleri gerçek zamanlı olarak araştırmak ve burada Yalın ve Ob türevi lifler arasında sunulan örnekler gibi deney grupları arasındaki farklılıkları keşfetmek için kullanılabilir (Şekil 3 ve Şekil 4). Canlı hücre görüntülemenin, küçük hücre hasarı ile optimal çalışma koşullarının standartlaştırılması anlamına geldiği her zaman göz önünde bulundurulmalıdır. Çalışma süresi, kullanılan çözeltilerin kalitesi, elde etme parametreleri ve lazerlerin maruziyeti hassas bir şekilde kontrol edilmelidir. Bu nedenle, temel hususlar aşağıda belirtilmiştir.
Kas liflerinin mitokondrileri, lifin boyutu ve uzun lazer maruziyetinin neden olabileceği lifin hasarı nedeniyle konfokal mikroskopi ile tamamen uzunlamasına kaydedilemez. Bununla birlikte, bu teknik altında lifin temsili bir örneği kaydedilir. Bir sıçanın iskelet kası lifinin tüm kalınlığını konfokal mikroskopi ile kaydetmek mümkün olsa da, bu daha uzun bir kayıt süresi ve lazer ışınına maruz kalma anlamına gelir. Kontrol fareleri söz konusu olduğunda, bu kayıtlarla ilgili sorunlarla karşılaşılmamıştır. Bununla birlikte, patolojik koşullardan gelen lifler, Ob sıçanlarından elde edilen liflerde gözlemlendiği gibi hasara daha duyarlı olabilir. Sonuç olarak, farklı Z mesafelerinde elde edilen bir temsili konfokal görüntü yığınının elde edilmesi tercih edilir. Lif kalınlığının yalnızca bir bölümü kaydedildiğinde, mitokondriyal dağılım ve yoğunluk lif içindeki konumuna göre değişebileceğinden, test edilen tüm liflerde istifin aynı derinlikte alınması önerilir. IMF'nin temsili konfokal görüntülerini elde etmek için sinyalin 15 μm'nin üzerinde bir derinlikte alınması önerilir ve çevreye yakın olan SSM popülasyonlarından kaçınılır.
Konfokal edinim sırasında bazı önemli hususlar dikkate alınmalıdır. İlk olarak, büyütme, yüksek NA ve daldırma ortamı dikkate alınarak daldırma objektif merceğinin seçimi. Hücreler hidrofilik bir inkübasyon ortamında tutulduğundan, iyi bir sinyal elde etmek ve dokuyu derinlemesine taramak için inkübasyon ve daldırma ortamının kırılma indisi benzer olmalıdır. Genellikle suya daldırma objektif lensi kullanılarak elde edilir. Şekil 3 ve Şekil 4'ün konfokal görüntüleri 20x, 0.7 NA suya daldırma objektifi ile elde edildi. Bu amaç, fiberin tüm derinliğinde kaydedilmesine izin verir, ancak IMF'nin temsili konfokal görüntüleri, yüksek floresan yoğunluğu sinyali ve küçük fiber hasarı ile elde edilebildiğinden, 15, 18 ve 21 μm'de taramaya karar verildi. 40x ve daldırma ortamı olarak yağ gibi diğer büyütmeler düşünülebilir, ancak değerlendirilmesi gerekir.
İkinci olarak, görüntüleme elde etmek için piksel boyutu, fazla örneklemeyi (daha yüksek lazer maruziyeti) ve yetersiz örneklemeyi (daha az çözünürlüğe yol açar) önleyen uygun bir piksel boyutunun seçilmesine izin veren Nyquist teoremine göre hesaplanır30. Hesaplama, seçilen objektif merceğin özelliklerine ve dalga boyuna (~90 nm) bağlıdır. Yakınlaştırma ile ayarlanabilir; Bu nedenle, yalnızca bir yakınlaştırma ayarı optimum piksel boyutu30 sağlar. Bununla birlikte, pratikte, yakınlaştırma aynı zamanda analiz edilecek numunenin alanına da bağlıdır. Böylece dengeyi bulmak, Nyquist kriterine en yakın ve aynı zamanda analiz edilecek alana uyan bir piksel boyutuyla çalışmaya olanak tanır. Şekil 3 ve Şekil 4 , 150 ve 190 nm'lik bir piksel boyutuyla elde edildi, bu da fiberin ~50-80 μm olan tam genişliğinin analizine izin verdi.
Üçüncüsü, odak dışı ışığın dedektöre ulaşmasını önleyen uygun bir iğne deliği çapı kullanılmalıdır. Tipik olarak, 1 Airy,odak düzlemi 30'dan kaynaklanan fotonların ~%80'inin algılanmasına izin verdiği için en uygun iğne deliği boyutu olarak kabul edilir. Bununla birlikte, düşük floresan seviyeleri gösteren bazı lekeli biyolojik numuneler, iğne deliği artışıgerektirir 30. Şekil 3 ve Şekil 4'ün konfokal görüntüleri, daha düşük bir Airy ile yakalanan düşük sinyal nedeniyle 3 Airy iğne deliği boyutunda elde edildi. İğne deliği boyutunun arttırılmasından kaynaklanan sinyal yoğunluğundaki artışın, odak dışı yakalanan ışığın artması nedeniyle çözünürlüğün azalmasına yol açtığını dikkate almak önemlidir. Bu nedenle, mümkün olduğunca 1 havadara yakın bir iğne deliği boyutu kullanmanızı öneririz.
Yeterince elde edildiğinde, mitokondriyal yoğunluk ve dağılım hakkında nicel bilgi elde etmek için konfokal görüntüler işlenebilir. Ne olursa olsun, sinyalin nicelleştirilmesini iyileştirmek için eşiklemenin kritik işleme görüntüsü adımının analizden önce gerçekleştirilmesi gerekir. Bu önemli adım sırasında, mitokondri için pozitif pikselleri arka plandakilerden ayıran floresan yoğunluk değeri tanımlanır. Eşik, görüntünün histogramı biri arka plana, diğeri mitokondriye karşılık gelen iki tepe noktası gösterdiğinde, mitokondriyi temsil eden zirvenin Gauss uyumu ile tanımlanabilir. Bununla birlikte, görüntülerin her birinde her zaman iki modlu bir dağılım elde edilemez, bu nedenle diğer eşikleme yöntemlerinin uygulanması gerekir.
Bu protokolde, iki tepe noktası ayrılmadığında veya diğer tepe noktaları mevcut olduğunda eşik değerini bulmak için tasarlanmış parametrik olmayan ve denetimsiz bir yöntem olan Otsu'nun eşik uygulamasının uygulanması açıklanmaktadır31. Otsu, biyolojik-görüntü analizi için açık kaynaklı bir platform kullanılarak kolayca uygulanabilir; Bununla birlikte, diğer eşikleme yöntemleri test edilebilir. Tüm konfokal görüntülere aynı eşikleme yöntemi uygulanmalı ve her bir konfokal görüntü için bağımsız olarak hesaplanmalıdır. Eşiğin tüm yığına uygulanması yanlış sonuçlara yol açar. Eşikleme işleminden sonra ikili görüntüler elde edildikten sonra, mitokondriyal yoğunluk ve FFT analizi, bu protokolde açıklanan talimatlar izlenerek kolayca gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, niceleme hatalarına yol açacağından, çekirdekleri ve kılcal damarları dahil etmekten kaçınmak için her iki analizi de yaparken dikkatli olunmalıdır. Yoğunluk ile ilgili olarak, analiz edilecek piksellerden veya toplam alandan pikselleri veya çekirdeklerin veya kılcal damarların kapladığı alanı çıkarmak yeterlidir. Ek olarak, FFT analizi yapılırken, mitokondri sinyalinin düz olduğu doğrulanmalıdır. Tersine, mitokondri sinyali eğildiğinde, mitokondriyal uzunlamasına dağılımı temsil etmeyen profiller üretebilir ve yanlış FFT spektrum verileri verebilir. Ek olarak, görüntülerdeki gürültüyü azaltmak için bir ön işleme adımı uygulanabilir. Bu protokol, bir medyan filtre ve 2B evrişim çözme kullanan iki isteğe bağlı ön işleme adımını açıklar. Bu ön işleme yöntemlerinin görüntü ve mitokondriyal yoğunluk içeriği üzerindeki etkileri Ek Şekil S1'de sunulmuştur. Bu ön işlemlerin görüntü kalitesini iyileştirebilse de, belirli görüntü ayrıntılarının kaybolmasına da neden olabileceğini dikkate almak önemlidir. Bu nedenle, dikkatli kullanılmalı ve analiz edilen tüm görüntülere tutarlı bir şekilde uygulanmalıdır.
Avantajlarına rağmen, konfokal mikroskopi, edinim için en uygun koşullar uygulandığında 180-250 nm'lik bir yanal çözünürlük (XY) ile sınırlıdır32. Mitokondriyal çap ~ 200-700 nm'dir, konfokal mikroskobun kırınım sınırına yakındır; bu nedenle, alt mitokondriyal yapılar yeterince tespit edilemez33 ve bu protokolde gösterilen yoğunluk ve FFT analizleri ile değerlendirilemez. Stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM), uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) nanoskopisi veya yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) gibi diğer süper çözünürlüklü mikroskopi teknikleri, alt mitokondriyal yapıları çözmek için araştırılabilir32. Bu protokolde, mitokondriyal membran potansiyeline bağlı olan florofor TMRE kullanılarak mitokondrinin konfokal görüntüleri elde edilir. Bu nedenle, mitokondriyal floresan yoğunluğu, membran potansiyellerine göre değişebilir. Bu sorunun üstesinden gelmek için veri analizinden önce bir eşikleme işlemi gerçekleştirilir. Tanımlanmış bir eşiğin üzerindeki tüm pikseller, floresan değerlerinden bağımsız olarak mitokondriyal sinyal için pozitif olarak kabul edilir. Bununla birlikte, çok düşük zar potansiyeline sahip mitokondrinin bu teknikle çözülemeyeceğine dikkat edilmelidir. Bu nedenle, mitokondriyal protein içeriği miktarının tamamlayıcı çalışmaları önerilmektedir. TMRE kullanmanın bir avantajı, konfokal görüntülerin mitokondriyal membran potansiyel analizi için de kullanılabilmesidir, ancak karbonilsiyanür-p-triflorometoksifenilhidrazon (FCCP) gibi ayırma ajanları ile yeterli kontrollerin yapılması gerekir. Ek olarak, mitokondriyal yoğunluk ve dağılım analizi talimatları, membran potansiyellerinden bağımsız olarak mitokondriyi yükleyen mitokondri için yeşil floresan göstergeler kullanılarak elde edilebilir, ancak inkübasyon stratejisi ve konfokal edinim ayarlarının standartlaştırılması gerekir.
Mitokondri yapısının temel mitokondriyal ve hücresel fonksiyonlarla ilişkili olduğu göz önüne alındığında, burada açıklanan protokol, hastalık sırasında veya belirli bir stres hakaretiyle yeniden şekillenmeleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Enerji üretimi gibi mitokondri tarafından yönetilen iskelet kasının temel işlevlerinin daha iyi anlaşılmasına veya mitokondrinin kasılma-metabolizma eşleşmesi gibi diğer organellerle etkileşimde önemli bir rol oynamasına katkıda bulunabilir. Protokol talimatlarını takip etmek, canlı iskelet kasında mitokondriyal yoğunluğun ve dağılımın tahmin edilmesini sağlar. Protokol adımları, iskelet kası demeti diseksiyonu, konfokal mikroskopi taraması ve görüntü analizine odaklanan, ayrıntılı talimatların ve önemli hususların dahil edildiği üç ana aşamaya ayrılmıştır. Özellikle, protokol, kullanıcının gereksinimlerine göre fiber içinde tam mitokondriyal rekonstrüksiyon için ek Z adımlarını keşfetmek üzere daha da optimize edilebilir. Örneğin, konfokal görüntü ve analiz adımları, canlı ve sabit numunelerde TT gibi benzer dağılıma sahip hücresel yapıları incelemek için test edilebilir.

