Name: Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T13:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Keşfedin embriyonik fare beyinlerinden karışık nöronal ve glial hücre kültürleri oluşturma yöntemini. RT-qPCR, mikroskopi ve akış sitometrisi ile doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını inceleyerek hayvan kullanımını azaltın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Edgar ve Linington laboratuvarlarının üyelerine, özellikle Prof. Chris Linington, Dr. Diana Arseni ve Dr. Katja Muecklisch'e, tavsiyeleri, yararlı yorumları ve bu kültürleri kurarken kültürleri beslemedeki yardımları için teşekkür ederiz. Hücre Profilcisi boru hatları için başlangıç noktaları sağladığı için Dr. Muecklisch'e özellikle teşekkür ederiz. Bu çalışma MS Derneği (hibe 122) ve Yuri ve Lorna Chernajovsky vakfı tarafından MP'ye desteklendi; Glasgow Üniversitesi'nin JC ve MP'ye fon sağlaması; ve Wellcome Trust (217093 / Z / 19 / Z) ve Tıbbi Araştırma Konseyi (MRV0109721) GJG'ye.

Tüm hayvan deneyleri, hayvan kullanımı için yerel yasalara ve yönergelere uygundur ve Glasgow Üniversitesi'ndeki yerel Etik İnceleme Komitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar, İngiltere İçişleri Bakanlığı Proje Lisansı'nın himayesinde, İngiltere Hayvanları Bilimsel Prosedürler Yasası 1986 uyarınca belirli patojensiz koşullarda barındırılmıştır. Bu çalışma için, şirket içi yetiştirilmiş yetişkin C57BL / 6J fareler kullanılmıştır. Gebeliğin daha yüksek başarı oranı nedeniyle genç kadınların (8-12 hafta) kullanılması önerilir; Erkekler birden fazla üreme turu için tekrar kullanılabilir. Şekil 1 , karışık nöronal ve glial kültürler oluşturmak için tarif edilen yöntemin şematik bir özetini temsil etmektedir.
1. Doku kültürü sarf malzemelerinin hazırlanması
<ol><li>Sınıf 2 Güvenlik kabini içinde mikroskopi kapakları içeren tabakları ve/veya bulaşıkları hazırlayın. Kültür döneminde steriliteyi sağlamak için tüm reaktifleri veya otoklavı sterilize edin.</li>
	<li>Her bir kuyucuğa uygun miktarda BA-PLL (borik asit tamponunda [BA] [50 mM borik asit, 12,5 mM sodyum tetraborat, pH 8,5]; bkz. Malzeme Tablosunda 1.000 μL/kuyu, 96 delikli bir plakada 100 μL/kuyu; hacimler Tablo 1'de özetlenmiştir) uygun hacimde BA-PLL (13,2 μg/mL poli-L-lizinhidrobromür [PLL]) ekleyin. Mikroskopi kapakları için, 200 steril kapak fişi içeren 9 cm çapında bir doku kültürü kabına 20 mL BA-PLL ekleyin ve eşit olarak dağıtmak için girdap yapın.</li>
	<li>1-2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>BA-PLL çözeltisini mikroskopi kapakları içeren her bir kuyucuktan veya tabaktan çıkarın ve 20 mL steril su ekleyerek, kapak kapaklarını döndürerek ve ardından suyu çıkararak yıkayın. Bu yıkama adımını üç kez tekrarlayın. Kapak fişleri içeren bir tabakta, kapak kapaklarını kolayca çıkarmak için son yıkamada doku kültürü kabında steril su bırakın.</li>
	<li>Steril bir pipetle mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın ve gece boyunca en az 2 saat kurumaya bırakın.</li>
	<li>Kaplanan plakaları 4 °C'de 2 aya kadar saklayın. NOT: Poli-l-lizin (BA-PLL) çözeltisi ile hazırlanan borik asit, her seferinde yeni PLL eklenerek üç defaya kadar tekrar kullanılabilir. BA-PLL'yi 4 °C'de saklayın. Bulaşıklar BA-PLL ile muamele edilir, çünkü PLL hücrelerin yapışmasına ve büyümesine izin verir. Bu tedavi olmadan, hücreler yaklaşık 1 haftalık kültürden sonra kalkacak ve artık farklılaşamayacaktır.</li>
</ol>2. E17 embriyonal beyinlerinin diseksiyonu
