Name: Yeni Bir Soğutma Hücresi İşlemci Sisteminin Adacık Hücresi İzolasyon Tesisi Üzerindeki Etkisinin Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-11T12:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Öğrenin, soğutmalı hücre işlemci sistemi ile insan mononükleer hücrelerin GMP temiz oda koşullarında izolasyonunu ve canlılıklarının korunmasını. Bu yöntem, klinik uygulamalar için hücre işleme verimliliğini artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Avrupa Genomik Diyabet Enstitüsü'ne (ANR-10- LABEX-0046'dan FP'ye) ve Katar metabolik enstitüsü - Hamad Medical Corporation, Katar'a teşekkür etmek istiyor. Yazarlar, makale işlem ücretleri desteği için Hamad Medical Corporation'daki Tıbbi Araştırma Merkezi'ne de teşekkür eder.

Bu protokolde, kurum imha kılavuzlarına göre kullanıma uygun olmayan atık tam kan kullanılmıştır. IRB onayı ve bilgilendirilmiş onam gerekli değildir.
1. Soğutmalı hücre işlemcisinin kurulumu
NOT: Tüm prosedürler temiz oda ortamında gerçekleştirilmeli ve personel temiz oda kıyafet prosedürlerine uymalıdır.
<ol>
	<li>Ekipmanların satın alınması
	<ol>
		<li>Yedek bir pleksiglas kapak satın alın. Soğutma ekipman sistemini, mekanik olarak soğutmalı gaz akış sıcaklık kontrolörlü soğutucuyu, hava kurutucuyu, basınç ve akış regülatörünü ve garantiyi (isteğe bağlı) satın alın. Referanslar için Malzemeler Tablosu'na bakınız. 
		NOT: Toplam maliyet, nakliye veya gümrük ücretleri hariç 16.133$'dır.</li>
		<li>Yerel tıbbi gaz tedarikçisinden, standart dereceye (Avrupa farmakopesi referans 1238) uygun, sıkıştırılmış tıbbi bir gaz olan tıbbi kuru hava sipariş edin. 6.8 m3 (47 L: 23 cm x 153 cm; çap x uzunluk) hacminde 2 tüp satın alın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekipmanların kurulumu (Şekil 1 ve Şekil 2)
	<ol>
		<li>Ekipmanı GMP temiz odaya sokun (temiz odaya girmeden önce GMP prosedürlerine göre dezenfekte edin).</li>
		<li>Tıbbi sınıf sıkıştırılmış hava için, gaz tüpünü doğrudan temiz odaya yerleştirmek yerine bir gaz hattı kurun.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hücre işlemcisinin soğutma için modifikasyonu
	<ol>
		<li>Öncelikle pleksiglas kapağı çıkarın. Garanti ile ilgili bir sorun oluşması ihtimaline karşı orijinal pleksiglas kapağı saklayın. Santrifüj kapağının çatlamasını önlemek için, hücre işlemcisinin yedek kapağına, soğutma cihazı nozul ucunun dış çapına uygun ve uyumlu bir çapta delik açın (13.3 mm önerilir).</li>
		<li>Destek braketlerini dairesel bir köpük parçasıyla birlikte sabitleyin. Bu işlem; kapağın kırılmasını ve/veya çizilmesini önlemek, soğutucu nozulunu hücre işlemcisinin üzerinde sabit tutmak, kapağı enjekte edilen havanın yüksek basıncı nedeniyle aşırı bükülmekten korumak, nozulun ağırlığını desteklemek ve son olarak operatörün deneysel prosedür sırasında tüm gerekli hücre işlemcisi fonksiyonlarına serbest ve güvenli erişim sağlayarak maksimum güvenliği garanti etmek için yapılır.</li>
		<li>Soğutma nozulunu pleksiglastaki deliğe takarak soğutma sistemini hücre işlemcisine bağlayın. Braketler ve köpük yastıklar ile sabitleyin.</li>
		<li>Soğutma ünitesini, nozuldan 8 feet (2.44 m) mesafeye kadar yerleştirin. Sıcaklık kontrolörünü ayrı bir kabine yerleştirin ve soğutma ünitesinin 6 feet (1.83 m) yakınına konumlandırın.</li>
		<li>Soğutucuda hava akışını soğutmak için soğutucu set değerini -40 °C'ye ayarlayın. Çıkış hava sıcaklığı, dijital göstergede 0.1 °C çözünürlükle sürekli olarak belirtilir. Çıkış sıcaklığını sıcaklık kontrolörü ile dijital olarak 0.1 °C hassasiyetle ayarlayın.</li>
		<li>Soğutucuya beslemeden önce, basınç ve akış regülatörü modülü üzerindeki (Şekil 2) hava beslemesinin basıncını ve akış hızını kontrol edin. -30 °C ± 2 °C'de soğutulan bir hava akışında optimum koşullara ulaşmak için bunları sırasıyla 55 psi ve 4 SCFM akış hızlarına ayarlayın.</li>
		<li>Tıbbi gaz beslemesinin 5 bar çıkış basıncında regüle edildiğini ve en az 90 dk sürebildiğini doğrulayın; çünkü sıkıştırılmış havanın -30 °C'ye ulaşması için bu gereklidir. 
		&#8203;NOT: Tıbbi kuru hava, sıkıştırılmış tıbbi gazdır ve tam basınçlı kuru hava standart dereceye uygundur.</li>
		<li>Santrifüj kapağına açılan bir delik aracılığıyla hücre işlemcisi kapağına bağlı bir soğutucu nozulundan 5 bar basınç sağlayın. Soğutulmuş tıbbi havayı hücre işlemcisinin santrifüj haznesinin içine enjekte edin (Şekil 2). Hava enjeksiyonunun konumunu, soğutulmuş havanın santrifüj rotorunun alüminyum kenarına dik olarak yönlendirileceği şekilde seçin.</li>