Mitokondri, esas olarak uzaması (füzyon) ve parçalanması (fisyon) arasındaki denge ile düzenlenen oldukça dinamik ağlar oluşturur.1,2, Mitofusin 1 ve 2 (Mfn1 ve Mfn2) ve Optik protein atrofisi 1 (Opa1), dış mitokondriyal zarın ve iç zarın füzyonunu düzenler, sırasıyla 1,2. Dinamin ile ilişkili protein (Drp1), Ser6163'te fosforile edildiğinde ağırlıklı olarak mitokondriyal fisyonu düzenler.
İskelet kasında, mitokondriyal ağın, farklı hücre bölgelerine (miyofibriller, sarkolemma ve çekirdekler) yakınlıklarına bağlı olarak yapısal olarak iyi tanımlanmış alt popülasyonlarda düzenlendiği iyi bilinmektedir4,5. Sarkolemmanın hemen altında bulunan mitokondrilere subsarkolemmal mitokondri (SSM), kasılma filamentleri arasında bulunanlara intermiyofibriler mitokondri (IMF) ve çekirdeklerin etrafındaki mitokondriyal alt popülasyona perinükleer mitokondri ağı (PMN) denir. Ayrıca, bu mitokondriyal alt popülasyonların bölgeye özgü işlevlere sahip olduğu ve metabolik olarak özelleştiği öne sürülmüştür 4,5.
Metabolik ve kasılma fonksiyonuna izin veren hücresel enerji homeostazının korunması, büyük ölçüde mitokondriyal ağ (örneğin, IMF ve SSM etkileşimi) aracılığıyla belirli bölgelerdeki etkileşime ve iletişime bağlıdır4,6. Mitokondri ağ etkileşimlerine ek olarak, mitokondri diğer organellerle de etkileşime girerek yapısal ve fonksiyonel kompleksler oluşturabilir. Bu bağlamda, IMF'nin sarkoplazmik retikulumun (SR) bitişiğinde ve enine tübüller (TT) tarafından oluşturulan Ca2+ salım birimlerinin (CRU) yakınında bulunabileceği gösterilmiştir7. Bu gerçek, mitokondriyalCa2+ alımının ATP sentezini ve apoptozu düzenlemedeki rolü nedeniyle önemlidir. Son zamanlarda, sitozolik Ca2+ geçişlerinin düzenlenmesinde potansiyel bir rol de önerilmiştir8.
TT, IMF dağılımınabenzer şekilde, kardiyomiyositlerin ve iskelet kası liflerininuzunlamasına ekseni 9,10 boyunca periyodik bir dağılıma sahip olan sarkolemma istilalarıdır 5. TT'nin dağılımındaki değişiklikler, kasılma fonksiyonundaki rolleri göz önüne alındığında önemli fizyolojik etkilere sahiptir. Bununla birlikte, bu değişiklikler esas olarak kardiyomiyositlerde değerlendirilmiştir. Hızlı Fourier Dönüşümü (FFT) analizinin kullanılması, periyodik sinyallerin mesafe alanından frekans alanına dönüştürülmesine izin verir, bu da11,12,13 sinyalinin frekansını ve düzenliliğini gösteren bir FFT spektrumu ile sonuçlanır. İskelet kası liflerinde mitokondriyal ağın organizasyonunun, kas yaralanması sonrası rejenerasyon sırasında olduğu gibi farklı metabolik koşullara adaptasyon için gerekli olduğuna dair kanıtlar olmasına rağmen14,15, çoğu analiz kalitatif olarak gerçekleştirilir.
Ek olarak, mitokondriyal disfonksiyonun iskelet kası ile ilgili çeşitli (örneğin, kullanılmama atrofisi)2 ve kas dışı hastalıklar, özellikle metabolik hastalıklar ve ilişkili kas kütlesi kaybı (yani atrofi)16 ile ilişkili olduğu göz önüne alındığında, mitokondriyal ağın ve iskelet kasındaki dağılımın kantitatif değerlendirmesi önem taşır. Son zamanlarda, obez bir grup arasında gastroknemius kas liflerinin mitokondrilerinin uzunlamasına dağılımında önemli bir fark (Ob; Zucker fa /fa sıçanları) ve yalın bir grup (Yalın; Zucker +/+ sıçanları) FFT17 ile tanımlandı. Bu çalışma, FFT'nin mitokondriyal dağılımı analiz etmedeki yararlılığını göstermiştir. Bu nedenle, bu protokol, floresan konfokal mikroskopi ile elde edilen görüntülerden canlı iskelet kası liflerinde mitokondriyi incelemek için bir metodoloji sunar. Mitokondriyal yoğunluk, arka plan eşiklemesi ile ölçülür ve FFT analizi ile uzunlamasına mitokondriyal dağılımın analizi de açıklanmaktadır. Şekil 1'de bir iş akışı şeması sunulmuştur.