<ol><li>Bir veya daha fazla dişi fareyi bir erkek fare ile birlikte barındırın. Dişileri günlük olarak bir mukus tıkacı için kontrol edin, bu da çiftleşmenin gerçekleştiğini gösterir. NOT: Herhangi bir "tıkanmış" dişi farenin, gebeliğin doğru başlangıç tarihini sağlamak için erkekten ayrılması gerekir. Fareler hamileliği doğrulamak için tartılabilir veya görsel olarak izlenebilir.</li>
	<li>Hamile fareyi E17'de, örneğin karbondioksit (CO2) konsantrasyonunu yükselterek, ölümcül anestezik doz aşımı veya boynun çıkığı gibi yerel hayvan refahı rehberliğine ve yasalarına uygun uygun yöntemler kullanarak itlaf edin. NOT: Seçilen yöntem embriyoları bozmamalıdır. Bu çalışma için, artan bir karbondioksit gazı konsantrasyonuna maruz kalmanın ardından femoral arterin kesilmesiyle ölümün doğrulanması gebe barajları yok etmek için kullanılmıştır.</li>
	<li>Culled, hamile fareyi sırtına bir diseksiyon tahtasına yerleştirin; sabitlemek gerekli olmasa da, deneyimsiz araştırmacılar için daha kolay olabilir. Forseps kullanarak karın orta hattını sıkıştırın. Keskin makas kullanarak, uterusu delmemeye dikkat ederek, karnı deriden ve orta hat üzerindeki peritondan cinsel organdan göğüs kafesine kadar kesin.<ol><li>Fare rahminin, her biri tipik olarak bir ila beş embriyo içeren iki boynuzu vardır. Embriyoları içeren uterusu anneden çıkarın ve hemen buzun üzerine yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Plasentaların yanındaki yumurta sarısı torbasını kesin, embriyolara zarar vermemeye dikkat edin ve embriyoları yumurta sarısı çuvalından çıkarın.</li>
	<li>Hemen embriyoların kafasını kesin. Kafası kesilmiş kafaları, buz üzerinde kalsiyum (Ca 2+) ve magnezyum (Mg2+) (HBSS-/-) içermeyen Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile bir kaba ekleyin. NOT: Genotipleme gerekiyorsa, genetik analiz için bu aşamada kuyruk çıkarılabilir. Birden fazla genotip beklendiğinde, her embriyonun başları kültürleme için ayrı tutulmalıdır.</li>
	<li>Açılı forseps kullanarak, kafayı sola bakan tarafına yerleştirin.</li>
	<li>Forsepsin bir kenarıyla gözü delin, çeneyi diğeriyle sıkıca tutun.</li>
	<li>Enseden başlayarak, kafa derisinin derisini orta çizgi boyunca burun ucuna doğru yavaşça yırtın.</li>
	<li>Beyaz bir oval olarak fark edilen omurilikten girerek, kafatasını orta hat boyunca açmak ve beyni açığa çıkarmak için açılı forsepsleri kullanın.</li>
	<li>Kafatasını yukarı bakan taraftan yavaşça soyun ve beyni açığa çıkarın.</li>
	<li>Beyni kafatasından çıkarın, beyin tamamen çıkarıldıktan sonra kafatasını atın.</li>
	<li>Forsepsleri kullanarak, yoğun kan damarlarına sahip ince bir zar olarak fark edilen meninksleri çıkarın.</li>
	<li>Beyinleri buz üzerinde 2 mL HBSS-/- içeren bir bijou'ya ( Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.</li>
	<li>2.6 ila 2.13 arasındaki adımları kalan beyinlerle tekrarlayın ve bijou başına dört adede kadar beyin ekleyin.</li>
	<li>Bijou'ya 250 μL 10x tripsin ekleyin ve bijou'yu sallayarak beyinleri üçe katlayın. 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. NOT: Bu noktadan itibaren tüm adımlar steril doku kültürü başlığında gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>2 mL soya fasulyesi tripsin (SD) inhibitörü (Leibovitz L-15, soya fasulyesinden 0.52 mg/mL tripsin inhibitörü, 40 μg/mL DNaz I, 3 mg/mL sığır serum albümini [BSA] fraksiyonu V; bakınız Malzeme Tablosu) -20 °C'den 37 °C'ye yerleştirerek çözün.</li>
	<li>Her bijou içeren beyine 2 mL SD inhibitörü ekleyin (dört adede kadar beyin içeren bijou başına), bijou'yu eşit şekilde dağıtmak için tekrar sallayın. NOT: SD inhibitörü, numunelerin gereksiz yere sindirilmesini önlemek ve hücre canlılığını korumak için tripsin aktivitesini azaltır.</li>