		<li>Hücre işlemcisini hazırlarken rotorun oda sıcaklığında (18 °C) olduğundan emin olun. Soğutma sisteminin otomatik termo-regülatörünü -30 °C'ye ayarlayın ve soğuk hava enjeksiyonlarını rotora yönlendirin. 
		NOT: Hücre işlemcisi hücre ayırıcı sisteminin termo-direncini ve santrifüj sırasında rotorun ısınmasını önlemek için gerekli olan +4 °C'lik optimum sıcaklık gradyanına ulaşmak amacıyla farklı deneme koşulları test edilmiştir. Programlanan termo-regülatör, prosedür sırasında, özellikle santrifüjation sırasında, +18 °C'lik temiz oda sıcaklığında, hücre işleme makinesinin içinde optimum hedef sıcaklığı koruyacaktır.
		<ol>
			<li>Hücre işlemcisini, işlemciyi soğutmak için (hücre işlemcisi kiti olmadan) +3 °C'de 30 ila 45 dk süren ilk ön soğutma fazı ve hücre işlemcisinin çalıştırıldığı, kitin +4 °C'de ön soğutulduğu 134 x g hızında 5 dk süren ikinci ön soğutma fazı ile kurun.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Havada asılı partikül sayımı
<ol>
	<li>Operasyon aşamasındaki ısıtıcı cihazların etkisini değerlendirmek için soğutma cihazının GMP temiz oda ortamına uygunluğunu ISO 14644-1 standardına göre değerlendirin.</li>
	<li>Kritik kontrol noktalarında, dinlenme ve operasyon durumlarında gerekli temizlik seviyesine ulaşıldığının kanıtını sağlamak için partikül sayım izlemesi kullanın.
	<ol>
		<li>Minimum numune alma konumu sayısı, ölçülen alana bağlıdır. Bunu şu denklemle hesaplayın 
		<img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/65321/65321eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 
		&#8203;burada A, temiz odanın veya temiz hava kontrollü alanın m2 cinsinden alanı ve NL, tam sayıya yuvarlanmış numune alma konumu sayısıdır.</li>
		<li>Havadaki numune hacmi, her konumdaki minimum hacimdir. Hava hacminin, belirtilen en büyük partikül boyutundan 20 partikül sayacak kadar büyük olduğundan emin olun. Havadaki numune hacmini şu denklemle hesaplayın 
		V= 20/C x 1000 
		burada V, konum başına L cinsinden ifade edilen minimum tekil numune hacmi ve C, sınıf sınırıdır (partikül sayısı/m3).</li>
		<li>Alana bağlı olarak her konum için bir veya daha fazla numune kullanın. Her konumda alınan en düşük numune hacminin 2 L ve minimum numune süresinin en az 1 dk olduğundan emin olun.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Numune almaya başlamadan önce, partikül sayacı cihazını bir temizleme filtresi ile temizleyin. Filtreyi çıkarın ve numune alma işlemi için izokinetik prob ile birlikte yerleştirin.</li>
	<li>Partikül sayacı cihazını belirlenen numune alma konumuna yerleştirin. Numune toplamayı partikül sayacı cihazının ana ekranından başlatın.</li>
	<li>Numune alma işlemi sona erdiğinde, partikül sayacı cihazını bir sonraki konuma götürün. Tüm numune alma konumları tamamlandığında, verileri gözden geçirin ve bir rapor yazdırın.</li>
	<li>Alandaki tüm numune alma noktaları için ortalama partikül konsantrasyonu Tablo 1'de belirtilen sınıf sınırının altına düştüğünde, oda izin verilen partikül konsantrasyonuna sahip olduğu için uygun kabul edilir.</li>
</ol>
3. Gradyan hazırlama ve hücre ayırma işlemi
<ol>
	<li>Deney öncesinde, düşük ve yüksek yoğunluklu gradyanlar ile hücre işlemci kitlerini bir buzdolabında +4 °C'de gece boyunca ön soğutma işlemine tabi tutun.</li>
	<li>Hücre işlemciyi 45 dk boyunca beklemede ön soğutun (yani, hücre işlemciyi kullanmadan önce açın). Sıcaklığı +2 °C ile +5 °C arasında tutun. +4 °C'de ön soğutulmuş hücre işlemci kitini yerleştirin.</li>
	<li>Standart etanol soğutmalı çift cidarlı gradyan oluşturucu için (isteğe bağlı; Şekil 3) 2 cam hazneyi bağlayın ve bunları bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin. 2 hazne arasındaki tüpleri kelepçeleyin. Gradyan oluşturucuyu 0 °C'de bir etanol sirkülasyonlu soğutucu şiller ile soğutun.</li>
	<li>İlk olarak, hazneyi 130 mL yüksek yoğunluklu gradyan (HD; 1.087 g/mL) ile doldurarak torbanın altına ağır tabakayı yüklemeye hazırlanın. 150 mL/min pompa hızında yükleme yapın.</li>
	<li>Ağır gradyan torbaya girdikten sonra, ön beherin içine 130 mL yüksek yoğunluklu (HD) ve arka beherin içine 140 mL düşük yoğunluklu (LD; 1.063 g/mL) gradyan ekleyin (kelepçe kapalı).</li>
	<li>2 hazne arasındaki hemostatı/kelepçeyi açın ve 50 mL/min pompa hızında sürekli bir gradyan oluşturun.</li>