<table><tbody><tr><td>Adenozin 5'-trifosfat disodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam lamel</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0709</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop yazılımı Leica Application Suite&nbsp;</td><td>Leica</td><td>2.7.3.9723</td><td></td></tr><tr><td>Kreatin Fosfokinaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3755</td><td></td></tr><tr><td>DekonvolüsyonLab2 (DeconvolutionLab_2.jar)</td> <td>Biyomedikal Görüntüleme Grubu, EPFL</td><td>http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/</td><td></td></tr> <tr><td>Dimetil Sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DL-Aspartik asit potasyum sat hemihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11240</td><td></td></tr><tr><td>Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N ve akut; N ve akut; - tetraasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Miltex</td><td>MH-18</td><td></td></tr><tr><td>HC PL APO 20x / 0.7 IMM objektif & nbsp;</td><td>Leica</td><td>506517</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>İris makası</td><td>Miltex</td><td>5-304</td><td></td></tr><tr><td>L- (-) -Malik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamik asit monosodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Maxchelator</td><td>UC Davis Sağlık</td><td>https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikro makas</td><td>Miltex</td><td>18-1633</td><td></td></tr><tr><td>Biyolojik-görüntü analizi için açık kaynaklı platform Fiji&nbsp;</td><td>Halka açık, Eliceiri/LOCI grubu, Jug grubu ve Tomancak laboratuvarı tarafından sürdürülmektedir. Fiji</td><td>https://fiji.sc/</td><td></td></tr> <tr><td>Fosfokreatin disodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>PSF Jeneratör (PSF_Generator.jar)</td> <td>Biyomedikal Görüntüleme Grubu, EPFL</td><td>http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kayıt odası</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27N</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Elektronik Tablo Microsoft Excel</td><td>Microsoft&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamin, etil ester</td><td>Invitrogen</td><td>T669</td><td></td></tr></tbody></table>