	<li>Santrifüjleme olmadan, her bir bijou'dan 2 mL süpernatantı çıkarın ve hücre kümelerini aktarmamaya dikkat ederek 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Bijou'da kalan hücreleri, süspansiyonu iki kez aspire ederek 5 mL'lik bir şırıngaya tutturulmuş 19 G'lik bir iğne ile tritüre edin. Bu, kalın bir mukus benzeri karışım yaratacaktır.<ol><li>21 G'lık bir iğne kullanarak iki kez daha tekrarlayın. Kalan kümeler varsa, 21 G iğne ile bir kez daha tritüre edin.</li>
	</ol></li>
	<li>23 G'lik bir iğne kullanarak hücreleri bijou'dan aynı 15 mL santrifüj tüpüne (adım 2.18'den itibaren) aktarın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında (RT) 200 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj.</li>
	<li>Tüm süpernatantı 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak çıkarın ve gerekli hücreleri içeren alttaki gevşek peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek başka bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Süpernatantı RT'de 200 x g'de 5 dakika boyunca tekrar santrifüj edin. NOT: Bu adım gerekli değildir, ancak çok sayıda hücreye ihtiyaç duyulursa veya az sayıda embriyo varsa, süpernatandan mümkün olduğunca çok hücre kurtarmak için bu adımı gerçekleştirebilirsiniz.</li>
	<li>10 mL kaplama ortamı (PM) kullanarak (%49 Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı [DMEM], %1 penisilin/streptomisin [Pen/Strep], %25 at serumu, %25 HBSS ile Ca 2+ ve Mg2 + [HBSS+ /+]; bakınız Malzeme Tablosu), bütün bir hücre süspansiyonu oluşturmak için iki peleti birleştirin ve yeniden askıya alın.</li>
	<li>Tripan mavisi ve bir hemositometre veya dijital hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunu PM ile 1.8 x 106 hücre / mL konsantrasyonuna kadar seyreltin.</li>
</ol>3. Hücrelerin kaplanması
<ol><li>Hücre süspansiyonunun gerekli hacmini Tablo 1'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi gerekli formata ekleyin: 6 kuyucuklu formatta kuyu başına 1.000 μL, 96 kuyucuklu formatta kuyu başına 50 μL veya kapak kayması başına 100 μL.</li>
	<li>37 ° C'de 2-4 saat boyunca% 5 -% 7 CO2 ile inkübe edin. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücrelerin yapışıp yapışmadığını kontrol edin.</li>
	<li>Ortamı çıkarın ve yeni farklılaştırma medyası (DM+: DM- 10 μg/mL insülin dahil. DM-: DMEM, %1 Kalem/Strep, 50 nM hidrokortizon, 10 ng/mL biyotin, 2,5 mL 100x N1 ortam takviyesi; Bkz. Malzeme Tablosu). Birimler Tablo 1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Steril bir pipet ucu kullanarak yüzen kapak fişlerini bastırın.</li>
</ol>4. Kültürlerin sürdürülmesi
NOT: Bu kültürler, optimal büyümeyi ve farklılaşmayı desteklemek için haftada üç kez beslenmeyi gerektirir. Kültürler, DIV ( in vitro günler) 21 üzerindeki deneyler için optimum sağlık ve olgunluğa ulaşacaktır. Hücreler 28 güne kadar kültürde tutulabilir, bundan sonra kültürler hızla dejenere olur.
<ol><li>DIV12'ye kadar haftada üç kez, 6 kuyucuklu formatta kuyu başına 500 μL, 96 kuyucuklu formatta kuyu başına 50 μL veya üç kapak fişi içeren çanak başına 500 μL çıkararak ve 6 kuyucuklu formatta kuyu başına 600 μL, 96 kuyucuklu formatta kuyu başına 60 μL ekleyerek süpernatantın bir kısmını taze DM+ ile değiştirin, veya kapak kayması çanağı başına 600 μL (Tablo 1).</li>
	<li>DIV13'ten itibaren haftada üç kez, 6 kuyucuklu formatta kuyu başına 500 μL, 96 kuyucuklu formatta kuyu başına 50 μL veya üç kapak fişi içeren çanak başına 500 μL çıkararak ve 6 kuyucuklu formatta kuyu başına 600 μL, 96 kuyucuklu formatta kuyu başına 60 μL ekleyerek süpernatantın bir kısmını taze DM- ile değiştirin, veya kapak kayması çanağı başına 600 μL (Tablo 1).</li>
</ol>

