Name: Normothermic Ex Vivo Karaciğer Makinesi Farede Perfüzyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-25T14:25:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Öğrenin farede normotermik ekz vivo karaciğer perfüzyon sistemini kurmayı. Bu yöntem moleküler mekanizmaları araştırmak ve yeni perfüzat katkı maddeleri belirlemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu yazının yazımı boyunca çok fazla destek ve yardım aldım. Takım arkadaşım XinPei Chen'e operasyonum sırasında harika işbirliği ve hasta desteği için özellikle teşekkür etmek istiyorum.

Hayvan deneyleri, mevcut Alman yönetmeliklerine ve hayvan refahı yönergelerine ve Hayvan Araştırmalarını Raporlamak için ARRIVE yönergelerine göre gerçekleştirilmiştir. Hayvan deneyi protokolü Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Thüringen, Almanya tarafından onaylanmıştır (Onay Numarası: UKJ - 17 - 106).
NOT: Karaciğer donörü olarak 34 ± 4 g ağırlığındaki erkek C57BL/6J fareler (ortalama [SEM]'in ortalama ± standart hatası) kullanılmıştır. Kontrollü çevre koşulları altında (% 50 nem ve 18 - 23 ° C) standart fare chow ve suya serbest erişim ile muhafaza edildiler. Cerrahi işlem boyunca 60 nefes/dk'yı aşan solunum hızı korundu ve vücut ısısı 34 °C'nin üzerinde tutuldu.
1. Hazırlık
<ol><li>Ameliyat masasının kurulması
	<ol><li>Tüm cerrahi aletleri ve sarf malzemelerini sterilizasyon amacıyla otoklavlayın.</li>
		<li>Isıtma tahtası ve elektrokoagülasyon dahil olmak üzere tüm ekipmanı açın.</li>
		<li>Sıcak bir inkübatöre (37 ° C) 25 mL heparinize (2.500 U / L) salin içeren bir adet 50 mL şırınga yerleştirin.</li>
		<li>Cerrahi aletleri, 6 - 0 ipek sütürü, steril küçük pamuklu aplikatörü, veteriner salini (500 mL) ve dokunmamış gazlı bez süngerlerini (10 cm x 10 cm) ameliyat masasına uygun şekilde yerleştirin.</li>
		<li>Safra borusunu safra toplama için almak üzere 0.5 mL mikrosantrifüj tüpünün kapağında küçük bir delik oluşturmak için ameliyat masasına 26 G'lık bir iğne yerleştirin.</li>
		<li>Kanülü (1 Fr poliüretan kanül veya UT - 03 polietilen kanül) ve safra toplanması için sterilize edilmiş 0,5 mL mikrosantrifüj tüpünü ameliyat masasına yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Kendi kendine yapılan portal ven kanülü
	<ol><li>2 Fr kanülünü forseps ile tutun ve kanülün ucundan 1 cm mesafede 30 G'lik bir iğne ile duvarı delin. İğnenin ucu görünür hale gelene kadar iğneyi kanülden itin.</li>
		<li>Kanülün ucunu kesin ve keskin bir üçgen elde edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Heparinize salinin hazırlanması
	<ol><li>Son konsantrasyonu 2.500 IU/mL olan 25 mL heparinize salin hazırlayın.</li>
		<li>Tüm hava kabarcıklarını çıkarın ve şırıngayı 40 ° C inkübatöre yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfüzyon sisteminin gösterimi
	<ol><li>Makine perfüzyon sisteminin ana bileşenleri için Şekil 1'e bakınız.</li>
	</ol></li>
	<li>Organ odasının kurulması
	<ol><li>Organ odasının düzeni için Şekil 2'ye bakınız.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfüzyon sisteminin kurulumu
	<ol><li>Basınç izleme için laboratuvar grafik programını açın.</li>
		<li>Basınç kalibratörünü ve basınç sensörünü organ odası seviyesinde bağlayın.</li>
		<li>Basınç kalibratörünü 0 mmHg'yi okuyacak şekilde ayarlayın ve basınç kontrol yazılımında karşılık gelen değeri kontrol edin.</li>
		<li>Basınç kalibratörünü 20 mmHg'yi okuyacak şekilde ayarlayın ve basınç kontrol yazılımında karşılık gelen değeri tekrar kontrol edin.</li>
		<li>Su banyosunu açın ve organ odasını önceden 40 ° C'ye ısıtın.</li>
		<li>Tüm sıhhi tesisat sistemini her biri 30 dakika boyunca damıtılmış deiyonize suyla iki kez yıkayın ve sterilizasyon çözeltisinin tamamen çıkarılmasını sağlayın.</li>
		<li>Kapsamlı dezenfeksiyonu sağlamak için dezenfeksiyon çözeltisinin tüm sistem boyunca 20 dakikalık bir süre boyunca dolaşımını başlatın.</li>
		<li>Gaz karışımını açın (% 95 oksijen (O2) ve% 5 karbondioksit (CO2).</li>