sıçan canlı İskelet kası liflerinde mitokondriyal yoğunluk ve boyuna dağılımın konfokal mikroskopi ile analizi

Analysis of the Mitochondrial Density and Longitudinal Distribution in Rat Live-Skeletal Muscle Fibers by Confocal Microscopy

Mitokondri, hücrelerin metabolik gereksinimlerine göre uzatılabilen, parçalanabilen ve yenilenebilen bir organeldir. Mitokondriyal ağın yeniden şekillenmesi, sağlıklı mitokondrinin hücresel talepleri karşılamasına izin verir; Ancak bu kapasitenin kaybı farklı patolojilerin gelişmesi veya ilerlemesi ile ilişkilendirilmiştir. İskelet kasında, diğerlerinin yanı sıra egzersiz, yaşlanma ve obezite gibi fizyolojik ve patolojik durumlarda mitokondriyal yoğunluk ve dağılım değişiklikleri gözlenir. Bu nedenle, mitokondriyal ağın incelenmesi, bu koşullarla ilgili mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir.
Burada, sıçanlardan alınan canlı iskelet kası liflerinin mitokondri görüntülemesi için bir protokol açıklanmaktadır. Lifler, rahatlatıcı bir çözelti içinde manuel olarak diseke edilir ve mitokondrinin floresan canlı hücre görüntüleme göstergesi (tetrametilrodamin etil ester, TMRE) ile inkübe edilir. Mitokondri sinyali, intermiyofibriler mitokondriyal (IMF) ağın konfokal görüntülerini elde etmek için XYZ tarama modu kullanılarak konfokal mikroskopi ile kaydedilir. Bundan sonra, konfokal görüntüler eşikleme ve ikilileştirme ile işlenir. İkili konfokal görüntü, mitokondri için pozitif pikselleri hesaba katar ve bunlar daha sonra mitokondriyal yoğunluğu elde etmek için sayılır. İskelet kasındaki mitokondriyal ağ, T-tübüllerinkine (TT) benzer periyodik bir uzunlamasına dağılıma sahip olan yüksek yoğunluklu bir IMF popülasyonu ile karakterize edilir. Hızlı Fourier Dönüşümü (FFT), TT'nin dağılımını değerlendirmek için gerçekleştirilen ve dağılım sıklığını ve organizasyon seviyesini bulmayı sağlayan standart bir analiz tekniğidir. Bu protokolde, iskelet kasındaki uzunlamasına mitokondriyal dağılımın analizi için FFT algoritmasının uygulanması açıklanmaktadır.