Enfeksiyon ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Embriyonik Fare Beyni Karışık Hücre Kültürleri

<ol><li>Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKovacs%2C+GG+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22">Handbook of Clinical Neurology</a>. 145, Elsevier. 13-23 (2018).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Techniques%22">The Principles of Humane Experimental Techniques</a>. 1, Methuen. (1959).</li>
<li>Hubrecht, R. C., Carter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3Rs+and+humane+experimental+technique%3A+Implementing+change%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change.</a> Animals. 9 (10), 754(2019).</li>
<li>Thomson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((synapsing+cultures+of+murine+spinal+cord-validation+as+an+in+vitro+model+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system.</a> The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).</li>
<li>Bijland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+for+studying+CNS+white+matter%3A+Functional+properties+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches.</a> F1000Research. 8, 117(2019).</li>
<li>Fragkoudis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+and+oligodendrocytes+in+the+mouse+brain+differ+in+their+ability+to+replicate+Semliki+Forest+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurovirology%22%5BJournal%5D)">Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus.</a> Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).</li>
<li>Hayden, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-specific+IgMs+induce+antiviral+responses+in+the+CNS%3A+Implications+for+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis.</a> Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135(2020).</li>
<li>Kantzer, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-ACSA-2+defines+a+novel+monoclonal+antibody+for+prospective+isolation+of+living+neonatal+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes.</a> Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).</li>
<li>Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microglia+and+macrophages+in+CNS+homeostasis%2C+autoimmunity%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer.</a> Journal of Immunology Research. 2017, (2017).</li>
<li>Gee, J. R., Keller, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%3A+Regulation+of+brain+homeostasis+via+apolipoprotein+E%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).</li>
<li>Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+myelination%3A+possible+roles+of+the+immune+proteasome+in+oligodendroglial+homeostasis+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction.</a> Frontiers in Neuroscience. 16, 867357(2022).</li>
<li>Keller, D., Erö, C., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+densities+in+the+mouse+brain%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Cell densities in the mouse brain: A systematic review.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83(2018).</li>
<li>Wang, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygenglucose+deprivation+enhancement+of+cell+death%2Fapoptosis+in+PC12+cells+and+hippocampal+neurons+correlates+with+changes+in+neuronal+excitatory+amino+acid+neurotransmitter+signaling+and+potassium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents.</a> Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).</li>
<li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+response+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%3A+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).</li>
<li>Chen, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology+atlas+of+the+developing+prenatal+and+postnatal+mouse+central+nervous+system%2C+with+emphasis+on+prenatal+days+E7.5+to+E18.5%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5.</a> Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).</li>
<li>Gordon, J., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+overview+of+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).</li>
<li>Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+decades+of+new+drug+development+for+central+nervous+system+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Two decades of new drug development for central nervous system disorders.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).</li>
<li>Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+new+approaches+in+CNS+drug+discovery%3A+Why+drugs+have+failed%2C+and+what+can+be+done+to+improve+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes.</a> Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).</li>
<li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> Journal of Neuroscience. 32 (18), 6391-6410 (2012).</li>
<li>Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+cells+%28polydendrocytes%29+in+brain+physiology+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 133(2014).</li>
<li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+brain+organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells%3A+Promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59(2017).</li>
<li>Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+and+actin-containing+filaments+of+normal%2C+preneoplastic%2C+and+neoplastic+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells.</a> Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).</li>
<li>Koch, K. S., Leffertt, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+control+of+differentiated+adult+rat+hepatocytes+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).</li>
<li>Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+the+infiltrating+immune+cells+in+the+brain+of+healthy+individuals%3A+effect+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity+and+Ageing%22%5BJournal%5D)">Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging.</a> Immunity and Ageing. 19 (1), 45(2022).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412(2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

CNS, beyinden omuriliğe kadar uzanan karmaşık bir ağdır ve ağırlıklı olarak nöronlar, oligodendrositler, astrositler ve mikroglia1 olmak üzere birçok hücre tipinden oluşur. Her hücrenin homeostazı korumada ve CNS 9,10,11'deki zorluklara uygun yanıtlar üretmede önemli bir rolü olduğundan, tüm bu hücre tiplerini içeren bir kültür sistemi, beynin bir uyarana nasıl tepki verebileceğini araştırmak için yararlı...

