İskelet Kas Uyarılabilirliğini Incelemek için Doğal Hücrelerde Fonksiyonel Bölgeye Yönelik Florometri

İşlevsel bölgeye yönelik florometri, protein alanı hareketlerini gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılan bir yöntemdir. Bu tekniğin doğal hücrelerde uygulanması için modifikasyonu, artık murin izole iskelet kası liflerindeki voltaj kapılı Ca^{2 +} kanallarından tek voltaj sensörü hareketlerinin tespit edilmesine ve izlenmesine izin vermektedir.

Voltaj kapılı iyon kanallarının bir üyesi olan CaV1.1, dört ayrı voltaj sensörüne sahiptir. Kanıtlar, bazı voltaj sensörlerinin ryanodin reseptör aktivasyonuna veya kalsiyum akımına daha fazla katkıda bulunduğunu göstermektedir. Her voltaj sensörünün uyarma-büzülme kuplajındaki ve kalsiyum kanalı aktivasyonundaki kesin rolünü tanımlayabilmeyi amaçlıyoruz.

Uyarma-büzülme kuplajı 50'li yılların başından beri çalışılmaktadır, ancak bu sürecin nasıl gerçekleştiğinin moleküler detayı hala bilinmemektedir. Kanalın siro-elektron mikroskobik yapısındaki son gelişmeler, yeni CaV1.1 aksesuar proteininin karakterizasyonu, kanal alternatif ekleme varyantının keşfi ve hastalığa neden olan mutasyonun tanımlanması bu alana olan ilgiyi yeniden alevlendirmiştir. Alanımızda klasik elektrofizyoloji ve moleküler biyolojiden, kriyo-elektron mikroskopisi, moleküler dinamik simülasyon, hedefli protein yıkımı ve fonksiyonel bölgeye yönelik florometri gibi daha yeni tekniklerin yanı sıra mühendislik hücreleri veya hayvan modelleri gibi birçok teknik kullanılmaktadır.

Şu anda, yakıt çeşitli deneysel zorluklarla karşı karşıyadır. Bir iskelet kasında, CaV1.1 ve RyR1 arasındaki uygun kaçakçılık ve iletişim, birçok düzenleyici proteinle birlikte, uyarılma-kasılma eşleşmesini desteklemek için çok önemlidir. CaV1.1 ve RyR1 arasındaki bu protein-protein etkileşimlerini doğrudan incelemek için kullanılan yöntemler eksik veya eksiktir.

Dr.Martin Schneider'in laboratuvarı, CaV1.1'deki voltaj algılama mekanizmalarını, kalsiyum salınımını ve kalsiyum kıvılcımları olarak bilinen lokalize kalsiyum salınım olaylarını karakterize eden uyarım-büzülme kuplajları üzerinde on yıllardır çalışmaktadır. Son zamanlarda, laboratuvarımız işleyen yetişkin kas hücrelerinde uyarma-kasılma kuplajının ve voltaj sensörü hareketinin çeşitli adımlarını araştırmak için yeni optik teknikler uygulamaktadır. Bu daha önce heterolog bir ifade sisteminde yapılmış olsa da, protokolümüz artık doğal ortamında yayılmış bir aksiyon potansiyeli sırasında CaV1.1 voltaj sensörlerindeki konformasyonel değişikliklerin izlenmesine izin veriyor.

Yeni tekniğimiz, uyarma-büzülme kuplajları için gereken voltaj sensörünün hassas hareketini araştırmamızı sağlayacaktır. Her bir S4'teki hangi yük kalıntısının işlevi için kritik olduğunu veya tam olarak her bir S4'ün yer değiştirdiğini bilmek istiyoruz ve translokasyonun hepsi CaV1.1 açıklığı veya ryanodin reseptörü aktivasyonu ile bağlantılıdır.