Mevcut protokolü takiben, canlı iskelet kasında mitokondri yoğunluğunun ve dağılımının analizi gerçekleştirilebilir. Protokol üç ana aşamaya ayrılmıştır: İskelet kası demeti diseksiyonu, konfokal mikroskopi taraması ve görüntü analizi. İş akışına genel bakış Şekil 1'de sunulmuştur. Şekil 2A , liflerin elde edildiği lateral başı işaretleyen bir Petri kabında bütün bir sıçan gastroknemius kasını gösterirken, Şekil 2B , Relax solüsyonundaki lif demetlerini göstermektedir. Konfokal mikroskopi ile mitokondri, floresan indikatör TMRE kullanılarak canlı iskelet kası lifinin derinliği boyunca kaydedilebilir. TMRE, mitokondriyal membran potansiyeline20 göre mitokondri içinde seçici olarak biriken lipofilik katyonik bir florofordur.
IMF'nin optimal bir konfokal görüntüsü, fiber içinde 15 μm derinliğin üzerinde bir Z mesafesi seçilerek elde edilebilir (Şekil 3A). Şekil 3B , gastroknemius kas liflerinin Z mesafesi (15 ila 21 μm) boyunca elde edilen TMRE yüklü mitokondrinin temsili XY konfokal görüntülerini göstermektedir. Konfokal görüntüler, mitokondriyal analize izin vermek için ikili görüntülere dönüştürmek için eşikleme ile işlendi. Şekil 3B (sol panel), egzersiz yapılan bir Yalın sıçandan alınan bir lifi göstermektedir. Lif boyunca tutarlı bir desene sahip olduğu için iskelet kası lifi mitokondrisinin beklenen konfokal kaydını temsil eder. Buna karşılık, mitokondriyal içerik ve dağılımda önemli değişiklikler gösteren bir Ob sıçanından (Şekil 3B, sağ panel) bir lif seçtik. Şekil 3C , her bir ikili görüntüden elde edilen mitokondriyal yoğunluk olarak ifade edilen mitokondri tarafından işgal edilen lif alanının nicelleştirilmesini göstermektedir (panel B'de gösterilmiştir). Beklendiği gibi, Ob lifi daha düşük bir mitokondriyal yoğunluk sundu. Mitokondriyal yoğunluk, 15, 18 ve 21 μm'de elde edilen üç konfokal görüntüye uygun yığın başına hesaplandığında Şekil 3D'de de gözlemlenen, analiz edilen Z mesafesi boyunca tutarlı bir şekilde ölçüldü.
Mitokondriyal yoğunluk analizine benzer şekilde, TMRE gibi canlı hücre görüntüleme için bir floresan indikatörün konfokal taraması, canlı iskelet kasında mitokondrinin uzunlamasına organizasyonunun incelenmesine izin verir. IMF, TT7'ye yakın I-bandında, mitokondriyal sinyalin frekansını ve organizasyon seviyesini ölçmek için FFT ile analiz edilebilen periyodik bir organizasyon sunar17. Şekil 4 , Yalın ve Ob sıçanlardan türetilen gastroknemius'ta bulunan IMF organizasyonundaki farklılıkları ve FFT'nin mitokondriyal sinyalin dağılımındaki değişiklikleri bulmaya nasıl izin verdiğini göstermektedir. Şekil 4A,B, FFT analizi için fiberde merkezi ve yanal konumda seçilen uzunlamasına ROI'leri sergiler. FFT gerçekleştirmeden önce, arka plan çıkarma eşiği hesaplanır. Ardından, görüntü ikili hale getirilir; Bu prosedürler, mitokondriyal sinyalin floresan yoğunluk seviyelerindeki değişiklikleri ortadan kaldırır. İkili görüntü, FFT'yi gerçekleştirmek için gerekli olan floresan dağılımının çizim profilini sağlar.
Şekil 4C,D, A ve B panellerinde seçilen ROI'leri çizim profilleriyle (üst paneller) göstermektedir. Çizim profillerinden, Yalın ve Ob sıçanlardan elde edilen lifler arasındaki floresan dağılımındaki farklılıkların yanı sıra aynı lif içindeki ROI'ler arasındaki farklılıklar gözlemlenebilir. Her çizim profili için, ilgili FFT spektrumu sunulur (alt paneller). Maksimum FFT spektrumunun tepe noktası, uzunlamasına eksen boyunca mitokondriyal sinyal dağılımının FFT frekansını (X ekseni) gösterir. Yalın sıçandan yanal ve merkezi ROI'lerde 2 μm'ye yakın bir mesafe değerine dönüştürülebilir. Özellikle, zirvenin FFT büyüklüğü, mitokondriyal sinyalin düzenliliğinin bir indeksidir ve bu genlikteki değişiklikler, mitokondriyal dağılımdaki değişiklikleri ortaya çıkarır.
Şekil 4E,F, sırasıyla yanal ve merkezi ROI'lerin analiz edildiği Yalın ve Ob türevli lifler arasındaki FFT spektrumundaki farklılıkları göstermektedir. Yanal ROI'lerde (Şekil 4E) mitokondriyal uzunlamasına dağılımın sıklığı yağsız ve Ob'den türetilmiş liflerde benzerdi; bununla birlikte, Ob'den türetilen liflerdeki maksimum FFT tepe noktasının genliği daha yüksekti, bu da Şekil 4B'deki görüntüde gözlemlenen sinyalin daha yüksek düzenliliği ile uyumludur. Bununla birlikte, Ob'nin merkezi ROI'si (Şekil 4F), mitokondriyal dağılımda önemli bir değişiklik mevcut olduğunda, Yalın'a kıyasla FFT zirvesinin kritik bir şekilde azaltılmasının bir örneği olarak gözlenir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig01v2.jpg"> Şekil 1: Konfokal mikroskopi ile iskelet kasında mitokondriyal analiz şeması. Bu şema, protokolün ana adımlarını üç ayrı aşamada özetlemektedir. İlk aşama olan gastroknemius kas lifi demetlerinin diseksiyonu, gastroknemius kas izolasyonu olmak üzere birbirini takip eden üç adıma bölünür ve ardından canlı olanların görsel bir seçimini yapmak için demetler halinde kas mekanik diseksiyonu yapılır. İkinci aşama, lifleri odaya yerleştirmek için oda sıcaklığında 20 dakika boyunca florofor (TMRE) ile inkübasyondan oluşan konfokal mikroskopi ile canlı hücre görüntüleme alımından oluşur. Daha