Merkezi sinir sistemi (CNS) hakkındaki anlayışımızı geliştirmek, birçok nöroinflamatuar ve nörodejeneratif hastalık için terapötik seçenekleri geliştirmek için kritik öneme sahiptir. Beyin, omurilik ve optik sinirler içindeki birbirine bağlı hücrelerin karmaşık bir ağı olan CNS, nöronlar, oligodendrositler, astrositler ve bunların doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olan mikroglia1'i içerir. İn vitro bir yaklaşım genellikle anlamlı araştırmalar yapmak için gereken fare sayısını önemli ölçüde azaltabilir; Bununla birlikte, CNS'nin karmaşık doğası, hücre hatlarını kullanarak in vivo durumu özetlemeyi imkansız kılar. Karışık nöral hücre kültürleri, Replasman, İndirgeme ve İyileştirme (3R) ilkeleri 2,3 doğrultusunda, ilgili bir modelde nöro(immüno)loji sorularını araştırmak için son derece değerli bir araştırma aracı sağlar.
Thomson ve ark., yukarıda belirtilen tüm ana CNShücre tiplerine farklılaşan prenatal omurilik hücrelerini kullanarak bir hücre kültürü yöntemi tanımlamıştır. Bu sistem ayrıca sinaps oluşumuna, miyelinli aksonlara ve Ranvier düğümlerine sahiptir. Bu kültürleme yönteminin temel sınırlaması, omurilik olarak, beyni yararlı bir şekilde modellememesi ve embriyonik gün 13 (E13) omuriliklerinden elde edilen hücre veriminin daralmasıdır. Bu nedenle, bu, araştırılabilecek deneysel koşulların sayısını sınırlar. Bu nedenle, bu çalışma, hayvanlara olan gereksinimleri azaltmak için artan hücre verimi ile beynin özelliklerini özetleyen yeni bir hücre kültürü sistemi geliştirmeyi amaçlamıştır.
Thomson ve ark.'yı başlangıç noktası olarak kullanarak, tamamen doğum öncesi fare beyinlerinden türetilmiş bir hücre kültürü modeli geliştirdik. Bu kültürler, omurilik kültürleriyle aynı hücre popülasyonlarına, birbirine bağlanabilirliğe ve tedavi seçeneklerine sahiptir, ancak karşılaştırıldığında daha az miyelinasyon vardır. Bununla birlikte, yaklaşık üç kat daha yüksek hücre verimine sahip bir CNS in vitro modeline sahip olmak daha verimlidir ve daha az fare ve daha az zaman işleme embriyosu gerektirir. Bu benzersiz kültür sistemini, mikroskopi analizi için cam kapak fişleri ve yüksek verimli araştırmalar için 96 delikli plakalar da dahil olmak üzere çeşitli boyutlarda plastik kuyu plakaları kullanmak da dahil olmak üzere birden fazla aşağı akış uygulaması ve terazisi için optimize ettik.