	<li>Kan bankasından temin edilebilirlik durumuna göre, tam kan atık ürünlerinden toplanan çoklu havuzlanmış anonim buffy coat'lardan saflaştırılacak insan mononükleer buffy coat hücrelerini önceden hazırlayın (10 buffy coat torbasına 40 mL ile 60 mL arasında tam kan eklenmiştir).
	<ol>
		<li>MNC Ayırımı
		<ol>
			<li>Düşük yoğunluklu insan mononükleer hücre izolasyonu için yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu kullanın. Bunun için aşağıda açıklanan adımları izleyin.</li>
			<li>Hücre hazırlığı için kan hacmini (antikoagülanlı tam kan veya süspande buffy coat) hesaplayın. Kanı, ters çevirerek karıştırma yoluyla 2x-4x tampon çözeltisi ile seyreltin. Kan ne kadar çok seyreltilirse, mononükleer hücrelerin saflığı o kadar artar.</li>
			<li>Fosfat tamponunu bir antikoagülan ile karıştırarak tamponu hazırlayın. Kan hacmini 35 mL'ye bölerek gerekli tüp sayısını hesaplayın ve her tüpe 15 mL 1.073 yoğunluk gradyanı çözeltisi dökün.</li>
			<li>Seyreltilmiş kan süspansiyonunun 35 mL'sini, bir iğneye bağlı 60 mL'lik bir şırınga kullanarak yoğunluk gradyanının yüzeyinde nazikçe akıtarak kademeli olarak tabaka haline getirin; küçük hacimler için pipet kullanın. Arayüzü bozmamaya çalışın, çünkü bu durum zayıf bir mononükleer tabaka ile sonuçlanacaktır.</li>
			<li>20 °C'de, herhangi bir ara vermeden 20 dk boyunca 400 x g'de santrifüjleyin (ivmelenme&#160;0, yavaşlama&#160;0). Santrifüjasyondan sonra, steril bir transfer pipeti kullanarak mononükleer hücrelerin arayüz tabakasını nazikçe toplayın. Hücreleri başka bir yeni 50 mL'lik konik tüpe aktarın.</li>
			<li>Hücreleri tamponla (antikoagülan eklenmiş PBS) 2x yıkayın. İlk yıkama için, hücreleri içeren tüpü 50 mL'ye kadar tamponla doldurun. Hücreleri çöktürmek için 20 °C'de 10 dk boyunca 300 x g'de santrifüjleyin (ivmelenme&#160;9, yavaşlama&#160;0). Tüm süpernatanı dikkatlice ve nazikçe uzaklaştırın.</li>
			<li>Trombositlerin uzaklaştırılması için ikinci yıkamayı gerçekleştirin. Çökelti tampon ile 50 mL hacme yeniden süspande edin. 20 °C'de 10 dk boyunca 200-300 x g'de santrifüjleyin (ivmelenme&#160;9, yavaşlama&#160;0).</li>
			<li>Hücreleri 5 mL nihai hacme yeniden konstite edin; bu hücreler düşük yoğunluklu MNC &#60;1.073'e benzer bir özgül ağırlığa sahip olmalıdır. Gradyanın özgül yoğunluğunu bir densiyometre ile ölçün.</li>
			<li>Çökeltiyi, bir transfer torbası içinde 95 mL yüksek yoğunluklu gradyan ortamı (1.083 g/mL) ile 100 mL nihai hacme yeniden süspande edin. Bu ürünü, bir hücre ayırıcı kullanarak saflaştırma işlemi için kullanın. 100 mL nihai hacim, hücreleri ve 1.083 yüksek yoğunluklu gradyan ortamını içerir. 
			NOT: Buffy coat, %0,5 BSA veya otolog plazma içeren PBS içinde buzdolabında gece boyunca saklanabilir. Buffy coat ayrıca yıkanabilir.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Önceden oluşturulmuş gradyanların üst kısmına, 100 mL konsantre koruma ortamında süspande edilmiş, buffy coat'tan izole edilmiş maksimum 30 mL MNC'yi 25 mL/min hızında bir peristaltik pompa kullanarak yükleyin. Gradyanı +4 °C'de tutun.</li>
	<li>Hücre işlemcinin içindeki sıcaklığı önceden kalibre edilmiş bir termoprob ile sürekli olarak ölçün. İşlem sırasında gradyanların ve hücrelerin sıcaklığını, steril bir termoprob'a bağlı dijital bir termokupl kullanarak izleyin.</li>
</ol>
4. Gradyan yüklemenin farklı aşamalarının optimizasyonu
<ol>
	<li>+4 °C'de ön soğutulmuş hücre işlemci kitini yerleştirin. Ağır gradyanı (130 mL) +4.5 °C'de yükleyin. Gradyan yüklemesinin sonunda, rotor tarafından üretilen ısıyı minimize etmek için santrifüjü nispeten düşük bir hıza (537 x g) ayarlayın.</li>
	<li>Hidrolik sistemin çalışma öncesi seviyelerine dönmesini sağlamak ve havayı tahliye etmek için hücre işlemciyi kapatın.</li>
	<li>Hücre işlemciyi 537 x g hızında yeniden başlatın ve +4.3 °C'de ve 50 mL/min akış hızında sürekli bir yoğunluk gradyanı oluşturmak için ağır (130 mL) ve düşük (140 mL) yoğunluk gradyanlarını ekleyin.</li>
	<li>Buffy coat'u (30 mL), +6 °C'de ve 25 mL/min akış hızında 100 mL soğuk saklama ortamı ile yükleyin. 50 mL (25 mL x 2) yıkama çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>+5 °C'de 5 dakika bekledikten sonra, santrifüj edilmiş gradyanı 100 mL/min akış hızında 12 şişeye toplayın.</li>
	<li>Tüpleri yıkama ortamı (M199 + %20 insan albümini + %10 Penisilin streptomisin) ile doldurun. 1. tüpü 100 mL yıkama ortamı ve 150 mL hücre ile, 2-12 arası tüpleri ise 225 mL yıkama ortamı ve 25 mL hücre ile doldurun.</li>
</ol>

