Normothermic Ex Vivo Karaciğer Makinesi Farede Perfüzyon
September 25th, 2023
Fare karaciğerleri için normotermik ex vivo karaciğer perfüzyonu (NEVLP) sistemi oluşturuldu. Bu sistem mikrocerrahide deneyim gerektirir ancak tekrarlanabilir perfüzyon sonuçlarına izin verir. Fare karaciğerlerini kullanma yeteneği, yeni perfüzyon katkı maddelerini tanımlamak için moleküler yolakların araştırılmasını kolaylaştırır ve organ onarımına odaklanan deneylerin yürütülmesini sağlar.
Normothermic Ex-Vivo Karaciğer Makinesi Farede Perfüzyon. Norannemik oksijenli karaciğer perfüzyonu, marjinal organları kurtarmak için umut verici bir stratejidir ve son zamanlarda klinik pratikte kullanılmaya başlanmıştır. Bununla birlikte, altta yatan moleküler mekanizmalar iyi anlaşılmamıştır.
Transgenik fareler gibi genetiği değiştirilmiş hayvanlardan yararlanarak moleküler yolları daha fazla incelemek için bir fare modeline ihtiyaç vardır, bu nedenle fare karaciğerleri için normotermik oksijenli bir makine perfüzyon sistemi kurulmasını beklemektedir. İşte tüm sistemimizin bir şeması. İlk olarak, tüm sistem su sirkülasyonu yoluyla bir termostatik kontrolör tarafından 37 santigrat derecede kontrol edilir.
Perfusat, rezervuardan peristaltik bir pompa ile bir oksijenatöre pompalanır. Oksijenatörde %95 oksijen ve %5 karbondioksit olmak üzere kesintisiz gaz akışı vardır. Perfüzyon daha sonra bir kabarcık tuzağından geçer.
Hava kabarcıkları ile perfüzyon, basınç altında rezervuara geri pompalanır. Kalan perfüzyonat, tüpün portal vene bağlandığı organ odasına akar. Perfüzyonat karaciğerden suprahepatik kava yoluyla organ odasına boşaltılır.
Organ odasından perfüzyonat çıkışı, peristaltik pompa tarafından rezervuara geri yönlendirilir. Safra toplamak için organ odasına bir safra drenaj tüpü bağlanır. Bu bizim ameliyat masamız.
Tüm ameliyatlar mikroskop altında yapılır. Cerrahi prosedür boyunca yarı steril çalışma koşullarını koruyoruz. Fransız tüp kanülünü forseps ile tutun.
Kanül duvarına 30G iğne ile kanülün ucundan bir santimetre mesafede nüfuz edin. İğnenin ucu görünür hale gelene kadar iğneyi kanülden itin. İşte 26G kateter ve kendi kendine yapılan kanülün bir karşılaştırma resmi; Her ikisi de fare portalı kanülasyonu için uygundur.
Mililitre başına 2.500 uluslararası birimlik son konsantrasyonda 25 mililitre heparinize salin hazırlayın ve şırıngayı 40 derece santigrat dereceye ayarlanmış inkübatöre yerleştirin. İşte ex-vivo normotermik makine perfüzyon sisteminin ana bileşenleri. Bileşenler esas olarak organ odası, termostatik makine, makaralı pompa, oksijenatör ve rezervuarı içerir.
Burada, organ odamızın ayrıntılı bir kurulumunu görebilirsiniz. Temel olarak, bir organ odası gövdesi, bir basınç sensörü, bir ısı eşanjörü ve bir kabarcık tuzağından oluşur. Bir perfüzyon girişi, bir perfüzyon çıkışı ve bir safra drenaj portu kurduk.
Bu, portal ven basıncını izlemek için kullandığımız ADI izleme sistemidir. ADI sistemi bir basınç sensörü, merkezi bir kontrolör ve ekranlardan oluşur. Basınç izleme için LabChart programını açın.