	</ol></li>
	<li>Perfüzyon dolgusu
	<ol><li>Williams'ın E besiyerinin tamamını hazırlamak için 50 mL fetal sığır serumu, 3 mL penisilin / streptomisin (1 mg / mL), 0.17 mL insülin (100 IE / mL), 0.34 mL heparin (5000 U / mL) ve 0.07 mL hidrokortizon (100 mg / 2 mL) ile 250 mL Williams E besiyeri takviyesi yapın.</li>
		<li>Sistemi hazırlamak için rezervuara ve organ odasına eşit miktarda (150 mL) perfüzyon ekleyin. NOT: Dolum işlemi sırasında sterilitenin korunmasına özel dikkat gösterilmelidir. Perfüzyon, kapalı devridaim makinesi perfüzyonunun bu iki temel bileşeninden sürekli olarak pompalanır.</li>
		<li>Perfüzyon sistemini oksijenli ortamla hazırlamak için peristaltik pompayı orta hızda (15 mL/dak) açın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Karaciğer eksplantasyonu
<ol><li>Ameliyat öncesi hazırlık
	<ol><li>Hayvanı tartın. Analjezik buprenorfin (0.3 mg / mL) (0.05 mg / kg vücut ağırlığı) hazırlayın.</li>
		<li>İndüksiyon odasını duvar prizine bağlayın. Oksijeni 0,5 L/dk'ya çevirin. İzofluranı% 3'e çevirin.</li>
		<li>Derin anesteziye (sağ refleks pozitif) ulaşılana kadar hayvanı odaya yerleştirin.</li>
		<li>Vücut ağırlığına uyarlanmış analjezi dozunu deri altından uygulamak için bir mikro şırınga kullanın.</li>
		<li>Karın derisindeki kürkü kesmek için elektrikli tıraş makinesi kullanın.</li>
		<li>Fareyi ameliyat masasına aktarın ve anesteziyi korumak için izofluran buharlaştırıcıyı% 2,5'e kadar açın. İnterdigital ayak parmağı refleksini test ederek anestezinin derinliğini onaylayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Fare karnının hazırlanması
	<ol><li>Fareyi sırtüstü pozisyona getirin.</li>
		<li>Uygun anestezi derinliğini iki kez doğrulamak için interdigital refleksi test edin. Dört uzuvun hepsini bantla sabitleyin.</li>
		<li>Karnın her iki tarafını da art arda üç tur iyot-alkol kullanarak orta aksiller çizgiye dezenfekte edin. Cerrahi alanın etrafındaki alanı kaplamak için dokunmamış sterilize gazlı bez kullanın.</li>
		<li>Metzenbaum bebek makası ve cerrahi forseps kullanarak farenin karın bölgesinde ksifoidin 1 cm altında 3 cm'lik enine bir kesi yapın.</li>
		<li>Cilt insizyonunu iki taraflı olarak her iki taraftaki orta aksiller hatta uzatın.</li>
		<li>Yaylı makas kullanarak linea alba boyunca dikkatlice 2 cm'lik uzunlamasına bir kesi yapın.</li>
		<li>Karın kası tabakasını elektrokoagülasyon ve Vannas yay makası ile kesin.</li>
		<li>Karaciğeri elektrokoagülasyondan korumak için dikkatlice bir parça ıslak gazlı bez yerleştirin.</li>
		<li>Koroner ligamentin daha iyi maruz kalması için ksifoid işlemi geri çekmek için yuvarlak iğne ile 6 - 0 ipek sütür kullanın.</li>
		<li>Farenin karın boşluğunu tamamen ortaya çıkarmak için iki kaburga retraktörü kullanın.</li>
		<li>Hilumu tamamen açığa çıkarmak için ince bağırsağı ıslak bir pamuklu çubukla karın boşluğundan dikkatlice çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Ortak safra kanalı hazırlığı
	<ol><li>Falsiform, frenik ve gastrohepatik bağları keskin makasla transekte edin.</li>
		<li>Dişsiz ince kavisli forseps kullanarak ortak safra kanalını dikkatlice serbest bırakın. NOT: Ortak safra kanalı çok kolay hasar görür ve kırılır. Bir kez kırıldıktan sonra, kanüle edilemez. Anatomik pozisyonun yönü nedeniyle, kavisli forsepslerin kullanılması daha iyidir.</li>
		<li>Bir sonraki adıma hazırlanmak için ortak safra kanalının üzerine iki adet 6 - 0 ipek dikiş halkası yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Ortak safra kanalı kanülasyonu
	<ol><li>Safra kanalını 30 G iğne ile dikkatlice delin. Küçük deliği safra kanalı kanülasyonuna uyacak şekilde büyütmek için sivri kavisli forseps kullanın.</li>
		<li>Safra kanalı kanülünü kavramak ve safra kanalına itmek için damar kanülasyon forsepslerini kullanın.</li>
		<li>Kanülü önceden ayarlanmış 6 - 0 dikiş halkaları ile iki kez sabitleyin. NOT: Kanülasyon sırasında safra direnci hissedilir. Kuvvet iyi kontrol edilmezse, kanül safra çıkış basıncı ile safra yollarından dışarı itilecektir. Kanülün derinliğini dikkatlice ayarlayın. Çok derinse, safra kanalına zarar verebilir ve yeterince derin değilse, kayabilir.</li>
		<li>Başarılı kanülasyondan sonra kanüldeki safra akışını gözlemleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Portal ven hazırlığı
	<ol><li>Portal veni düz forseps ile sıkıştırın ve bağ dokusunu kavisli forsepslerle dikkatlice serbest bırakın. Portal venin yırtılmasına neden olmamak için sert çekmeyin. Portal ven hasar gördüğünde, portal veni yeniden kanüle etmek zordur.</li>
		<li>PV'yi çatallanmadan hemen daha üstün bir şekilde disseke edin ve ilk dikiş halkasını 6 - 0 ipek sütür kullanarak PV üzerine daha sonra kullanmak üzere birleşime yakın bir yere yerleştirin.</li>
		<li>PV'nin daha sonra sabitlenmesi için ikinci dikiş halkasını hepatik hiluma mümkün olduğunca yakın yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Portal ven kanülasyonu
	<ol><li>Distal portal veni kapatmak için bir arteriyel klips kullanın.</li>
		<li>Çok dikkatli bir şekilde, yukarıdaki portal ven kanüllerinden biriyle portal veni delin. Başarılı bir delinmeden sonra kanül içinde kan akışı açıkça gözlemlenebilir.</li>
		<li>PV kanülünü önceden yerleştirilmiş 6 - 0 dikiş halkası ile sabitleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Karaciğer kızarması
	<ol><li>İzofluranı% 5'e yükseltin ve fareyi aşırı dozda izofluran inhalasyonu ile ötenazi yapın.</li>
		<li>İnkübatörden önceden ısıtılmış heparin salin çözeltisi alın. Heparinize salin içinde oluşan tüm hava kabarcıklarını çıkarın.</li>
		<li>Şırıngayı önceden ısıtılmış heparinize salin ile şırınga pompasına sabitleyin.</li>
		<li>Şırınga pompasının uzatma tüpünü portal venin kanülüne bağlayın, hızı 2 mL / dak'ya ayarlayın ve karaciğer kızarmasını başlatın.</li>
		<li>Yıkama prosedürünün sonunda karaciğerin rengini gözlemleyin. Renk homojen bir sarıya döndüğünde karaciğeri tüketin.</li>
		<li>Diyafram, suprahepatik inferior vena kava, infra hepatik vena kava, hepatik arter, distal portal ven ve kalan bağ dokusunu transekte edin.</li>
		<li>Karaciğeri Petri kabına yerleştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Karaciğer ve oda bağlantısı
<ol><li>Karaciğer transferi
	<ol><li>Bir Petri kabı kullanarak karaciğeri dikkatlice organ odasına aktarın.</li>
		<li>Karaciğerin kurumasını önlemek için Petri kabında az miktarda salin bulundurun. NOT: Portal ven ve safra kanalı bu işlem sırasında kolayca bükülebilir, bu da karaciğer perfüzyonunu ve safra toplanmasını etkileyebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Portal ven kanül bağlantısı
	<ol><li>Kanüldeki hava kabarcıklarını tahliye etmek için normal salini portal ven kanülüne bir şırınga ile yavaşça infüze edin.</li>
		<li>Portal ven kanülünü organ odasındaki perfüzyonat çıkış tüpüne bağlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Safra kanalı kanül bağlantısı
	<ol><li>Fare safra kanalı kanülünü organ odasına bağlı bir lastik kapağın valfinden geçirin.</li>
		<li>Safra kanalı kanülünü, kapakta küçük bir delik bulunan önceden hazırlanmış 0,5 mL'lik bir mikrotüpe yerleştirin.</li>
		<li>Mikrotüpü organ odasının dışındaki kil üzerine yerleştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Akış hızını PV basıncına göre ayarlayın
<ol><li>Peristaltik pompayı 1 mL/dk'dan açın.</li>
	<li>Akış hızını ayarlamak için portal ven basıncı okumasını kontrol edin.</li>
	<li>Akış hızını ayarlayarak portal ven basıncını fizyolojik aralıkta 7 - 10 mmHg arasında tutun. NOT: Nominal akış hızı, tüplerin kullanımına ve konumlandırılmasına bağlı olarak biraz değişebilir.</li>
</ol>5. Örnek toplama
<ol><li>Portal ven giriş tüpünden giriş perfüzyon numuneleri ve organ odasından çıkış perfüzyon numunelerini 3 saatlik aralıklarla alın.</li>
	<li>12 saatlik perfüzyon periyodunun sonunda histolojik analiz için tüm karaciğer loblarından örnekler toplayın.</li>
</ol>

Açıklanacak finansal çıkar çatışması yoktur.

Protokoldeki kritik adımlar Karaciğer eksplantasyonunda iki önemli adım, portal venin (PV) kanülasyonu ve ardından safra kanalının (BD) kanülasyonudur. Bu adımlar, başarılı organ alımı ve ardından perfüzyon veya transplantasyon prosedürlerinin sağlanmasında büyük önem taşımaktadır.
Zorluklar ve çözümler PV kanülasyonu üç zorluk ortaya çıkarır: damar duvarının yaralanması, kateterin yer değiştirmesi ve yerleştirme işleminin uygulanabilirliği. PV damar duv...

Karaciğer transplantasyonu, son dönem karaciğer hastalığı olan bireyler için altın standart tedaviyi temsil eder. Ne yazık ki, donör organlara olan talep mevcut arzı aşmakta ve önemli bir kıtlığa yol açmaktadır. 2021 yılında, yaklaşık 24.936 hasta karaciğer grefti için bekleme listesindeyken, sadece 9.234 nakil başarıyla gerçekleştirildi1. Karaciğer greftlerinin arz ve talebi arasındaki önemli eşitsizlik, donör havuzunu genişletmek ve karaciğer greftlerinin erişilebilirliğini artırmak için alternatif stratejilerin araştırılması gerekliliğini vurgulamaktadır. Donör havuzunu genişletmenin bir yolu, marjinal donörleri kullanmaktır2. Marjinal donörler arasında ileri yaş, orta veya şiddetli steatoz olanları bulunur. Marjinal organların transplantasyonu olumlu sonuçlar verse de, genel sonuçlar optimal değildir. Sonuç olarak, marjinal donörlerin işlevini arttırmayı amaçlayan terapötik stratejilerin geliştirilmesi şu anda devam etmektedir 3,4.
Stratejilerden biri, bu marjinal organların işlevini geliştirmek için makine perfüzyonunu, özellikle normotermik oksijenli makine perfüzyonunu kullanmaktır5. Bununla birlikte, normotermik oksijenli makine perfüzyonunun (NEVLP) yararlı etkilerinin altında yatan moleküler mekanizmaların hala sınırlı bir anlayışı vardır. Fareler, genetiği değiştirilmiş suşların bol miktarda bulunmasıyla, moleküler yolları araştırmak için değerli modeller olarak hizmet eder. Örneğin, hepatik iskemi-reperfüzyon hasarını hafifletmede otofaji yolaklarının önemi giderek daha fazla kabul görmektedir 6,7. Hepatik iskemi-reperfüzyon hasarında önemli bir moleküler yol miR-20b-5p/ATG7 yol8'dir. Şu anda, bir dizi ATG nakavt ve koşullu nakavt fare suşu mevcuttur, ancak karşılık gelen sıçan suşlarıyoktur 9.
Bu arka plana dayanarak, amaç fare karaciğer greftleri için minyatür bir NEVLP platformu oluşturmaktı. Bu platform, donörün karaciğerinin işlevselliğini iyileştirmeyi amaçlayan potansiyel genetiği değiştirilmiş stratejilerin araştırılmasını ve değerlendirilmesini kolaylaştıracaktır. Ek olarak, sistemin uzun süreli perfüzyon için uygun olması ve genellikle "organ onarımı" olarak adlandırılan karaciğerin ex vivo tedavisini sağlaması çok önemliydi.
Fare karaciğeri perfüzyonu ile ilgili in vitro verilerin sınırlı mevcudiyeti göz önüne alındığında, literatür taraması sıçanlarda yapılan çalışmalara odaklanmıştır. "Normotermik karaciğer perfüzyonu", "ex vivo veya in vitro" ve "sıçanlar" gibi anahtar kelimeler kullanılarak 2010'dan 2022'ye kadar uzanan sistematik bir literatür taraması yapılmıştır. Bu araştırma, kemirgenlerde en uygun koşulları tanımlamayı ve en uygun yaklaşımı belirlememizi sağlamayı amaçlamıştır.
Perfüzyon sistemi, kapalı bir su ceketli cam tampon rezervuarı, bir peristaltik makaralı pompa, bir oksijenatör, bir kabarcık kapanı, bir ısı eşanjörü, bir organ odası ve kapalı bir bisiklet boru sisteminden oluşur (Şekil 1). Sistem, özel bir termostatik makine kullanarak 37 °C'lik sabit bir perfüzyon sıcaklığının hassas bir şekilde korunmasını sağlar. Peristaltik makaralı pompa, perfüzyonun akışını devre boyunca yönlendirir. Perfüzyon devresi, yalıtımlı su ceketli rezervuarda başlar. Daha sonra, perfüzyonat, özel bir gaz şişesinden% 95 oksijen ve% 5 karbondioksit gaz karışımı alan oksijenatörden yönlendirilir. Oksijenasyonu takiben, perfüzyonat kabarcık tuzağından geçer, burada sıkışmış kabarcıklar peristaltik pompa tarafından rezervuara geri yönlendirilir. Kalan perfüzyonat ısı eşanjöründen akar ve rezervuara geri döndüğü organ odasına girer.
Burada, fare karaciğerleri için bir NEVLP oluşturma deneyimlerimizi rapor ediyoruz ve oksijen taşıyıcıları olmadan oksijenli ortam kullanılarak gerçekleştirilen bir pilot deneyin umut verici sonuçlarını paylaşıyoruz.

<table><tbody><tr><td>0.5 ml Mikro Tüp PP</td><td>Sarstedt</td><td>72699</td><td></td></tr><tr><td>1 Fr Kauçuk Kanül</td><td>Vygon</td><td>Numune Kanülü</td><td></td></tr><tr><td>10 & mikro; L Mikro Şırınga</td><td>Hamilton</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>2 Fr Kauçuk Kanül</td><td>Vygon</td><td>Örnek Kanül</td><td></td></tr><tr><td>24 G Kelebek Kanül</td><td>Terumo</td><td>SR+OF2419</td><td></td></tr><tr><td>26 G Kelebek Kanül</td><td>Terumo</td><td>SR+DU2619WX</td><td></td></tr><tr><td>30 G Hipodermik İğne</td><td>Sterican</td><td>100246</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Şırınga Pompası</td><td>Braun</td><td>110356</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Perma-Hand Seide</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td></td></tr><tr><td>Arteriyel Klips</td><td>Braun</td><td>BH014R</td><td></td></tr><tr><td>Otoklavlanabilir Nemli Oda</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>73-4733</td><td></td></tr><tr><td>Büyük Pamuk Aplikatörü</td><td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td><td>974018</td><td></td></tr><tr><td>Kabarcık Tuzağı</td><td>Hugo-Sachs-Elektronik</td><td>V83163</td><td></td></tr><tr><td>Buprenovet (0.3 mg / ml)</td><td>Elanco</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>CIDEX OPA çözeltisi (2 L)</td><td>Cilag GmbH</td><td>20391</td><td></td></tr><tr><td>Monopolar Kesim için Elektrocerrahi Ünitesi VIO&reg; 50 C</td><td>ERBE/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (500 ml)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Gaz Karışımı (%95 oksijen & %5 karbondioksit)</td><td>Ev Temini</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma Sirkülasyon Banyoları</td><td>Harvard-Apparatus</td><td>75-0310</td><td></td></tr><tr><td>Heparin 5000 (IE /5 ml)</td><td>Braun</td><td>1708.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon (100 mg / 2 ml)</td><td>Pfizer</td><td>15427276</td><td></td></tr><tr><td>İnsülini(100 IE / ml)</td><td>Sigma</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>İris Makas&nbsp;</td><td>Fine Science Instruments</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (250 ml)</td><td>Cp-Pharma</td><td>1214</td><td></td></tr><tr><td>Membran Oksijenatör</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>T18728</td><td></td></tr><tr><td>Mikrocerrahi Mikroskobu&nbsp;</td><td>Leica</td><td>M60</td><td></td></tr><tr><td>Fare Ekartör Seti&nbsp;</td><td>Carfil Quality</td><td>180000056</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0 HT</td><td>Hamamatsu</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Non-Woven Süngerler&nbsp;</td><td>Kompressen</td><td>866110</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin (1 mg / ml)&nbsp;</td><td>C.C.Pro</td><td>Z-13-M</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon Uzatma Tüpü (30 cm)</td><td>Braun</td><td>4256000</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik Pompa</td><td>Harvard-Aparatı</td><td>P-70</td><td></td></tr><tr><td>Petri Kabı 100x15 mm</td><td>VWR&reg;</td><td>391-0578</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Jod (Vet-Sep Sprey)</td><td>Livisto</td><td>799-416</td><td></td></tr><tr><td>Basınç Dönüştürücü Simülatörü</td><td>UTAH Tıbbi Ürünler</td><td>650-950</td><td></td></tr><tr><td>Yeniden Kullanılabilir Kan Basıncı Transdüserleri</td><td>AD Cihazları</td><td>MLT-0380/D</td><td></td></tr><tr><td>S & T Damar Kanülasyon Forseps</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>00608-11</td><td></td></tr><tr><td>Küçük Pamuk Aplikatörü</td><td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>Düz Forseps 10 cm&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Sütür Bağlama Forseps</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11063-07</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga 50ml Orijinal Perfüzör</td><td>Braun</td><td>8728810F-06</td><td></td></tr><tr><td>UT - 03 Kanül</td><td>Benzersiz Medikal, Japonya</td> <td>/</td><td></td></tr> <tr><td>Vannas Bahar Makası</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Veteriner Tuzlu Su (500 ml)</td><td>WDT</td><td>18X1807</td><td></td></tr><tr><td>Su Ceketli Rezervuar&nbsp; 2 L</td><td>Harvard-Aparatı</td><td>73-3441</td><td></td></tr><tr><td>William's E Medium (500 ML)</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

normothermic ex vivo karaciğer makinesi farede perfüzyon

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

Bu protokol, fare karaciğerlerini kullanarak optimize edilmiş eritrositsiz bir NEVLP sistemi sunar. Fare karaciğerlerinin ex vivo korunması, modifiye kanüller ve geleneksel ticari ex vivo perfüzyon ekipmanlarından uyarlanmış teknikler kullanılarak sağlanmıştır. Sistem, 12 saatlik perfüzyonu takiben koruma sonuçlarını değerlendirmek için kullanıldı. C57BL / 6J fareleri karaciğer donörü olarak görev yaptı ve karaciğerler, portal ven (PV) ve safra kanalı (BD) kanüle edilerek ve daha sonra organı ılık (37 ° C) heparinize salin ile yıkayarak eksize edildi. Daha sonra ekilen karaciğerler perfüzyon odasına transfer edildi ve normotermik oksijenli makine perfüzyonuna (NEVLP) tabi tutuldu. Giriş ve çıkış perfüzyon numuneleri, perfüzyon analizi için 3 saatlik aralıklarla toplandı. Perfüzyonun tamamlanmasının ardından, histolojik analiz için karaciğer örnekleri alındı ve morfolojik bütünlük, Hematoksilin-Eozin (HE) boyaması yoluyla modifiye Suzuki-Skoru kullanılarak değerlendirildi. Optimizasyon deneyleri aşağıdaki bulguları vermiştir: (1) 30 g'ın üzerindeki fareler, safra kanallarının (BD) daha büyük boyutu nedeniyle deney için daha uygun görülmüştür. (2) 2 Fr (dış çap = 0.66 mm) poliüretan kanül, bir polipropilen kanüle kıyasla portal venin (PV) kanüllenmesi için daha uygundu. Bu, poliüretan malzemenin gelişmiş kavramasına bağlandı ve vücuttan organ odasına transfer sırasında kateter kaymasının azalmasına neden oldu. (3) Safra kanalının (BD) kanülasyonu için 1 Fr (dış çap = 0.33 mm) poliüretan kanülün polipropilen UT - 03 (dış çap = 0.30 mm) kanülüne göre daha etkili olduğu bulunmuştur. Bu optimize protokolle, fare karaciğerleri histolojik yapı üzerinde önemli bir etki yaratmadan 12 saatlik bir süre boyunca başarıyla korunmuştur. Hematoksilin-Eozin (HE) boyaması, karaciğerin iyi korunmuş morfolojik mimarisini ortaya çıkardı, açıkça görülebilen çekirdeklere sahip ağırlıklı olarak canlı hepatositler ve hepatik sinüzoidlerin hafif genişlemesi ile karakterize edildi.

Cerrahi prosedürün oluşturulması Bu deney için toplam 17 hayvan kullanıldı: Portal ven (PV) ve safra kanalının (BD) kanülasyonu da dahil olmak üzere organ tedarik sürecini optimize etmek için 14 fare kullanılırken, prosedürü doğrulamak için 3 fare kullanıldı (Tablo 1). Histolojik sonuçlar (Şekil 3) optimal perfüzyon durumunun belirlenmesini kolaylaştırmak için karşılaştırıldı.
Perfüzyon seçimi Bu çalışma içi...

Fare karaciğerleri için normotermik ex vivo karaciğer perfüzyonu (NEVLP) sistemi oluşturuldu. Bu sistem mikrocerrahide deneyim gerektirir ancak tekrarlanabilir perfüzyon sonuçlarına izin verir. Fare karaciğerlerini kullanma yeteneği, yeni perfüzyon katkı maddelerini tanımlamak için moleküler yolakların araştırılmasını kolaylaştırır ve organ onarımına odaklanan deneylerin yürütülmesini sağlar.

Normothermic Ex Vivo Karaciğer Makinesi Farede Perfüzyon

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

Normothermic Ex-Vivo Karaciğer Makinesi Farede Perfüzyon. Norannemik oksijenli karaciğer perfüzyonu, marjinal organları kurtarmak için umut verici bir stratejidir ve son zamanlarda klinik pratikte kullanılmaya başlanmıştır. Bununla birlikte, altta yatan moleküler mekanizmalar iyi anlaşılmamıştır.Transgenik fareler gibi genetiği değiştirilmiş hayvanlardan yararlanarak moleküler yolları daha fazla incelemek için bir fare modeline ihtiyaç vardır, bu nedenle fare karaciğerleri için normotermik oksijenli bir makine perfüzyon sistemi kurulmasını beklemektedir. İşte tüm sistemimizin bir şeması. İlk olarak, tüm sistem su sirkülasyonu yoluyla bir termostatik kontrolör tarafından 37 santigrat derecede kontrol edilir.Perfusat, rezervuardan peristaltik bir pompa ile bir oksijenatöre pompalanır. Oksijenatörde %95 oksijen ve %5 karbondioksit olmak üzere kesintisiz gaz akışı vardır. Perfüzyon daha sonra bir kabarcık tuzağından geçer.Hava kabarcıkları ile perfüzyon, basınç altında rezervuara geri pompalanır. Kalan perfüzyonat, tüpün portal vene bağlandığı organ odasına akar. Perfüzyonat karaciğerden suprahepatik kava yoluyla organ odasına boşaltılır.Organ odasından perfüzyonat çıkışı, peristaltik pompa tarafından rezervuara geri yönlendirilir. Safra toplamak için organ odasına bir safra drenaj tüpü bağlanır. Bu bizim ameliyat masamız.Tüm ameliyatlar mikroskop altında yapılır. Cerrahi prosedür boyunca yarı steril çalışma koşullarını koruyoruz. Fransız tüp kanülünü forseps ile tutun.Kanül duvarına 30G iğne ile kanülün ucundan bir santimetre mesafede nüfuz edin. İğnenin ucu görünür hale gelene kadar iğneyi kanülden itin. İşte 26G kateter ve kendi kendine yapılan kanülün bir karşılaştırma resmi; Her ikisi de fare portalı kanülasyonu için uygundur.Mililitre başına 2.500 uluslararası birimlik son konsantrasyonda 25 mililitre heparinize salin hazırlayın ve şırıngayı 40 derece santigrat dereceye ayarlanmış inkübatöre yerleştirin. İşte ex-vivo normotermik makine perfüzyon sisteminin ana bileşenleri. Bileşenler esas olarak organ odası, termostatik makine, makaralı pompa, oksijenatör ve rezervuarı içerir.Burada, organ odamızın ayrıntılı bir kurulumunu görebilirsiniz. Temel olarak, bir organ odası gövdesi, bir basınç sensörü, bir ısı eşanjörü ve bir kabarcık tuzağından oluşur. Bir perfüzyon girişi, bir perfüzyon çıkışı ve bir safra drenaj portu kurduk.Bu, portal ven basıncını izlemek için kullandığımız ADI izleme sistemidir. ADI sistemi bir basınç sensörü, merkezi bir kontrolör ve ekranlardan oluşur. Basınç izleme için LabChart programını açın.Basınç sensörünün her kullanımından önce kalibrasyon ve sıfırlama gereklidir. İki aşamalı kalibrasyon için basınç sensörünü kalibre etmek üzere sıfır milimetre cıva ve 20 milimetre cıva işaretlerini kullanın. Portal basıncının sürekli izlenmesine dayanarak, portal fluranını basınç değişikliklerine göre ayarlayabiliriz.Sistemi hazırlamak için rezervuara ve organ odasına eşit miktarda perfüzyonda, dolum işlemi sırasında steriliteyi korumak için özel dikkat gösterilmelidir. İndüksiyon odasını bir duvar prizine bağlayın. Oksijeni dakikada 0,5 litreye çevirin.İzofluranı% 3'e çevirinDerin anesteziye ulaşana kadar hayvanı odaya yerleştirin. Vücut ağırlığına uyarlanmış analjezi dozunu uygulamak için mikro şırınga kullanın. Burada, yedi mikrolitre buprenorfin.Şimdi ameliyat operasyonuna başlıyoruz. Farenin karın bölgesinde enine bir kesi yapın. Cilt insizyonu her iki taraftaki bilateral et aksiller hattına kadar uzanır.Linea alba boyunca dikkatlice uzunlamasına bir kesi yapın. Karın kası tabakasını elektrokoagülasyon ve makasla kesin. Karaciğeri elektrokoagülasyondan korumak için dikkatlice bir parça ıslak gazlı bez yerleştirin.Farenin karın boşluğunu tamamen açığa çıkarın. Hilumu tamamen açığa çıkarmak için ince bağırsağı ıslak bir pamuklu çubukla karın boşluğundan dikkatlice çıkarın. Burada portal ven kanülasyonu ve safra kanalı kanülasyonunun şematik bir diyagramı gösterilmiştir.Temel olarak farenin boyutuna göre uygun kanülü seçiyoruz ve kanülün sabitlenmesi için 6-0 ipek dikiş kullanıyoruz. Dişsiz ince kavisli forseps kullanarak ortak safra kanalını dikkatlice serbest bırakın. Ortak safra kanalı çok kolay hasar görür ve kırılır.Bir kez kırıldıktan sonra, kanüle edilemez. Anatomik pozisyonun yönü nedeniyle, kavisli forsepslerin kullanımı daha kolaydır. Bir sonraki adıma hazırlanmak için ortak safra kanalının üzerine iki adet 6-0 ipek sütür halkası yerleştirin.Safra kanalını 30G iğne ile dikkatlice delin. Küçük delikleri büyütmek için sivri kavisli forseps kullanın, böylece safra kanalı kanülasyonunu besleyebilir. Safra kanalı kanülü boyunca damar kanülasyon forsepsleri kullanın ve safra kanalına itin. Not.Kanülasyon anında, safranın getirdiği direnci hissedeceksiniz. Kuvvet iyi kontrol edilmezse, kanül safra çıkış basıncı ile safra yollarından dışarı itilecektir. Kanülün derinliğini dikkatlice ayarlayın.Çok derinse, safra kanalına zarar verebilir ve yeterince derin değilse, kayabilir. Başarılı kanülasyondan sonra kanülde safra akımı gözlenebilir. Portal veni düz forseps ile sıkıştırın ve bağ dokusunu kavisli forsepslerle dikkatlice serbest bırakın.Portal damarın yırtılmasına neden olmamak için buraya sert çekmeyin. Portal ven hasar gördüğünde, portal veni yeniden canlandırmak zordur. Serbest portal ven üzerine iki adet 6-0 ipek sütür Loop yerleştirin.Distal portal veni kapatmak için bir arteriyel klips kullanın. Portal veni yukarıdaki portal ven kanüllerinden biriyle çok dikkatli bir şekilde delin. Başarılı bir delinmeden sonra kanül içinde kan akışı açıkça gözlemlenebilir.İnkübatörden önceden ısıtılmış heparin salin çözeltisi alın. Tüm hava kabarcıklarını çıkarın. Şırıngayı önceden ısıtılmış heparinize salin ile şırınga pompasına sabitleyin.Şırınga pompasının uzatma tüpünü portal venin kanülüne bağlayın. Hızı dakikada iki mililitreye ayarlayın ve karaciğer kızarmasına başlayın. İzofluranı% 5'e yükseltin ve fareyi aşırı dozda izofluran inhalasyonu ile ötenazi yapın.Yıkama prosedürünün sonunda karaciğerin rengini gözlemleyin. Renk homojen bir sarıya döndüğünde karaciğeri tüketin. Bir Petri kabı kullanarak karaciğeri dikkatlice organ odasına aktarın.Bir karaciğerin ezilmesini önlemek için Petri kabında az miktarda salin bulundurun. Not. Portal ven ve safra kanalı bu işlem sırasında kolayca bükülebilir, bu da karaciğer perfüzyonunu ve safra toplanmasını etkileyebilir. Kanüldeki hava kabarcıklarını tahliye etmek için normal salini portal ven kanülüne bir şırınga ile yavaşça infüze edin.Portal ven kanülünü organ odasındaki perfüzyonat çıkış tüpüne bağlayın. Fare safra kanalı kanülü, lastik bir kapakla kapatılmış organ odasının bir valfinden geçirilir. Daha sonra, safra tüpü, kurşunda küçük bir delik bulunan önceden hazırlanmış 0.5 mililitrelik bir mikro tüpe yerleştirilir.Her şey bağlandıktan sonra, peristaltik pompayı açın. Akış hızını ayarlamak için portal ven basıncı okumasını kontrol edin. Akış hızını ayarlayarak portal ven basıncını yedi ila 10 milimetre cıva arasında tutun. Not.Nominal akış hızı, tüplerin yaşına ve konumlandırılmasına bağlı olarak biraz değişebilir. Bu, normotermik oksijenli sıçan karaciğer makinesi perfüzyon çalışmalarının literatür çalışmasına dayanan perfüzyon ortamı, perfüzyonat hacmi ve perfüzyon basıncının seçimidir. Bu, fare perfüzyon modelini oluşturmak için adım adım bir denemedir.En uygun kateterleri seçmek için yaklaşık 14 deney yapıldı. Ellerimizde, portal ven için iki Fransız kauçuk kateteri ve safra kanalı için bir Fransız kauçuk kateteri kullanmak, tüm kateterler yerinde homojen perfüzyon elde etmek için en iyi kombinasyondur. pH seviyesi ve potasyum seviyesi 12 saatlik perfüzyon boyunca stabildi.pH seviyesi 7.26 ila 7.71 arasında değişmekte ve potasyum seviyesi litre başına 5.9 ila 6.8 milimol arasında değişmektedir. HE boyaması, 12 saatlik perfüzyondan sonra, fare karaciğerinin histoloji bütünlüğünün nispeten iyi korunduğunu göstermektedir. Birlikte ele alındığında, burada fare karaciğeri için normotermik oksijenli bir makine perfüzyon sisteminin başarılı bir şekilde kurulduğunu gösterdik.Bir fare karaciğerinin 12 saat boyunca perfüzyonu, tüm organ boyunca olmasa da, karaciğer morfolojisinin iyi bir şekilde korunmasına neden olmuştur. Daha uzun bir süre boyunca tam homojen perfüzyon elde etmek için daha fazla çaba gerekmektedir. Bu başarıldığında, iltihaplanmanın rolünü araştırmak için IL-2-nakavt farelerin kullanılması gibi genetiği değiştirilmiş hayvanların kullanımı düşünülebilir.

normothermic-ex-vivo-liver-machine-perfusion-in-mouse

Research

JoVE Journal

Engineering

Mühendislik

Hayvan organ fizyolojisinin incelenmesi, deneysel bir ex vivo perfüzyon sistemi gerçekleştirilerek gerçekleştirilebilir. Daha önce geliştirdiğimiz ex vivo karaciğer perfüzyon modelimize homeostatik bir organ olarak bir domuz böbreğinin eklenmesi, daha iyi bir fizyolojik ortam elde etmek için temel bir adım olabilir.

Otolog Ex vivo Perfüze Domuz Karaciğeri-Böbrek Deneyi için Adımlar

Bu tür yağlı karaciğerleri, yaşlı donörden greft veya kardiyak ölüm (DCD) sonra alınan karaciğerinin Marjinal greftler, sadece kötü konvansiyonel, soğuk statik depolama tahammül. Biz transplantasyon öncesinde marjinal karaciğer greft korunması, değerlendirilmesi, ve onarımı için subnormothermic ex vivo karaciğer perfüzyon yeni bir model geliştirdi.

Subnormothermic Tekniği<em&gt; Ex vivo</em&gt; Karaciğer Depolama, Değerlendirme Perfüzyon ve Marjinal Karaciğer Greft Onarımı

Burada, donör karaciğer greftlerinin oksijenli ex situ makine perfüzyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Bu makale, makine perfüzyonu için karaciğer greftini temin etmek ve hazırlamak, perfüzyon sıvısını hazırlamak, perfüzyon makinesini hazırlamak ve karaciğer greftinin oksijenli normotermik makine perfüzyonunu gerçekleştirmek için adım adım bir protokol içermektedir.

Donör karaciğerleri Ex Situ Normotermik Makinesi Perfüzyonu

Bu subnormothermic sıcaklığında (21 ° C), insan karaciğer greft ex vivo makine perfüzyon için bir yöntem tarif eder.

Subnormothermic Makine Perfüzyon Yoluyla Fonksiyonel İnsan Karaciğer Koruma ve Kurtarma

Önemli karaciğer donör kan olmadığını ve karaciğer bağış için ölçüt genişletilmiştir. Normothermic ex vivo karaciğer perfüzyon (NEVLP) değerlendirmek ve organ işlevini değiştirmek için geliştirilmiştir. Bu çalışma NEVLP bir fare modeli gösterir ve karaciğer koruma yaralanma azaltmak için pegile-katalaz, yeteneğini sınar.

Ex Vivo Normothermic karaciğer perfüzyon küçük bir hayvan Model

Protokol, portal ven perfüzyonu yoluyla metabolik çalışmalar için sağlam bir fare karaciğerini rezeke etmenin basit bir yöntemini açıklar.

Eski Vivo Farede Portal Damarından Hepatik Perfüzyon

Burada açıklanan karaciğer normotermik makine perfüzyonunun (NMP) domuz modeli, NMP'yi bir koruma stratejisi, canlılık değerlendirmesi için bir araç ve organ onarımı için bir platform olarak incelemek için başarıyla kullanılabilir. Yüksek bir çeviri değerine sahiptir, ancak teknik olarak zorlu ve emek yoğundur.

Domuz Normomik İzole Karaciğer Perfüzyonu

Burada, klinik öncesi biyomedikal araştırmalarda daha erişilebilir, uygun maliyetli ve yinelemeli kullanım sağlayan, mevcut platformların yüksek maliyetinin ve sınırlı esnekliğinin üstesinden gelmek için tasarlanmış açık kaynaklı, değiştirilebilir bir normotermik ex vivo perfüzyon sistemi için bir protokol sunuyoruz.

Araştırmacı bilim adamları için tasarlanmış açık kaynaklı bir Normothermic perfüzyon sistemi

Bu videoda, dinamik olarak değişen yüzeylerin yoğun 3D ölçümlerini sağlayan dijital saçak projeksiyon tekniklerinin temelleri açıklanmaktadır. Ayrıca, bu tekniklere dayalı yüksek hızlı bir ikili bulanıklaştırma sisteminin tasarımını ve çalışmasını da gösterir.

Dijital Fringe Projeksiyon Teknikleri ile Yüksek Çözünürlüklü, Yüksek Hızlı, Üç Boyutlu Video Görüntüleme

Yatay ve dikey elektrohidrodinamik sıvı köprüler yüksek yoğunluklu elektrik alanları ve polar dielektrik sıvıların etkileşimi keşfetmek için basit ve güçlü araçlardır. Temel aparat ve (örneğin, su, DMSO ve gliserol) sunulmuştur, üç sıvı için termografik görüntü dahil olmak üzere, çalışma örnekleri, bu yapı.

Polar Dielektrik Sıvılar gelen elektrohidrodinamik Köprülerin Hazırlanması

Öğrenin farede normotermik ekz vivo karaciğer perfüzyon sistemini kurmayı. Bu yöntem moleküler mekanizmaları araştırmak ve yeni perfüzat katkı maddeleri belirlemek için kullanılır.

Normothermic Ex Vivo Karaciğer Makinesi Farede Perfüzyon

Daha fazla video keşfet