Advancements in Cooling Cell Processors for Enhanced Viability in Cell Therapy

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+centrifugal+blood+cell+processor+for+washing+platelet+concentrates%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates.</a> Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).</li>
<li>Lake, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+purification+of+human+islets+utilizing+discontinuous+albumin+gradient+on+IBM+2991+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator.</a> Diabetes. 38, 143-145 (1989).</li>
<li>Ricordi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+and+allotransplantation+in+22+consecutive+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases.</a> Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).</li>
<li>Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+separation+utilizing+a+closed+automated+purification+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet separation utilizing a closed automated purification system.</a> Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).</li>
<li>Bampton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Australian+experience+with+total+pancreatectomy+with+islet+autotransplantation+to+treat+chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22ANZ+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis.</a> ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).</li>
<li>Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRISM%3A+A+Novel+Human+Islet+Isolation+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique.</a> Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).</li>
<li>Shimoda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+purification+method+using+large+bottles+effectively+achieves+high+islet+yield+from+pig+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas.</a> Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).</li>
<li>Noguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Islet+Purification+from+Large+Mammals+and+Humans+Using+a+COBE+2991+Cell+Processor+versus+Large+Plastic+Bottles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+trial+of+the+Edmonton+protocol+for+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation.</a> The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Institutes+of+Health-Sponsored+Clinical+Islet+Transplantation+Consortium+Phase+3+Trial%3A+Manufacture+of+a+Complex+Cellular+Product+at+Eight+Processing+Facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities.</a> Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).</li>
<li>Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cooling+systems+during+islet+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of cooling systems during islet purification.</a> Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).</li>
<li>Rilo, H. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+islet+number+and+viability+obtained+during+purification+on+Euro-Collins-Ficoll+gradients+processed+on+a+refrigerated+or+nonrefrigerated+COBE+2991+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator.</a> Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).</li>
<li>Chadwick, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+purification+using+bovine+serum+albumin%3A+The+importance+of+density+gradient+temperature+and+osmolality%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality.</a> Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+pancreatic+islet+isolation+around+Europe%3A+results+of+a+survey+study%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human pancreatic islet isolation around Europe: results of a survey study.</a> Transplantation. 104 (1), 190-196 (2020).</li>
<li>Chadwick, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+of+pancreatic+digest+before+islet+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Storage of pancreatic digest before islet purification.</a> Transplantation. 58 (1), 99-104 (1994).</li>
<li>Amrani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detrimental+effects+of+temperature+on+the+efficacy+of+the+University+of+Wisconsin+solution+when+used+for+cardioplegia+at+moderate+hypothermia.+Comparison+with+the+St.+Thomas+Hospital+solution+at+4+degrees+C+and+20+degrees+C%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C.</a> Circulation. 86, 280-288 (1992).</li>
<li>Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+hypothermic+cardiac+storage+with+University+of+Wisconsin+solution.+An+assessment+with+human+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).</li>
<li>Adewola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+cooling+systems+for+the+COBE+2991+cell+separator+used+in+the+purification+of+human+pancreatic+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans.</a> Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).</li>
<li>Keymeulen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+standardized+beta-cell+grafts+in+a+liver+segment+of+IDDM+patients%3A+graft+and+recipients+characteristics+in+two+cases+of+insulin-independence+under+maintenance+immunosuppression+for+prior+kidney+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft.</a> Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).</li>
<li>de Kort, H., de Koning, E. J., Rabelink, T. J., Bruijn, J. A., Bajema, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in type 1 diabetes.</a> BMJ. 342, (2011).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lemarie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+single-platform+method+for+the+enumeration+of+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells.</a> Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Dünyanın dört bir yanındaki adacık izolasyon tesisleri, onlarca yıldır yeniden tasarlanmış bir hücre işlemcisinde insan adacık saflaştırmasını benimsemiştir. Bazı adacık üretim tesisleri, soğutulmamış bir hücre işlemcisinde adacıkları işlemeye devam etse de, çoğu merkez, hücre işlemcisinin 10,11,15 soğutulmuş bir versiyonunu kullanır. Merkezler ya hücre işlemcisini neme ve yoğuşmaya maruz kalma gibi büyük bir dezavantaja sahip o...