<table><tbody><tr><td>10x Tripsin</td><td>Sigma</td><td>T4549-100ML</td><td>Dokuyu sindirmek için</td></tr><tr><td>140 mm TC Çanak</td><td>Fisher</td><td>11339283</td><td>1 140 mm'lik çanak başına 8 35 mm tabak koyun</td></tr><tr><td>15 mL Falcon</td><td>Sarstedt</td><td>62554502</td><td>Kaplama ortamında yeniden süspansiyon için hücreleri pelet halinde toplamak için</td></tr><tr><td>18 G iğne</td><td>Henke Sass</td><td>Wolf 4710012040</td><td>Numunenin öğütülmesi için</td></tr><tr><td>21 G iğne</td><td>BD</td><td>304432</td><td>Numunenin öğütülmesi için</td></tr><tr><td>23 G iğne</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710006030</td><td>Numunenin öğütülmesi için</td></tr><tr><td>35 mm TC Çanak</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>Plaka çıkışı 1 35 mm çanak başına 3 PLL kaplı lamel</td></tr><tr><td>5 mL şırınga</td><td>Fisher</td><td>15869152</td><td>Numunenin öğütülmesi için</td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>RT-qPCR ve akış için hücreleri plakalamak için sitometri</td></tr><tr><td>7 mL Bijuteri</td><td>Fisher</td><td>DIS080010R</td><td>Beyin koymak için intp</td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Yüksek verimli test için hücreleri ayırmak için</td></tr><tr><td>ACSA-2 Antikor, anti-fare, PE</td><td>Miltenyi</td><td>130-123-284</td><td>Astrositlerin akış sitometrisi boyaması için</td></tr><tr><td>Açılı forseps</td><td>Dumont</td><td>0108-5/45-PO</td><td>Diseksiyon için</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>DM +/-</td> Borik Asit için <td>Sigma</td><td>B4501</td></tr> <tr><td></td><td>Borik asit tamponu için</td><td>Sigma</td><td>B6768-500G</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-fare CD24 Antikor, klon M1-69</td><td>Biolegend</td><td>101825</td><td>Nöronların ve astrositlerin akış sitometrisi boyaması için</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-fare CD45 Antikor, klon 30-F11</td><td>Biolegend</td><td>103139</td><td>Mikroglia'nın</td></tr> <tr><td>akış sitometrisi boyaması içinBrilliant Violet 785 anti-fare / insan CD11b Antikoru, klon M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101243</td><td>Mikroglia'nın akış sitometrisi boyaması için</td></tr><tr><td>BSA Fraksiyon V</td><td>Sigma</td><td>A3059-10G</td><td>SD İnhibitörü</td></tr><tr><td></td><td>CNP için Abcam</td><td>AB6319</td><td>Olgun oligodendrositler</td></tr><tr><td>Lamel</td><td>VWR</td><td>631-0149</td><td>Mikroskopi</td></tr><tr><td>Diseksiyonu için hücreleri</td> ayırmak için Makas <td>Sigma</td><td>S3146-1EA</td><td>Diseksiyon için</td></tr><tr><td>DMEM Yüksek glikoz, sodyum piruvat, L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td>DM +/- için ve kaplama ortamı için</td></tr><tr>SD İnhibitörü için<td>DNase I</td><td>Thermofisher</td><td>18047019</td><td>, bunu veya sigma DNase I'den diğer Dnase'yi kullanabilir</td></tr><tr><td></td> SD İnhibitörü için <td>Sigma</td><td>D4263</td><td>, bunu veya thermofisher eBioscience'tan diğer Dnase'yi kullanabilir</td></tr><tr><td>Sabitlenebilir Canlılık Boyası eFluor 780</td><td>Thermofisher</td><td>65-0865-14</td><td>Canlı / Ölü leke</td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>Dumont</td><td>0102-SS135-PO</td><td>Diseksiyon için</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Invitrogen</td><td>13-0300</td><td>Astrositler</td></tr><tr><td>HBSS w Ca Mg</td><td>Sigma</td><td>H9269-500ML</td><td>Kaplama ortamı için</td></tr><tr><td>HBSS w / o Ca Mg</td><td>Sigma</td><td>H9394-500ML</td><td>At Serumuna</td></tr> <tr><td></td><td>eklenecek beyinler içinGibco</td><td>26050-070</td><td>Kaplama ortamı için</td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td>DM +/-</td></tr> <tr><td>Iba1</td><td>Alfa Laboratuvarları</td><td>için 019-1971</td> DM + <td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15</td><td>için Microglia</td> İnsülin Sigma I1882 SD <td>İnhibitörü</td>MBP Bio-Rad MCA409S Miyelin <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>için GIbco 11415-049Fare CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kiti</td><td>BioTechne</td><td>DY478-05</td><td>96 oyuklu plakanın süpernatantlarında CCL5 konsantrasyonunu ölçmek için ELISA kiti</td></tr><tr><td>N1 medya takviyesi</td><td>Sigma</td><td>N6530-5ML</td><td>DM +/-</td></tr> <tr><td>Nestin</td><td></td><td>Merck MAB353</td><td>için Nöronal kök / progenitör hücreler</td></tr><tr><td>NeuN</td><td>Thermofisher</td><td>PA578499</td><td>Nöronal hücre gövdesi</td></tr><tr><td>NG2</td><td>Sigma</td><td>AB5320</td><td>Olgunlaşmamış oligodendrositler</td></tr><tr><td>O4 Antikoru, anti-insan/fare/sıçan, APC</td><td>Miltenyi</td><td>130-119-155</td><td>Oligodendrositlerin akış sitometrisi boyaması için</td></tr><tr><td>Kalem/Strep</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td>DM +/- için ve kaplama ortamı için</td></tr><tr><td>Poli-L-Lizinhidrobromür</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>Borik asit / poli-L-lizin çözeltisi için lameller kaplamak için</td></tr><tr><td>SMI31</td><td>BioLegend</td><td>801601</td><td>Axons</td></tr><tr><td>Sodyum Tetraborat</td><td>Sigma</td><td>221732-100G</td><td>Borik asit tamponu için</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermofisher</td><td>15596026</td> SD İnhibitörü için soya fasulyesi Sigma T9003-100MG'den <td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>Tripsin inhibitörü</td><td></td><td></td><td></td></tr> için hücreleri parçalamak için</tbody></table>

embriyonik fare beyinlerinden enfeksiyonu ve doğuştan gelen bağışıklığı İncelemek için karışık nöronal ve glial hücre kültürleri oluşturmak