Basınç sensörünün her kullanımından önce kalibrasyon ve sıfırlama gereklidir. İki aşamalı kalibrasyon için basınç sensörünü kalibre etmek üzere sıfır milimetre cıva ve 20 milimetre cıva işaretlerini kullanın. Portal basıncının sürekli izlenmesine dayanarak, portal fluranını basınç değişikliklerine göre ayarlayabiliriz.
Sistemi hazırlamak için rezervuara ve organ odasına eşit miktarda perfüzyonda, dolum işlemi sırasında steriliteyi korumak için özel dikkat gösterilmelidir. İndüksiyon odasını bir duvar prizine bağlayın. Oksijeni dakikada 0,5 litreye çevirin.
İzofluranı% 3'e çevirinDerin anesteziye ulaşana kadar hayvanı odaya yerleştirin. Vücut ağırlığına uyarlanmış analjezi dozunu uygulamak için mikro şırınga kullanın. Burada, yedi mikrolitre buprenorfin.
Şimdi ameliyat operasyonuna başlıyoruz. Farenin karın bölgesinde enine bir kesi yapın. Cilt insizyonu her iki taraftaki bilateral et aksiller hattına kadar uzanır.
Linea alba boyunca dikkatlice uzunlamasına bir kesi yapın. Karın kası tabakasını elektrokoagülasyon ve makasla kesin. Karaciğeri elektrokoagülasyondan korumak için dikkatlice bir parça ıslak gazlı bez yerleştirin.
Farenin karın boşluğunu tamamen açığa çıkarın. Hilumu tamamen açığa çıkarmak için ince bağırsağı ıslak bir pamuklu çubukla karın boşluğundan dikkatlice çıkarın. Burada portal ven kanülasyonu ve safra kanalı kanülasyonunun şematik bir diyagramı gösterilmiştir.
Temel olarak farenin boyutuna göre uygun kanülü seçiyoruz ve kanülün sabitlenmesi için 6-0 ipek dikiş kullanıyoruz. Dişsiz ince kavisli forseps kullanarak ortak safra kanalını dikkatlice serbest bırakın. Ortak safra kanalı çok kolay hasar görür ve kırılır.
Bir kez kırıldıktan sonra, kanüle edilemez. Anatomik pozisyonun yönü nedeniyle, kavisli forsepslerin kullanımı daha kolaydır. Bir sonraki adıma hazırlanmak için ortak safra kanalının üzerine iki adet 6-0 ipek sütür halkası yerleştirin.
Safra kanalını 30G iğne ile dikkatlice delin. Küçük delikleri büyütmek için sivri kavisli forseps kullanın, böylece safra kanalı kanülasyonunu besleyebilir. Safra kanalı kanülü boyunca damar kanülasyon forsepsleri kullanın ve safra kanalına itin. Not.
Kanülasyon anında, safranın getirdiği direnci hissedeceksiniz. Kuvvet iyi kontrol edilmezse, kanül safra çıkış basıncı ile safra yollarından dışarı itilecektir. Kanülün derinliğini dikkatlice ayarlayın.
Çok derinse, safra kanalına zarar verebilir ve yeterince derin değilse, kayabilir. Başarılı kanülasyondan sonra kanülde safra akımı gözlenebilir. Portal veni düz forseps ile sıkıştırın ve bağ dokusunu kavisli forsepslerle dikkatlice serbest bırakın.
Portal damarın yırtılmasına neden olmamak için buraya sert çekmeyin. Portal ven hasar gördüğünde, portal veni yeniden canlandırmak zordur. Serbest portal ven üzerine iki adet 6-0 ipek sütür Loop yerleştirin.
Distal portal veni kapatmak için bir arteriyel klips kullanın. Portal veni yukarıdaki portal ven kanüllerinden biriyle çok dikkatli bir şekilde delin. Başarılı bir delinmeden sonra kanül içinde kan akışı açıkça gözlemlenebilir.
İnkübatörden önceden ısıtılmış heparin salin çözeltisi alın. Tüm hava kabarcıklarını çıkarın. Şırıngayı önceden ısıtılmış heparinize salin ile şırınga pompasına sabitleyin.
Şırınga pompasının uzatma tüpünü portal venin kanülüne bağlayın. Hızı dakikada iki mililitreye ayarlayın ve karaciğer kızarmasına başlayın. İzofluranı% 5'e yükseltin ve fareyi aşırı dozda izofluran inhalasyonu ile ötenazi yapın.
Yıkama prosedürünün sonunda karaciğerin rengini gözlemleyin. Renk homojen bir sarıya döndüğünde karaciğeri tüketin. Bir Petri kabı kullanarak karaciğeri dikkatlice organ odasına aktarın.
Bir karaciğerin ezilmesini önlemek için Petri kabında az miktarda salin bulundurun. Not. Portal ven ve safra kanalı bu işlem sırasında kolayca bükülebilir, bu da karaciğer perfüzyonunu ve safra toplanmasını etkileyebilir. Kanüldeki hava kabarcıklarını tahliye etmek için normal salini portal ven kanülüne bir şırınga ile yavaşça infüze edin.
Portal ven kanülünü organ odasındaki perfüzyonat çıkış tüpüne bağlayın. Fare safra kanalı kanülü, lastik bir kapakla kapatılmış organ odasının bir valfinden geçirilir. Daha sonra, safra tüpü, kurşunda küçük bir delik bulunan önceden hazırlanmış 0.5 mililitrelik bir mikro tüpe yerleştirilir.
Her şey bağlandıktan sonra, peristaltik pompayı açın. Akış hızını ayarlamak için portal ven basıncı okumasını kontrol edin. Akış hızını ayarlayarak portal ven basıncını yedi ila 10 milimetre cıva arasında tutun. Not.
Nominal akış hızı, tüplerin yaşına ve konumlandırılmasına bağlı olarak biraz değişebilir. Bu, normotermik oksijenli sıçan karaciğer makinesi perfüzyon çalışmalarının literatür çalışmasına dayanan perfüzyon ortamı, perfüzyonat hacmi ve perfüzyon basıncının seçimidir. Bu, fare perfüzyon modelini oluşturmak için adım adım bir denemedir.
En uygun kateterleri seçmek için yaklaşık 14 deney yapıldı. Ellerimizde, portal ven için iki Fransız kauçuk kateteri ve safra kanalı için bir Fransız kauçuk kateteri kullanmak, tüm kateterler yerinde homojen perfüzyon elde etmek için en iyi kombinasyondur. pH seviyesi ve potasyum seviyesi 12 saatlik perfüzyon boyunca stabildi.
pH seviyesi 7.26 ila 7.71 arasında değişmekte ve potasyum seviyesi litre başına 5.9 ila 6.8 milimol arasında değişmektedir. HE boyaması, 12 saatlik perfüzyondan sonra, fare karaciğerinin histoloji bütünlüğünün nispeten iyi korunduğunu göstermektedir. Birlikte ele alındığında, burada fare karaciğeri için normotermik oksijenli bir makine perfüzyon sisteminin başarılı bir şekilde kurulduğunu gösterdik.
Bir fare karaciğerinin 12 saat boyunca perfüzyonu, tüm organ boyunca olmasa da, karaciğer morfolojisinin iyi bir şekilde korunmasına neden olmuştur. Daha uzun bir süre boyunca tam homojen perfüzyon elde etmek için daha fazla çaba gerekmektedir. Bu başarıldığında, iltihaplanmanın rolünü araştırmak için IL-2-nakavt farelerin kullanılması gibi genetiği değiştirilmiş hayvanların kullanımı düşünülebilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, fare karaciğerleri için yeniden üretilebilir perfüzyon sonuçlarına izin veren normotermik eks vivo karaciğer perfüzyon (NEVLP) sisteminin geliştirilmesini tartışmaktadır. Sistem, moleküler yolakların araştırılmasını ve yeni perfüzyon katkı maddelerinin belirlenmesini kolaylaştırmak üzere tasarlanmıştır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Organ perfüzyonu
- Moleküler biyoloji
Arka Plan
- Normotermik oksijenizasyonlu karaciğer perfüzyonu, marjinal organları kurtarmak için bir stratejidir.
- Bu sürecin temelindeki moleküler mekanizmalar iyi anlaşılmamıştır.
- Bu yolları incelemek için bir fare modeli gereklidir.
- Genel olarak modifiye edilmiş fareler, daha derin bilgiler elde etmek için kullanılabilir.
Çalışmanın Amacı
- Fare karaciğerleri için bir NEVLP sistemi kurmak.
- Karaciğer perfüzyonunda yer alan moleküler yolları araştırmak.
- Potansiyel yeni perfüzyon katkı maddelerini belirlemek.
Kullanılan Yöntemler
- 37 derece santigrat kontrol edilen bir NEVLP sisteminin geliştirilmesi.
- Su dolaşımı için termostatik kontrolör kullanımı.
- Karaciğer işlemleri için mikrocerrahi tekniklerin uygulanması.
- Organ onarım çalışmaları için deneysel kurulum.
Ana Sonuçlar
- Yeniden üretilebilir bir NEVLP sisteminin başarılı kurulması.
- Organ onarımına odaklanmış deneylerin kolaylaştırılması.
- Potansiyel perfüzyon katkı maddeleri için yolakların belirlenmesi.
- Karaciğer perfüzyon mekanizmalarına ilişkin daha gelişmiş anlayış.
Sonuçlar
- NEVLP sistemi, karaciğer araştırmaları için değerli bir araç sağlar.
- Karaciğer perfüzyonundaki moleküler mekanizmaları incelemek için yeni yollar açar.
- Gelecek çalışmalar, bu sistemi organ onarım araştırmaları için kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Normothermic ex vivo liver machine perfusion in mice enables controlled, reproducible studies of liver preservation and injury mechanisms, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in hepatic research. This platform facilitates the use of genetically modified models to interrogate molecular pathways, enhancing predictive confidence for translational liver studies. Its integration into discovery workflows accelerates the evaluation of preservation strategies and potential therapeutic interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of hepatic injury and preservation pathways in a controlled ex vivo setting.
- Supports functional validation of molecular targets using genetically modified mouse models.
- Facilitates biological de-risking by isolating organ-level responses to defined interventions.
- Improves predictive confidence for downstream translational studies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible platform for quantitative assessment of liver viability and function.
- Enables collection of perfusate and tissue samples for biomarker and metabolic analysis.
- Supports assay development for evaluating novel perfusate additives or preservation protocols.
- Allows for scalable, repeatable testing across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by leveraging genetically engineered mice for pathway analysis.
- Bridges discovery findings to preclinical validation by enabling direct measurement of organ-level outcomes.
- Supports risk-adjusted advancement of preservation strategies and therapeutic candidates.
- Provides continuity for biomarker discovery and validation in translational liver research.
Pipeline & Workflow Integration
This ex vivo perfusion system positions within the early discovery to preclinical continuum, enabling hypothesis-driven studies and functional validation prior to in vivo or clinical translation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in hepatic preservation and injury.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for comparative analysis of interventions.
- Analytics: Enables measurement of perfusate parameters and histological integrity for robust data generation.
- Translational Research: Facilitates alignment with preclinical models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for ongoing mechanistic and translational liver studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in liver preservation research.
- Operational Value: Standardizes procedures for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for preservation strategies and candidate interventions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of hepatic targets and approaches.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques and ex vivo organ handling.
- Needs specialized instrumentation for perfusion, pressure monitoring, and temperature control.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be necessary for different mouse strains or genetically modified models.
- Perfusion homogeneity and duration may limit certain experimental endpoints.