Şiddetli Tip 1 diyabet için adacık nakli, endojen insülin sekresyonunu geri yükleyebilir ve birçok ülkede bakım standardı haline gelmiştir1. Adacık izolasyonu, pankreasın ılık enzimatik ve mekanik sindirimini, ardından sindirilmiş dokunun geri kazanımı için soğutulmuş fazları ve bir hücre işlemcisi üzerinde sürekli veya süreksiz yoğunluk gradyanları ile adacık saflaştırmasını içeren çok aşamalı bir prosedürdür. Hızlı soğutma, enzimatik sindirim fazını yavaşlatır ve adacıkları, asiner hücreleri kirleterek salınan sindirim enzimlerinden korur. Hücre işlemcisi başlangıçta hücresel kan bileşenlerini ortam sıcaklığında ayırmak için tasarlanmıştır2. 19893'te Langerhans'ın insan pankreas adacıklarını saflaştırmak için yeniden tasarlandı. Otuz yıl boyunca, insan adacıkları klinik deneyler için saflaştırıldı ve daha yakın zamanda, süreksiz gradyanlar4 veya sürekli yoğunluk gradyanları1 veya eşdeğer bilgisayarla çalışan mikser5,6,7 ile <yapılan bir hücre işlemcisinde bakım standardı haline getirildi. Diğer gruplar, büyük silindirik plastik şişeler kullanarak büyük memelilerden ve insanlardan adacık saflaştırıldığını bildirmiştir8,7,9, bu da saflaştırmanın etkinliğini ve adacık kalitesini önemli ölçüde artırdı.
Gerçekten de, klinik transplantasyon için insan adacıklarını saflaştırmanın altın standardı göz önüne alındığında10,11, üretilen hücre işlemcisi soğutmasızdı. Soğutma eksikliğinin doğrudan bir sonucu olarak, adacıklar arıtma adımı sırasında artan sıcaklıklara maruz bırakıldı. Santrifüjleme sırasında, rotor12,13'ün mekanik sürtünmesi nedeniyle sıcaklıkta kontrolsüz bir artış meydana gelir. Hücre işlemcileri, adacık izolasyon merkezlerinde, glikozun neden olduğu insülin sekresyonunu ve hücre canlılığını istatistiksel olarak artıran bir soğutma sistemi ile uyarlandı ve saflaştırma prosedürü sırasında pankreas adacıklarını düşük sıcaklıklarda tutmanın avantajını doğruladı14,15.
1980'lerin sonlarında, yoğunluk gradyanı saflaştırması sırasında adacık hasarını azaltmak için 10 soğutmalı prototipin üretildiği, ancak daha fazla ilgi görmediği belirtilmelidir. Hücre işlemcisi prototipleri, soğutulmuş polietilen glikol ile iş mili ve çanak soğutmasına dayanıyordu. Özellikle, organ koruma çözeltileri ve polisakkarit yoğunluk gradyanları dahil olmak üzere adacık saflaştırma çözeltileri, oda sıcaklığında veya üzerinde kullanıldığında adacık canlılığı için zararlı olabilir16,17,18. Rotorun sürtünmesi nedeniyle meydana gelen kontrolsüz sıcaklık artışıyla mücadele etmek için adacık hücresi saflaştırması için hücre işlemcisinin orijinal soğutulmamış hücre işlemcisine karşı farklı soğutma stratejilerinin karşılaştırılması değerlendirildi. İnsan adacık saflaştırması sırasında hücre işlemcisini soğutmak için birkaç girişimde bulunulmuştur. Hücre işlemcisi, şu anda Illinois Üniversitesi'ndeki adacık izolasyon merkezlerinde kullanılan gradyan santrifüjleme sırasında 0-8 °C'lik bir sıcaklığı korumak için özel olarak tasarlanmış bir soğuk odaya geçici veya kalıcı olarak yerleştirilebilir<19, Miami Üniversitesi">14, Oxford Üniversitesi tesisleri15ve San Francisco Üniversitesi (özel soğutma ünitesi, hücre işlemcisini kaplar). Diğer bir değişiklik, İsveç'in Cenevre kentinde ve Çek Cumhuriyeti'nde elektronik olarak kontrol edilen sıvı nitrojen soğutması kullanan bir soğutma sistemi ile hücre işlemci milinin çekirdek soğutmasını içerir15,19. 2000'li yılların ortalarında başka bir alternatif, hücre işlemcisinin bir klima ünitesi12 ile çekirdek soğutması veya Lille Üniversitesi'ndeki şaftın sıvı soğutmasıydı.
Hücre işlemcisinin soğutma modifikasyonları kolayca bulunamaz ve GMP temiz oda ortamlarında, garanti kaybı ve üreticinin makineye servis vermeyi reddetmesi dahil olmak üzere risklerle (nem, yoğuşma oluşumu) birlikte gelir. Sonuç olarak, Milano, İtalya, Oslo, Norveç ve Edinburgh, İskoçya dahil olmak üzere bazı adacık merkezleri, adacık saflaştırma işlemi sırasında hücre işlemcileri için bir soğutma sistemi kullanmamaktadır15.