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

Merkezi sinir sistemi (CNS) modelleri, in vivo olarak bulunan birbirine bağlı hücrelerin karmaşık ağını özetlemelidir.CNS öncelikle nöronlar, astrositler, oligodendrositler ve mikroglia'dan oluşur. Hayvan kullanımını değiştirme ve azaltma çabalarının artması nedeniyle, CNS enfeksiyonları ve patolojileri için terapötiklerin geliştirilmesine izin veren doğuştan gelen hücre özelliklerini keşfetmek için çeşitli in vitro hücre kültürü sistemleri geliştirilmiştir. Bazı araştırma soruları, (indüklenmiş) pluripotent kök hücreler gibi insan temelli hücre kültürü sistemleri tarafından ele alınabilirken, insan hücreleriyle çalışmanın kullanılabilirlik, maliyetler ve etik açısından kendi sınırlamaları vardır. Burada, embriyonik fare beyinlerinden hücreleri izole etmek ve kültürlemek için benzersiz bir protokol açıklıyoruz. Ortaya çıkan karışık nöral hücre kültürleri, beyinde in vivo olarak bulunan çeşitli hücre popülasyonlarını ve etkileşimlerini taklit eder. Mevcut eşdeğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokol beynin özelliklerini daha yakından taklit eder ve ayrıca daha fazla hücre toplar, böylece hamile bir fareden daha fazla deneysel koşulun araştırılmasına izin verir. Ayrıca, protokol nispeten kolay ve yüksek oranda tekrarlanabilir. Bu kültürler, 96 kuyucuklu yüksek verimli ekranlar, 24 kuyucuklu mikroskopi analizi ve akış sitometrisi ve ters transkripsiyon-kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) analizi için 6 kuyucuklu kültürler dahil olmak üzere çeşitli ölçeklerde kullanım için optimize edilmiştir. Bu kültür yöntemi, in vitro yöntemlerin rahatlığı ile CNS'nin bazı karmaşıklıkları bağlamında enfeksiyon ve bağışıklığı araştırmak için güçlü bir araçtır.

Mikroskopi Cam örtüler üzerinde yetiştirilen kültürler mikroskopi ile analiz etmek için idealdir. Kültürlerin gelişimini görselleştirmek için, kapak kaymaları DIV0'dan (hücreler bağlandıktan sonra) DIV28'e kadar birçok zaman noktasında% 4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitlendi. Kültürler, daha önce tarif edildiği gibi immünofloresan görüntüleme için boyandı5 üç farklı boyama kombinasyonu kullanılarak: gelişimsel belirteçler olarak NG2 (olgunlaşmamış oligodendrositler) ve nesti...

Bu protokol, nöro (immüno) loji araştırması için embriyonik gün 17 fare beyinlerinden merkezi sinir sistemi hücre kültürleri üretmenin benzersiz bir yolunu sunar. Bu model, RT-qPCR, mikroskopi, ELISA ve akış sitometrisi dahil olmak üzere çeşitli deneysel teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

Projemin nihai araştırma sorusu, viral enfeksiyonlara karşı korunmak için merkezi sinir sisteminin doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini nasıl manipüle edebileceğimizi bulmaktır. Şu anda, derin antiviral protein interferon beta'ya tepkilerini araştırıyoruz. Deneysel bir zorluk, ayrıntılı araştırmaya izin verecek kadar hücre üretmektir.Her sonucun birden fazla teknik kullanılarak doğrulanması gerekir ve bu maalesef birçok hayvanın itlaf edilmesine neden olabilir. Bu yeni kültür tekniği tarafından üretilen çok sayıda hücre nedeniyle, hamile bir fareden birçok farklı deneysel koşul araştırılabilir. Ek olarak, mümkün olduğunda in vitro alternatiflerin kullanılması da hayvanların acı çekmesini büyük ölçüde azaltır.Bu yöntem, üç Rs'nin ilkelerini yakından takip ederek hayvan kullanımını azaltır ve rafine eder.Bu kültür yöntemi, ELISA, qPCR, mikroskopi ve akış sitometrisi gibi çeşitli okuma yöntemlerini kullanarak birçok farklı araştırma sorusunu ele almak için kullanılabilir. Bu teknik, diğer araştırmacıların hayvan kullanımlarını azaltmalarına ve iyileştirmelerine yardımcı olabilir. Doğuştan gelen antiviral yanıt hakkındaki anlayışımızı geliştirmeyi, insan polyomavirüs 2 veya John Cunningham virüsü gibi fırsatçı virüslere karşı korunmak için modüle etmeyi, yaygın olarak bilindiği gibi, MS ve diğer hastalıkları tedavi etmek için kullanılan bağışıklık baskılayıcı ilaçların ciddi bir yan etkisi olabilen PML'nin birincil ajanı olmayı umuyoruz.

establishing-mixed-neuronal-glial-cell-cultures-from-embryonic-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu makale, olgun oligodendrosit (EKK) üretmek için ayırt primer kültür fare oligodendrosit öncü hücreler (OPC) zenginleştirilmiş nüfus, elde etmek için yöntemler anlatılmaktadır. Buna ek olarak, bu rapor üretmek için teknikler açıklar fare fare dorsal kök ganglion nöronlar (DRGNs) neurite yatağa fare OPC ekim ortak kültürler myelinating.