sonra, konfokal görüntülerin elde edilmesini sağlamak için mikroskopta uygun ayarlar yapılır. Üçüncü aşamada, konfokal görüntü işleme ve veri analizi yapılır. Mitokondriyal yoğunluk hesaplamalarının ve FFT ile mitokondriyal dağılımın yapıldığı ikili görüntüler oluşturmak için bir eşiğin gerekli olduğu görüntü işleme ile başlayarak. Kısaltmalar: TMRE = tetrametilrodamin etil ester; FFT = Hızlı Fourier Dönüşümü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig02.jpg"> Şekil 2: İskelet kası demeti diseksiyonu. (A) Relax solüsyonu ile bir Petri kabında disseke sıçan lateral gastroknemius kafası (siyah ok). (B) TMRE yüklemesinden önce Relax solüsyonundaki gastroknemius kas lifi demetlerinin temsili görüntüsü. Kısaltma: TMRE = tetrametilrodamin etil ester. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig03.jpg"> Şekil 3: Mitokondriyal yoğunluk analizi. (A) İskelet kası liflerinde IMF mitokondrisinin konfokal taraması için önerilen Z mesafesini temsil eden çizim. (B) İskelet kası liflerinde TMRE yüklü mitokondri serisi, egzersiz yapılan bir Zucker +/+ sıçandan (Yalın) ve Z mesafesinde (15 ila 21 μm derinlik) kaydedilen obez bir Zucker fa /fa sıçanından (Ob) elde edilmiştir. Görüntüler eşiklenerek işlendi ve ikili görüntülere dönüştürüldü. (C) Panel B'de gözlemlenen farklı Z mesafelerinde elde edilen konfokal dilimlerin hesaplanan mito-yoğunluğu. (D) Panel B'de gözlemlenen görüntülerden oluşan yığından elde edilen mito yoğunluğu. Panel B'deki görüntüler 65 x 50 μm'dir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Kısaltmalar: Mito-yoğunluk = Mitokondriyal yoğunluk; IMF = intermiyofibriler mitokondri; Ob = Obez; SSM = subsarkolimal mitokondri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig04.jpg"> Şekil 4: FFT ile mitokondriyal dağılım analizi. Egzersiz yapan bir Zucker +/+ sıçanından (Yalın, panel A) ve obez bir Zucker fa /fa sıçanından (Ob, panel B) elde edilen iskelet kası liflerinin derinliğinin 21 μm'sinde elde edilen floresan indikatör TMRE ile yüklü mitokondrinin temsili konfokal görüntüleri. Görüntüler eşiklenerek işlendi ve ikili görüntülere dönüştürüldü. Panel A'dan (panel C) ve panel B'den (panel D) floresan yoğunluğu (üst grafik) ve FFT spektrumunun (alt grafik) ilgili çizim profilleriyle birlikte yanal ve merkezi ROI'ler. FFT, panel A'da 39 x 5 μm'lik bir ROI boyutuna ve panel B'de 50 x 5 μm'lik bir ROI boyutuna karşılık gelen 256 piksel genişliğe sahip ROI'lerden hesaplanmıştır. Panel E , yanal ROI'de Yalın ve Ob sıçanlardan türetilen mitokondriler arasında bulunan FFT spektrumunun farklılıklarını gösterirken, panel F , merkezi ROI'nin FFT spektrumunun farklılıklarını göstermektedir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Kısaltmalar: A.U. = Keyfi Birimler; FFT = Hızlı Fourier Dönüşümü; ROI'ler = ilgi alanları; Ob = Obez. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reaktif</td>
			<td>100 mL'de son konsantrasyon</td>
			<td>Stok </td>
		</tr><tr><td>K-aspartat</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Kartal</td>
			<td>20 milyon</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HEPES ÜNİVERSİTESİ</td>
			<td>20 milyon</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>L-glutamik asit</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Malik asit</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGTA (EGTA)</td>
			<td>0,1 milyon</td>
			<td>10 milyon</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>1 mM serbest Mg2+</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CaCl2</td>
			<td>0,00002 mM serbest Ca2+</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Fosfokreatin di-Na</td>
			<td>5 milyon</td>
			<td>500 milyon</td>
		</tr><tr><td>Kreatin fosfokinaz</td>
			<td>5 U/mL</td>
			<td>200 U/mL</td>
		</tr><tr><td>MgATP (MgATP)</td>
			<td>5 milyon</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>pH 7.3 (NaOH ile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Çözelti reaktiflerini ve konsantrasyonunu gevşetin.
Ek Şekil S1: Görüntü önişleme yöntemlerinin etkisi. (A) Egzersiz yapmış bir Zucker +/+ sıçanından (Yağsız, üst panel) ve obez bir Zucker fa /fa sıçanından (alt panel) elde edilen iskelet kası liflerinde 18 μm derinlikte elde edilen floresan indikatör TMRE yüklü mitokondrinin temsili konfokal görüntüleri, Otsu' eşiklemesi, medyan filtresi ve Otsu' eşiklemesi kullanılarak ön işlemden sonra elde edilen ilgili görüntülerle birlikte, ve 2D evrişim ve Otsu' eşiği. (B) Farklı yöntemlerle ön işlemden sonra konfokal görüntülerden (panel A) elde edilen mito-yoğunluğun çizim profili. Panel A'daki görüntüler 65 x 50 μm'dir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Kısaltmalar: 2D-Decon = 2D dekonvolüsyon; Mito-yoğunluk = Mitokondriyal yoğunluk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/Supl%201-rev4.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Burada, mitokondriyal ağ taraması için konfokal mikroskopi kullanarak canlı iskelet kası görüntüleme ile mitokondriyal yoğunluk ve uzunlamasına dağılımdaki değişiklikleri analiz etmek için bir protokol sunuyoruz.