Bu çalışma, minimal düzeyde modifiye edilmiş bir hücre işlemci sistemi ile birlikte yeni geliştirilen hazır bir soğutucunun etkinliğini test etmek için tasarlanmıştır. Kısaca burada açıklanan hava bazlı soğutucu, -40 °C ila -100 °C arasında dakikada 1 standart fit küp (SCFM) kuru gazın sıcaklığını kontrol eden mekanik olarak soğutulmuş bir ısı eşanjörüdür. Bu soğutma sistemi kuru bir tıbbi hava beslemesi gerektirir. Hava, hattan ve ısı eşanjöründen akacak ve (7.9 mm) nozuldan dışarı çıkacaktır. Nozul içinde bulunan bir ısıtıcı, hava akımının sıcaklığını kontrol etmek için ısı sağlar. Yedek bir katı plastik santrifüj kapağı satın alındı ve minimum değişiklikler yapıldı. Kapakta 13,3 mm çapında bir delik açılmış ve soğutulmuş hava, santrifüj kapağındaki delik vasıtasıyla soğutucu nozuldan hücre işlemcisine iletilmiştir. Soğutulmuş tıbbi hava, sıvıların sıcaklığının veya yoğunluk gradyanlarının sürekli kontrolü ile hücre işlemcisinin santrifüj haznesinin içine enjekte edildi.
Soğutulmuş hücre işlemcisinin teknik performansını ve soğutma elemanının GMP temiz oda ortamı üzerindeki etkisini değerlendirdik. Ana odak noktası, canlılığı korumak için insan adacık arıtması sırasında sağlam bir şekilde düşük (<10 °C) bir sıcaklık elde etmekti. Adacık izolasyonu için bir vekil olarak bir buffy coat yoğunluk ayrımı kullanarak, bu soğutma protokolünün hücre canlılığı üzerindeki etkinliğini belirledik.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Hava partikülleri sayacı</td><td>Lasair III&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AirJet XR40 ve nbsp;</td><td>SP Scientific</td><td>FTS sistemi XR40</td><td></td></tr><tr><td>Biyogüvenlik Kabini</td><td>Thermo Scientific</td><td>EQ-1301</td><td></td></tr><tr><td>Sirkülasyonlu Soğutma Chiller</td><td>Julabo</td><td>CF30</td><td></td></tr><tr><td>COBE 2991 &nbsp;</td><td>Terumo BCT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konik Soğutma Tepsisi</td><td>Biorep</td><td>CCT-01</td><td></td></tr><tr><td>Çift ceketli gradyan yapıcı&nbsp;</td><td></td><td></td><td>evde özelleştirilmiş</td></tr><tr><td>KJT-Termokupl Termometre</td><td>Hanna Aletleri</td><td>HI93551N</td><td>Sıvıların sıcaklığını ölçmek için</td></tr><tr><td>Manyetik karıştırıcı ve nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880014</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompa&nbsp;</td><td>MasterFlex</td><td>MK-77921-79</td><td></td></tr><tr><td>Termometre&nbsp;</td><td>Extech Instruments</td><td>RMS 430</td><td>COBE sıcaklığı için</td></tr><tr><td>Susuz Boncuk Banyosu</td><td>Cole-Parmer</td><td>10122-00</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Malzemeler ve reaktifler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD kök hücre sayım kiti</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>344563</tr><tr><td>COBE 2911 boru kiti</td><td>Terumo BCT</td><td>90819</td><td></td></tr><tr><td>Konik Tüpler 250ml</td><td>Corning</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>Gradyan yoğunluğu 1.1</td><td>Biyokrom ve nbsp;</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>Dereceli tek kullanımlık şişeler</td><td>Thermo fisher</td><td>382019-1000</td><td></td></tr><tr><td>İnsan albümini %20&nbsp;</td><td>Kedrion Biyofarma&nbsp;</td><td>8091600</td><td></td></tr><tr><td>M199 yıkama solüsyonu&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>99-784-CM&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex tüpler</td><td>Masterflex</td><td>96400-6</td><td></td></tr><tr><td>Medikal Kuru Hava</td><td>Linde Healthcare</td><td>Medi On 22</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin-streptomisin&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Termoprob</td><td>Biorep</td><td>TC-02</td><td>Termosensör</td></tr><tr><td>Tripan mavi&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Wisconsin Belzer Üniversitesi (UW)&nbsp;</td><td>Hayat Köprüsü&nbsp;</td><td>RM/N 4055</td><td>Koruma Ortamı</td></tr></tbody></table>