Post-natal murin Dokular Co-kültürler Myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit Kültürleri ve oligodendrosit / Nöron türetilmesi

Bu yüksek bir besleyici hücre glial tabakanın kullanımı olmaksızın prenatal fare beyinlerinden hipokampal nöronlar saflaştırılmış kültürü için bir protokolü sağlar.

Prenatal Fareler gelen Hipokampal Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Video, yenidoğan bir fare beyninden hücreleri izole etme ve kültürleme yöntemini gösterdi. Beynin enzimatik ve mekanik ayrışmasını ve ardından karışık bir glial popülasyon elde etmek için nöronal büyüme faktörü olmayan büyüme ortamında kültürlemeyi içeriyordu.

Yenidoğan Fare Beyninden Karışık Glial Hücre Kültürü Elde Edilmesi

Bu videoda, yetişkin fare omurilik dokusundan birincil karışık glial hücrelerin izole edilmesi ve kültürlenmesi için bir teknik gösterilmektedir. Protokol, dokunun enzimatik sindirimini ve ardından tek hücreli bir popülasyon elde etmek için kırık hücre zarlarının ve miyelin kalıntılarının çıkarılmasını içerir. Hücreler daha sonra karışık glial hücre büyümesi için optimize edilmiş ortamda kültürlenir.

Bir Fare Omuriliğinden Primer Karışık Glial Hücre Kültürlerinin Oluşturulması

Bu enterik sinir sisteminin nöronal ve glial bileşenlerin doğrudan çalışma için bir hücre kültür protokolü göstermektedir. Lamelleri bir nöron / glia karışık kültür, immünohistokimyasal elektrofizyoloji, bireysel nöron ve glia fonksiyonu incelemek için yeteneği sağlayan yetişkin fare myenterik pleksustan...

Bir<em&gt; In-vitro</emYetişkin Mouse myenterik Pleksus izole edilen enterik Nöronlar ve Glia bir&gt; hazırlanması

Burada subventricular bölgesi ve bireysel yetişkin farelerin kıvrımlarının gelen yapışkan tek katman veya neurospheres ya gibi, sinir öncü hücre kültürlerinin eş zamanlı üretimi için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler&#39;den Kök Hücre

nöropatik ağrı gelişimi omurilik glial hücrelerin patolojik değişiklikleri kapsar. Bu hücrelerin in vitro incelenmesi için, yetişkin omurilik dokusu elde edilir ve tasarlanmış güvenilir bir glial kültür sistemi yoksundur. Bu nedenle, biz yetişkin fare omurilik dokusu primer karışık glial kültürlerin nasıl kurulabileceğini burada gösteriyor.

Yetişkin Fare Omurilik Doku İlköğretim Karışık glial Kültürler hazırlanması

In vitro deneylerin vivo koşullarını mümkün olduğunca yeterli şekilde yansıtmak için yapılması kolay bir iş değildir. Birincil hücre kültürlerinin kullanımı bütün bir organizmada hücre biyolojisini anlamaya yönelik önemli bir adımdır. Sağlanan protokol nasıl başarılı bir şekilde büyümek ve kültür embriyonik fare serebellar nöronlar özetliyor.

Embriyonik Fare Beyincisinden İzole Edilen Nöronların Birincil Kültürü

Burada, bir fare CNS'sinden çoklu glial hücre popülasyonlarının in vitro izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, bölgesel mikroglia, oligodendrosit öncü hücreleri ve astrositlerin çeşitli kültür sistemlerinde her birinin fenotiplerini incelemek için ayrılmasına izin verir.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

Bu protokol, embriyonik 15-16. günlerde fare embriyolarından izole edilen primer nöronal hücrelerden ve doğum sonrası 1-2. günlerde yenidoğan farelerinin beyinlerinden üretilen primer mikrogliadan kurulan bir mikroglia-nöronal ko-kültürü tanımlar.

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi

Keşfedin embriyonik fare beyinlerinden karışık nöronal ve glial hücre kültürleri oluşturma yöntemini. RT-qPCR, mikroskopi ve akış sitometrisi ile doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını inceleyerek hayvan kullanımını azaltın.

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak (Video) | JoVE Journal

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak

Daha fazla video keşfet