Sıçan Canlı İskelet Kası Liflerinde Mitokondriyal Yoğunluk ve Boyuna Dağılımın Konfokal Mikroskopi ile Analizi

The mitochondrion is an organelle that can be elongated, fragmented, and renovated according to the metabolic requirements of the cells. The remodeling of ...

Mitokondriyal ağın yeniden şekillenmesi fizyolojik stres ve patolojik koşullarda meydana gelir. Bununla birlikte, bir iskelet kasında mitokondriyal yeniden şekillenmenin etkileri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu protokol, canlı iskelet kasındaki mitokondri değişikliklerinin ölçülmesini sağlar ve mitokondriyal değişiklikler ile hücresel işlev arasındaki etkileşimi anlamamızı sağlar.Canlı iskelet kaslarıyla çalışmak, izolasyon sırasında lif kasılması ve konfokal tarama sırasında görüntüye duyarlılık nedeniyle zorluklar ortaya çıkarır. Bu protokol, konfokal mikroskopi yoluyla mitokondriyal değerlendirme için canlı kas liflerinin analizini sağlayan bir gevşeme solüsyonu kullanan bir izolasyon sürecini açıklar. Protokolümüz, iskelet kası liflerindeki mitokondriyal ağları kantitatif olarak analiz etmek için iş akışlarının eksikliğini giderir.Burada açıklanan adımlar, kullanıcıların mitokondriyal yoğunluk ve dağılımın nicelleştirilmesini sağlamak için eşikleme ve hızlı Fourier analizi ile görüntü işleme kullanılarak konfokal mikroskopi ile elde edilen görüntülerden daha fazla yararlanmalarını sağlar. İskelet kası değişikliği, özellikle mitokondriyal dinamikler ve sıkıntı sırasında mitokondriyal yapısal yeniden şekillenme ve bunların egzersiz ve orta düzeyde açlık gibi müdahalelerle nasıl modüle edilebileceği ile ilgileniyoruz.

analysis-mitochondrial-density-longitudinal-distribution-rat-live

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Parkinson hastalığı yol açan genlerde mutasyon taşıyan hastaların Fibroblastlar kolay erişilebilir bir...

Parkinson Hastalığı Alanında Mitokondriyal Fenotiplerinin İzleme İlköğretim İnsan Fibroblast Kullanımı

Bu iletişim kuralı görselleştirmek ve sinir özgü mitokondri ölçmek için üç boyutlu (3D) görüntüleme ve çözümleme teknikleri kullanır. Teknikleri bir floresan sinyal başka bir floresan sinyalinden gelen verilerin bir alt kümesini yalıtmak için kullanıldığı diğer durumlar için geçerlidir.

Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi

Memeli beyin dokusundan mitokondriyal görselleştirme ve analiz zorlu bir iştir. Burada, bu kritik enerji üreten organelin morfolojik ve hacimsel analizi hakkında bilgi edinmek için seri blok yüz taramalı elektron mikroskobundan (SBFSEM) elde edilen üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon analizinin nasıl kullanılabileceğini açıklıyoruz.

Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

Burada, geliştirilmiş boyama kalitesini ve böylece otomatik satın alma ve serbestçe yazılım ImageJ kullanılarak fiber popülasyonları ölçümü sağlar hızlı kas lifi analiz için bir protokol mevcut.

Miyosin Ağır Zincir İmünohistokimya kullanma Sıçan kas Çapraz Bölüm kas Elyaf Nüfus Analizi İçin Hızlı Otomatik Protokolü

Modifiye edilmiş bir fiksasyon sonrası prosedür, dokudaki glikojen parçacıklarının kontrastını arttırır. Bu yazıda, iskelet kasında lif tipine özgü hücre altı glikojen dağılımı hakkında tarafsız ve nicel veriler elde etmek için dokunun nasıl ele alınacağını, görüntülemenin nasıl yapılacağını ve stereolojik yöntemlerin nasıl kullanılacağını açıklayan adım adım bir protokol sunulmaktadır.

İskelet Kas Liflerinde Subsellüler Glikojen Dağılımının İletim Elektron Mikroskobu Kullanılarak Ölçülmesi

Artan kanıtlar, iskelet kası içindeki lipitlerin aşırı infiltrasyonunun lipotoksisite ve diyabet ile sonuçlandığını göstermektedir. Burada, lipit damlacıklarının boyutunu, yoğunluğunu ve hücre altı dağılımını lif tipine özgü bir şekilde ölçmek için doku işleme, Bodipy ile boyama, görüntü elde etme ve analiz dahil olmak üzere eksiksiz bir protokol sunuyoruz.

İskelet Kasında Lipid Damlacık İçeriğinin Lif Tipi ve Subhücresel-Spesifik Analizi

Bu çalışmada, adım adım bir protokol açıklıyoruz ve canlı hücrelerde mitokondrinin morfolojik özelliklerini belirlemek için numune hazırlama, görüntü elde etme ve veri analizi dahil olmak üzere temel ayrıntıları vurguluyoruz. Bu yöntem, çeşitli koşulları incelemek için mitokondriyal morfolojiyi incelemek için yaygın olarak kullanılır.

Canlı Hücrelerde Mitokondriyal Morfolojinin Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Belirlenmesi

Burada, zaman içinde mitokondriyal fisyon ve füzyon aktivitesindeki 3 boyutlu değişikliklerin nicelleştirilmesinde yararlı olan bir ImageJ eklentisi olan mitokondriyal olay yerelleştiricisini (MEL) açıklıyoruz. Ayrıca, ImageJ'de analizden önce mikrografların temizlenmesi için yararlı olan bir görüntü işleme hattını da açıklıyoruz.

Mitokondriyal Morfolojideki Değişikliklerin Dinamik ve Üç Boyutlu Floresan Mikrografları ile Anlaşılması

Mitokondriyal boya terminali olan Schwann hücre mitokondrilerinin in vivo konfokal mikroskopi için yerel enjeksiyonları. Bu yöntem, sağlıklı veya hasta kaslı farelerin iskelet kas dokularında gösterilen kavram kanıtını kullanarak yüksek çözünürlüklü mitokondriyal görselleştirme sağlar.

Farelerin Kas ve Terminal Schwann Hücrelerinde Mitokondriyal Morfolojinin Yerinde Niceletilmesi Yöntemleri

Mikrodolaşımında gözlem için yeni bir çok yönlü bir yöntem sunulmuştur. Bu uzun vadeli bir gözlem için uygun olduğu düşünülen ve pharmacophysiological veya moleküler biyolojik müdahaleler ile birlikte.

İskelet kas-içi hayati Mikroskopi in vivo Mikro sirkülasyon Ölçümü

Keşfedin canlı sıçan iskelet kası liflerinde mitokondriyal yoğunluk ve boyuna dağılım analizini konfokal mikroskopi ile. Bu yöntem, fizyolojik ve patolojik koşullarda mitokondriyal yeniden şekillenmeyi anlamaya yardımcı olur.

Sıçan Canlı İskelet Kası Liflerinde Mitokondriyal Yoğunluk ve Boyuna Dağılımın Konfokal Mikroskopi ile Analizi

Daha fazla video keşfet