yeni bir soğutma hücresi İşlemci sisteminin adacık hücresi İzolasyon tesisi Üzerindeki etkisinin değerlendirilmesi

Evaluation of the Impact of a New Cooling Cell Processor System on Islet Cell Isolation Facility

Klinik transplantasyon için insan adacıklarını saflaştırmak için altın standart hücre işlemcisi de dahil olmak üzere standart hücre tedavisi ekipmanı, nadiren soğutulur ve santrifüjleme adımı sırasında hücreleri potansiyel olarak yüksek sıcaklıklara maruz bırakır. Özel soğutma sistemleri, insan adacık canlılığı ve işlevi üzerinde doğrudan bir faydaya sahiptir. Mevcut çalışma, minimum modifikasyon gerektiren yeni geliştirilmiş, hazır bir soğutulmuş hücre işlemci sisteminin etkinliğini test etmek ve insan hücresi yaşayabilirliği ve GMP temiz oda ortamı üzerindeki etkisini değerlendirmek için tasarlanmıştır. -30 °C'ye ayarlanmış, mekanik olarak soğutulmuş bir ısı eşanjörü olan soğutucu sistem, santrifüj kapağında açılan bir delikten hücre işlemci çanağına soğutulmuş tıbbi sınıf kuru hava vermek için kullanıldı. Katar'da pankreas donörlerinin sınırlı mevcudiyeti nedeniyle, havuzlanmış insan kemik iliği buffy ceketinin sürekli yoğunluk gradyan saflaştırılması ile sistem doğrulaması yapıldı. Sterilite, türbülans ve partikül sayısı C sınıfı ve B sınıfı temiz oda ortamlarında ölçüldü. Soğutulmuş hücre işlemcisinin etrafında herhangi bir türbülans gelişmedi ve temiz oda GMP standartlarına göre aşırı 0,5 μm ve 5 μm havadaki partiküller oluşmadı. Toplama adımlarının başında ve sonunda, sıcaklık soğutmasız hücre işlemcisinde sırasıyla 0,34 °C± 21,93 °C ve 0,20 °C ± 21,93 °C'ye ve soğutulmuş hücreli işlemcide 0,17 °C ± sadece 10,9 °C ve 0,35 °C ± 11,16 °C'ye yükselmiştir (p <0,05). Soğutulmuş hücre işlemcisi, hem mononükleer hücre fraksiyonunun daha iyi geri kazanılmasına (% 98) hem de işlem sonrası canlılığa (% 100 ±% 2) yol açtı. Yeni soğutma sistemi, hücre işlemcisi tarafından üretilen ısıyı etkili bir şekilde azaltırken, GMP temiz oda ortamı üzerinde partikül etkisi yaratmaz. Burada açıklanan soğutulmuş hücre işlemcisi, sağlam soğutma sağlamak için ucuz (vergiler, gümrükleme ve nakliye dahil olmadan 16.000 $) ve minimal invaziv bir yöntemdir. Şu anda, GMP hücre tedavisi tesisindeki bu teknoloji, klinik program için insan adacık hücresi izolasyonu ve transplantasyonuna uygulanmaktadır.

Soğutmalı hücre işlemcisinin GMP temiz oda üzerindeki etkisi öncelikle nicel olarak belirlenmiştir. Standartlaştırılmış yöntemlerde, hücre işlemcisine ve basınçlı hava soğutma sistemine yakın kritik noktalarda, GMP sınıf C ve sınıf B temiz oda ortamındaki hava yoluyla taşınan partikül kontaminasyonunu ölçen bir partikül sayacı kullanılmıştır. Sonuçlar, ekipman çevresinde herhangi bir türbülans oluşmadığını göstermiştir. Kaydedilen veriler, temiz oda GMP sınıf C, sınıf B ve BSL III standartlarına göre 0.5 µm ve 5 µm boyut...

Buradaki protokol, işlem sonrası hücre canlılığını artırmak için iyi üretim uygulamaları (GMP) temiz odasıyla uyumlu özel bir soğutma hücresi işlemci sistemini tanımlar.

Yeni Bir Soğutma Hücresi İşlemci Sisteminin Adacık Hücresi İzolasyon Tesisi Üzerindeki Etkisinin Değerlendirilmesi

Standard cell therapy equipment, including the gold standard cell processor to purify human islets for clinical transplantation, is rarely refrigerated, ...

evaluation-impact-new-cooling-cell-processor-system-on-islet-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu için prosedürler: değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanılarak (bölüm I sindirim ve pankreas dokusu toplanması).

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm I: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon

, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu (Bölüm II: insan adacıklar arıtma ve kültür) için prosedürleri değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanarak.

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm II: İnsan Islets saflaştırılması ve Kültür

Mikroakışkan bir adacık perifusion cihazı, çok sayıda adacık ve kalsiyum girişini ve mitokondriyal potansiyel değişiklikleri eş zamanlı olarak floresan görüntüleme dinamik insülin salgılanması değerlendirilmesi için geliştirilmiştir.

Mikroakışkan Perifusion Cihaz içindeki Multi-Parametrik Islet Perifusion Sistemi

Izole adacık transplantasyonu tip 1 şeker hastalığı için potansiyel bir tedavi olarak öne sürülmüştür. Burada, fare pancreata adacıkları izole, ve böbrek subkapsüler alan nakli için bir yöntem açıklanmaktadır.

Murin Islet İzolasyon ve subkapsüler Böbrek Nakli Bir Yöntem

Araştırma için tip 2 diyabetik adacık kaynağı yetersiz. Burada kısmi pankreatektomi geçiren hastalardan izole adacıklar için protokol paylaşın. Bu yaklaşım, tip 2 diyabetik adacıklar elde etmek için eşsiz bir mekan temsil eder ve temel ve klinik çalışmalar için yeterli sayıda non-diyabetik hastalarda klinik olarak uyumlu.

Kısmen Pancreatectomized hastalar İnsan Islets izolasyonu

Bu adacık izolasyon protokolü ekroz dokuyu sindirmek için kollajenaz enjeksiyonunun yeni bir rotasını ve adacıkları farelerden arındırmak için basitleştirilmiş bir degrade prosedürünü tanımlamıştır. Enzimatik sindirim, degrade ayırma/arıtma ve adacık el toplama içerir. Başarılı yalıtım fare başına 250-350 yüksek kaliteli ve tam işlevsel adacıklar verebilir.

Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü

Bu protokol, adacık izolasyonu ve saflaştırılması için bir domuz pankreasının satın alınması için adım adım bir kılavuz sağlar.

Adacık izolasyonu için domuz pankreasının cerrahi perfüzyonu ve izolasyonu

Bu çalışma, fare pankreasındaki fonksiyonel birincil adacıqları ve asinar hücreleri verimli bir şekilde çıkaran basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdi ve Akut Pankreatit Kaynaklı Diyabetin patogenezinde hücrelerarası iletişimi incelemek için değerli bir araç sağladı.

Farelerden Birincil Adaçik Ve Birincil Pankreas Asinar Hücrelerinin Eşzamanlı İzolasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

Bu protokol, Lewis sıçan pankreas adacıqlarının cerrahi hasamı, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanlı arındırması için standartlaştırılmış bir yöntemi tanımlar; böylece doğrudan nakil veya in vitro çalışmalarda kullanılmak üzere yüksek verimli, yüksek saflıkta preparatlar sağlanır.

Lewis Farelerinden Pankreas Adacığı İzolyasyonu ve Arındırma, Enzimatik Sindirim ve Yoğunluk-Gradient Ayrımı Kullanılarak

Ole Isacson bir özlü, Parkinson Kullanıcı hastalığı genel, nedenleri, tedavi stratejileri ve Parkinson araştırma gelişmeler verir.

Ole Isacson: Parkinson Hastalığı İçin Yeni Tedaviler

Öğrenin, soğutmalı hücre işlemci sistemi ile insan mononükleer hücrelerin GMP temiz oda koşullarında izolasyonunu ve canlılıklarının korunmasını. Bu yöntem, klinik uygulamalar için hücre işleme verimliliğini artırır.

Yeni Bir Soğutma Hücresi İşlemci Sisteminin Adacık Hücresi İzolasyon Tesisi Üzerindeki Etkisinin Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet