Name: Cilt Biyopsilerinden Hasta Kaynaklı Podositlerin Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Keşfedin, cilt biyopsilerinden hasta kaynaklı podosit üretimi için epizomal yeniden programlama yöntemini. Bu protokol, kişiselleştirilmiş böbrek hastalığı modelleri oluşturarak tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Friedrich-Alexander Üniversitesi Erlangen-Nürnberg Disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi (IZKF) tarafından Janina Müller-Deile'ye verilen M4-IZKF-F009 hibe numarası ve Janina Müller-Deile'ye verilen 01GM2202D hibe numarası ile STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS proje adı altında Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) tarafından finanse edilmiştir. Annalena Kraus'a SEM görüntülerinin çekilmesindeki desteği için teşekkür ederiz.

Hastadan Elde Edilen Podositleri Oluşturmak için Deri Biyopsilerinin Kullanılması

<ol><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li>
<li>Grgic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+podocyte+foot+processes+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).</li>
<li>Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+podocyte+slit+diaphragm-from+a+thin+grey+line+to+a+complex+signalling+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub.</a> Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).</li>
<li>Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+glomerular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of glomerular permeability.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 281 (4), F579-F596 (2001).</li>
<li>Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+complexity+of+the+podocyte+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).</li>
<li>Muller-Deile, J., Schiffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+directed+therapy+of+nephrotic+syndrome-can+we+bring+the+inside+out%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out.</a> Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).</li>
<li>Boehlke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hantavirus+infection+with+severe+proteinuria+and+podocyte+foot-process+effacement%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Kidney+Diseases%22%5BJournal%5D)">Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement.</a> American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).</li>
<li>Schiffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+actin-dependent+dynamin+oligomerization+ameliorates+chronic+kidney+disease+in+diverse+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models.</a> Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).</li>
<li>Kopp, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Podocytopathies.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 68(2020).</li>
<li>Wiggins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+podocytopathies%3A+a+unifying+view+of+glomerular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases.</a> Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).</li>
<li>Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+differentiation+in+cultured+rat+and+human+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).</li>
<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li>
<li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+line+demonstrating+nephrin+and+podocin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).</li>
<li>Eto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+protection+by+darbepoetin%3A+preservation+of+the+cytoskeleton+and+nephrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression.</a> Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).</li>
<li>Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+methods+of+glomerular+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+%26+Blood+Pressure+Research%22%5BJournal%5D)">Culture methods of glomerular podocytes.</a> Kidney & Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).</li>
<li>Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+expression%2C+behaviors%2C+and+responses+vary+in+different+lines+of+conditionally+immortalized+cultured+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).</li>
<li>Shih, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD2AP+localizes+to+the+slit+diaphragm+and+binds+to+nephrin+via+a+novel+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain.</a> The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).</li>
<li>Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+is+critical+for+the+plasma+membrane+localization+of+nephrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).</li>
<li>Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipping+your+feet+in+the+water%3A+podocytes+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Dipping your feet in the water: podocytes in urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).</li>
<li>Camici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+detection+of+podocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Urinary detection of podocyte injury.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 61 (5), 245-249 (2007).</li>
<li>Muller-Deile, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+preeclampsia+induced+microRNA-26a-5p+leads+to+proteinuria+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3621(2018).</li>
<li>Schenk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+focal+segmental+glomerulosclerosis+%28FSGS%29+factor+suPAR+using+CytoSorb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Apheresis%22%5BJournal%5D)">Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb.</a> Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).</li>
<li>Petermann, A., Floege, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+damage+resulting+in+podocyturia%3A+a+potential+diagnostic+marker+to+assess+glomerular+disease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron.+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity.</a> Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).</li>
<li>Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+excretion+of+viable+podocytes+in+health+and+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).</li>
<li>Petermann, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes+that+detach+in+experimental+membranous+nephropathy+are+viable%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable.</a> Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).</li>
<li>Sakairi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+lines+established+from+urine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).</li>
<li>Rauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+iPSCs+into+functional+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human iPSCs into functional podocytes.</a> PLoS One. 13 (9), e0203869(2018).</li>
<li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+human+somatic+reprogramming+to+iPS+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell.</a> Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).</li>
<li>Bang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+episomal+reprogramming+for+generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts.</a> Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).</li>
<li>Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+differentiation+of+mature+kidney+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+under+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e3779(2013).</li>
<li>Hoffding, M. K., Hyttel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+visualization+of+the+Mesenchymal-to-Epithelial+Transition+during+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>Bharathan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+markers+used+for+the+identification+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells.</a> Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+from+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).</li>
<li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+more+than+a+proliferation+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li>
<li>Vaz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+after+induced+pluripotent+stem+cells+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming.</a> Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147(2021).</li>
<li>Reiser, J., Altintas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Podocytes.</a> F1000Research. 5, 114(2016).</li>
<li>Ohmori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+NEPHRIN+localization+in+kidney+organoids+derived+from+nephrotic+patient+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 3982(2021).</li>
<li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu hücre kültürü tabanlı protokol, insan dermal fibroblastlarının hastaya özgü hiPSC'lere epizomal yeniden programlanmasını ve daha sonra hiPSC türevli podositlere farklılaşmasını birleştirir. Bu, podosit hasarı ile ilgili genetik glomerüler hastalığı olan hastalardan podositlerin mutasyona bağlı değişikliklerini incelememizi sağlar. Dermal fibroblastları elektroporasyon yoluyla entegrasyonsuz bir yöntemle yeniden programlama protokolü, Bang ve ark.32 ve Okita ve ark.33'ün yayınlanmış çalışmalarından uyarlanmıştır. Podositleri hiPSC'lerden ayırma protokolü, Musah ve ark.28,34,35'in yayınlanan protokolünden uyarlanmıştır. HiPSC'lerdenpodosit üretimini açıklayan yayınlar zaten mevcuttur 27,34,35. Bununla birlikte, burada sağlanan protokol, hiPSC'lerin podositlere farklılaşması konusunda optimize edilmiş ve daha ucuzdur. Musah ve ark.'nın yayınladığı protokolle karşılaştırıldığında, bu protokolü vitronektin, laminin ipek-511 ve çözünür bazal membran matrisi gibi farklı kaplama reaktifleri üzerinde test ettik. Vitronektin ve laminin silk-511 konsantrasyonları 5 μg / mL 28,34,35 yerine 2,5 μg / mL'ye düşürülebilir. Ayrıca, BMP7 ve aktivin A-iki çok pahalı büyüme faktörü konsantrasyonlarını-% 50 oranında, 100 ng / mL'den 50 ng / mL'ye düşürmek mümkün olmuştur.
Bu, daha ucuz farklılaşma sağlar. 7. günden itibaren nefron progenitör hücreleri hala çoğalıyordu ve donma olasılığı daha önce gösterilmişti. Bu hücreleri çözüldükten sonra ve Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyeri (DMEM) ve B27'yi içeren bazik ortamda son farklılaşmadan önce birkaç gün boyunca genişlettik ve maliyetleri daha da düşürdük. Farklılaşma adımlarına ek olarak, bu protokol fibroblastların deri biyopsilerinden sonraki nesil hastaya özgü hiPSC'lerle epizomal yeniden programlama yoluyla büyümesini tanımlar. Bu iki yöntemin kombinasyonu hastaya özgü podositlerin üretilmesini sağlar. Bu nedenle, hastaya özgü hiPSC türevli podositler üretmek için daha önce bu kadar ayrıntılı olarak tanımlanmamış eksiksiz bir adım adım protokol burada sağlanmıştır.
Genel protokol birkaç farklı hücre tipi içerdiğinden, üretilen hücre tiplerini farklı adımlarda karakterize etmek çok önemlidir. Hücreler uzun süre kültürdedir, bu nedenle kalite kontrol farklı pasajlarda yapılmalıdır. HiPSC'lerle çalışırken, günlük beslenmenin yanı sıra hücre davranışı ve morfoloji izlemesi de gereklidir. Farklılaştırma ortamının sterilitesi, 0,2 μm'lik bir filtre aracılığıyla filtre sterilizasyonu ile sağlanmalıdır. Cilt biyopsisinden hiPSC türevi podositlere kadar tüm protokol birkaç ay sürer, ancak hücreleri işlemin farklı aşamalarında dondurmak mümkündür. Nefron progenitör farklılaşma ortamında 7 gün sonra fibroblastlar, seçilmiş hiPSC klonları ve proliferatif nefron progenitör hücreleri dondurulabilir ve çalışan bir hücre bankası oluşturulabilir.
HiPSC türevli sağlıklı podositler ayrı bir birincil ve sekonder ayak süreçleri ağı geliştirse de (Şekil 5A,B) ve tipik podosit spesifik belirteci eksprese etse de (Şekil 6A-C), in vivo olarak görüldüğü gibi karakteristik yarık diyaframların klasik iki boyutlu hücre kültürü modellerinde taklit edilmesi zordur. Dahası, diğer glomerüler hücre tipleriyle hücreler arası iletişim bu mono-kültür ortamında mümkün değildir.
Terminal farklılaşmış durumları ve proliferasyon kapasitesinin olmaması nedeniyle, podositleri ex vivo olarak incelemek zordur. Koşullu olarak ölümsüzleştirilen birincil podositlerin yardımıyla, ısıya duyarlı bir anahtarın yerleştirilmesiyle bu sınırlamanın üstesinden gelmek mümkündür, bu da hücrelerin 33 ° C'de çoğaldığı ve 37 ° C'de farklılaştığı bir hücre kültürü modeli ile sonuçlanır13,14. Bu siPodositler podosit araştırması için yüksek potansiyele sahip olsalar da, belirteç ekspresyonunun eksikliği, farklılaşmamış morfoloji ve ayak süreçlerinin oluşturulamaması gibi sınırlamalar vardır15,16.
Podositlerin hasta kaynaklı somatik hücrelerden farklılaşması, hastalıklı podositlerin ex vivo sağlıklı kontrol hücreleri ile üretilmesini ve karşılaştırılmasını sağlar. Bu, podosit spesifik genlerdeki mutasyonlara bağlı podosit hasarını incelememizi sağlar. Ayrıca, hiPSC'lerle çalışmak, üç boyutlu hücre kültürü hastalık modelleri, daha doğrusu organoidler43,44 oluşturma potansiyeline sahiptir. HiPSC türevli podositlerin glomerüler endotel hücreleri veya mezangial hücreler gibi diğer glomerüler hücrelerle birlikte kültürlenmesi, sağlık ve glomerüler hastalıkta hücreler arası iletişim konusunda yeni anlayışlara yol açabilir.
Ayrıca, hastaya özgü podositlerin karakterizasyonu ve tedavisi yüksek verim analizinde ex vivo olarak gerçekleştirilebilir. Bireyselleştirilmiş yaklaşım, spesifik mutasyonlar için yeni terapötik hedefleri araştırma ve gelecekte bireyselleştirilmiş tıp yapma fırsatı sunmaktadır.

Podositler, glomerüler bazal membran (GBM), glomerüler endotel hücreleri ve glikokaliks ile birlikte böbreğin glomerüler filtrasyon bariyerini oluşturan özelleşmiş, post-mitotik renal epitel hücreleridir. Fenotipik olarak, podositler bir hücre gövdesi ve birincil, mikrotübül tahrikli membran uzantılarının yanı sıra ayak işlemleri 1,2 adı verilen ikincil uzantılardan oluşur. İdrarı kandan filtreleyen glomerüler filtrasyon bariyeri, fenestrated endotel, GBM ve podoktyes3'ün yarık diyaframı olarak adlandırılan komşu podosit ayak süreçlerini birbirine bağlayan özel bir hücreler arası kavşak türünden yapılmıştır. Sağlıklı koşullar altında, albüminden daha büyük proteinler, büyüklükleri ve yükleri4 nedeniyle filtrasyon bariyerinden tutulur.
Sitoiskelet veya podosit spesifik genlerdeki mutasyonların yanı sıra podosit sinyal yollarını etkileyen dolaşım faktörlerinin, podosit effacement, dekolmanı veya apoptozu indüklediği ve proteinüri ve glomerüler skleroz ile sonuçlandığı bilinmektedir. Özellikle, sitoiskeletin yeniden düzenlenmesi, podosit polaritesindeki değişiklikler veya yarık kavşakların kaybı ile ilişkili ayak süreçlerinin hasarı çok önemlidir5. Ölümcül olarak farklılaşmış durumları nedeniyle, podositler GBM'nin ayrılmasından sonra zorlukla değiştirilebilir. Bununla birlikte, podositler GBM'ye bağlanırsa, yine de efffacement'tan kurtulabilir veayak süreçlerini 6,7,8 ile değiştirebilirler. Çeşitli glomerüler bozukluklarda podosit hasarına yol açan olayların daha iyi anlaşılması, bu hastalıklar için tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olacak yeni terapötik hedefler sağlayabilir. Podosit hasarı, fokal segmental glomerüloskleroz (FSGS), diyabetik nefropati, minimal değişiklik hastalığı ve membranöz glomerülonefropati gibi farklı glomerüler hastalıkların ayırt edici özelliğidir ve bu hastalıkların patolojik mekanizmalarını ve potansiyel tedavi yaklaşımlarını incelemek için güvenilir podosit ex vivo modelleri gerektirir 9,10. Podositler, diferansiyel eleme ile glomerüllerin izolasyonuna dayanan klasik primer hücre kültürü ile ex vivo olarak incelenebilir11. Bununla birlikte, sınırlı proliferasyon kapasitesine sahip terminal olarak farklılaşmış durum nedeniyle, çoğu araştırmacı SV40 büyük T antijeninin sıcaklığa duyarlı varyantlarını eksprese eden fare veya insan siPodosit hücre hatlarını kullanır. Alternatif olarak, siPodositler, SV40 Tag ölümsüzleştirici gen 1,12'yi barındıran transgenik farelerden izole edilir.
SiPodositler 33 ° C'de çoğalır, ancak büyüme durmasına girer ve 37 ° C'de farklılaşmaya başlar13,14. Bu hücrelerle elde edilen deneysel verilerin, hücreler doğal olmayan bir gen yerleştirme15 kullanılarak üretildiğinden, belirli bir dikkatle yorumlanması gerektiği unutulmamalıdır. Bu hücreler ölümsüzleştirici bir gen barındırdığından, devam eden proliferasyon nedeniyle hücresel fizyoloji değişir12. Bu yaklaşımla üretilen podosit hücre hatları son zamanlarda sorgulanmıştır, çünkü fare, insan ve sıçan siPodositleri, protein düzeyinde sinaptopodin ve nefrinin% 5'inden azını, ayrıca glomerüler ekspresyon16'ya kıyasla mRNA seviyesinde NPHS1 ve NPHS2'yi ifade etmektedir. Dahası, çoğu podosit hücre çizgisi nefrin17,18 eksprese etmez. Chittiprol ve ark. ayrıca siPodositlerde hücre motilitesinde ve puromisin ve doksorubisin yanıtlarında anlamlı bir fark tanımlamışlardır16. Podositler, farklı glomerüler hastalıklarda GBM'den ayrıldıktan sonra idrarda bulunabilir 19,20,21,22. Canlı üriner podositler 2-3 haftaya kadar ex vivo olarak yetiştirilebilir, ancak çoğu hücre apoptoz23,24'e maruz kalır. İlginçtir ki, podositler sadece glomerüler hastalığı olan hastaların idrarında değil, aynı zamanda sağlıklı deneklerin idrarında, büyük olasılıkla yaşlandıklarında da bulunur - yine kültür24'te sınırlı bir replikasyon potansiyeline sahiptir. Ayrıca, idrar kaynaklı podosit sayısı sınırlıdır ve hücreler kültürde farklılaşır, daha az ayak süreci gösterir, morfolojiyi değiştirir ve en önemlisi sınırlı proliferasyon kapasitesine sahiptir. Podosit spesifik genlerin ekspresyonu yoktur, birkaç hafta içinde kaybolur veya bu hücre klonları arasında değişir. Podosit spesifik belirteç için pozitif olan bazı hücreler, tübüler epitel hücrelerinin veya miyofibroblastların ve mezangial hücrelerin belirtecini birlikte eksprese ettiler, bu da kültürlü üriner podositlerin dediferansiyasyonunu ve / veya transdiferansiyasyonunu düşündürmektedir24,25.
Son zamanlarda, hastaların ve sağlıklı gönüllülerin idrarından elde edilen siPodosit hücre hatlarının ısıya duyarlı SV40 büyük T antijeni ve hTERT ile transdüksiyon yoluyla üretilmesi tanımlanmıştır26. Sinaptopodin, nestin ve CD2 ile ilişkili protein için mRNA ekspresyonu tespit edildi, ancak podosin mRNA tüm klonlarda yoktu. İdrar podositleri ile ilgili sorunlara ek olarak, bu hücreler aynı zamanda yerleştirilen ölümsüzleştirici geni de içerir ve bu da yukarıda tartışılan dezavantajlara neden olur.
Buna karşılık, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler), uygun koşullar altında kendini yenilemek ve çoklu hücre tiplerine farklılaşmak için büyük bir kapasiteye sahiptir. HiPSC'lerin neredeyse sınırsız bir podosit kaynağı olarak hizmet edebileceği daha önce gösterilmiştir27,28.
Burada, deri punch biyopsilerinin dermal fibroblastlarından hastaya özgü podositler üretmek için iki aşamalı bir protokol, daha sonra hiPSC'lere epizomal yeniden programlama ve hiPSC türevi podositlere son bir farklılaşma açıklanmaktadır (Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig01.jpg"> Şekil 1: Hastaya özgü hiPSC türevi podositler üretmek için protokol. Bir deri biyopsisinin dermal fibroblastlarından hastaya özgü podositler üretmek için protokole grafiksel genel bakış, hiPSC'lere yeniden programlanarak ve podositlere farklılaşarak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
İlk adım olarak, somatik dermal fibroblastlar deri punch biyopsisinden büyütüldü ve OCT3/4, KLF4, SOX2 ve c-MYC29,30,31 transkripsiyon faktörlerini eksprese eden plazmidlerle elektroporasyon yoluyla entegrasyonsuz bir yöntem kullanılarak hiPSC'lere yeniden programlandı. Ortaya çıkan hiPSC kolonileri daha sonra seçildi ve genişletildi. Farklılaşma, WNT sinyal yolunun aktivasyonu ile mezodermal soyun indüksiyonu ile başladı, bunu hala çoğalabilen nefron progenitör hücrelerin oluşumu izledi. Son olarak, hücreler podositlere farklılaştırıldı. Bu prosedürde, Bang ve ark.32 ve Okita ve ark.33 tarafından hiPSC'lerin oluşturulması için epizomal yeniden programlama için daha önce yayınlanmış protokolleri ve ayrıca Musah ve ark.28,34,35 tarafından hiPSC'lerin podositlere farklılaştırılması için bir protokolü değiştirdik ve birleştirdik.
Gerçekten de, protokolümüz tarafından üretilen podositler, primer ve sekonder ayak süreçlerinin ayrı bir ağının gelişimi ve sinaptopodin, podosin ve nefrin gibi podositlere özgü belirteçlerin ekspresyonu ile ilgili olarak in vivo podositlere daha yakın bir fenotipe sahipti. HiPSC türevi podositlerin kullanımıyla, hastanın genetik arka planı yeniden programlama ve farklılaşma sırasında korunur. Bu, hastaya özgü podosit hastalığının modellenmesini ve potansiyel terapötik maddelerin ex vivo olarak neredeyse sınırsız sayıda hücre sayısında keşfedilmesini sağlar. Dahası, bu protokol minimal invaziv, uygun maliyetli, etik olarak kabul edilebilir ve ilaç geliştirme için yeni yollar kolaylaştırabilir.

<table><tbody><tr><td>0.2 ve mikro; m steril filtre</td><td>Rotilab</td><td>P668.1</td><td>farklılaşma ortamı</td></tr><tr><td>all-trans retinoik asit</td><td>sterilizasyonu için Kök Hücre Teknolojileri</td><td>72262</td><td>farklılaşma takviyesi</td></tr><tr><td>B27 takviyesi (50 x), serum içermeyen</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>serumsuz farklılaşma ortamı</td></tr><tr><td>BG iMatrix-511 için takviye İpek</td><td>biyogemleri</td><td>RL511S</td><td>hiPSC kültürüne uygun hücre kültürü plastiklerini kaplamak için kaplama çözeltisinde kullanılan hücre dışı matris reaktifinin ek seçeneği</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)&nbsp;</td><td>Roth</td><td>8076.4</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Filtre Kapağı Hücre Kültürü Şişeleri, T75, 250 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-856</td><td>fibroblast kültürüne uygun hücre kültürü</td></tr><tr><td>plastikleri CHIR99021 (5 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252917-06-9&nbsp;</td><td>Farklılaşma için ek</td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC nitelikli matris&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>hiPSC kültürü (çözündürülmüş bazal membran matrisi) için uygun hücre kültürü plastiklerini kaplamak için kaplama çözeltisinde kullanılan hücre dışı matris reaktifinin ek seçeneğini</td></tr> sunar, <tr><td>kontes Hücre Sayma Odası Slaytları</td>, <td>hücreleri saymak için</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td></tr><tr><td>, kontes II FL&nbsp; Hücreleri</td><td>saymak için</td>Otomatik Hücre Sayacı <td>İnvitrojen</td><td></td></tr><tr><td>cryoPure tüpleri, 2 ml, QuickSeal vidalı kapak, hücrelerin</td> dondurulması için beyaz <td>Sarstedt</td><td>72380</td><td>kriyoviyaller</td></tr><tr><td>dimetil sülfoksit (DMSO)&nbsp;</td><td>Fibroblast dondurma ortamı için</td> <td>Roth</td><td>A994.1</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1 x)</td><td>Gibco</td><td>11320074</td><td>farklılaşma için temel besiyeri</td></tr><tr><td>DMEM/F12 + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>fibroblast ortamı için temel besiyeri</td></tr><tr><td>EVOS M5000 Görüntüleme Sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF5000</td><td>faz kontrast mikroskobu</td></tr><tr><td>fetal sığır serumu premium, inaktive (FCS)</td><td>Fibroblast ortamı, fibroblast dondurma ortamı ve podosit bakım ortamı için</td> <td>PAN Biotech</td><td>P301902</td></tr><tr><td>serumu fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm boşluk, 800 & </td><td>Fibroblastların elektroporasyonu/epizomal yeniden programlanması için kullanılan</td> L kapasiteli, steril <td>Fisherbrand</td><td>FB104</td> küvet (4 mm boşluk)</tr><tr><td>fluoromount-G Montaj Ortamı, DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td>ile dapi</td></tr><tr><td>gauge iğnesi içeren montaj ortamı (0,6 x 30 mm)</td> <td>hiPSC kolonilerinin küçük parçalara ayrılması için</td> <td>BD Microlance3</td><td>300700</td></tr><tr><td>insan Rekombinant Aktivin A Proteini</td><td>78001.1</td><td>Farklılaşma için kök hücre teknolojileri</td><td>takviyesi</td></tr><tr><td>insan rekombinant kemik morfogenetik proteini 7 (BMP7)</td><td>Peprotech</td><td>120-03P</td><td>farklılaşma için takviye</td></tr><tr><td>insan VEGF-165 Rekombinant Protein</td><td>Termo Bilimsel</td><td>PHC9394</td><td>farklılaşması için takviye</td></tr><tr><td>insülin-transferrin-selenyum (ITS -G) (100 x)</td><td>Gibco</td><td>41400045</td><td>takviyesi </td></tr><tr><td>hiPSC kültürünün sterilite testi için</td>podosit bakım ortamı<td>LB ortamı</td><td>Roth</td><td>X964.1</td></tr><tr><td>lookOut Mycoplasma PCR Tespit Kiti</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MP0035-1KT</td><td>ticari mikoplazma tespit kiti</td></tr><tr><td>mikroskop slaytları</td><td>Diagonal GmbH & Co.KG</td><td>21,102</td><td></td></tr><tr><td>mikrotüp 1,5 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>72706400</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 Komple Kit</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>85850</td><td>serumsuz hiPSC kültür ortamı</td></tr><tr><td>nalgen dondurma kabı için temel ortam Mr.Frosty</td><td>Roth</td><td>AC96.1&nbsp;</td><td>Optimum dondurma koşullarını sağlamak için</td></tr><tr><td>Ön inkübasyon çözeltisi ve antikor seyreltici</td>nunc 24 kuyulu plakalar için <td>normal keçi serumu</td><td>abcam</td><td>ab 7481</td></tr><tr><td>hiPSC</td> kültürü <td></td> nunc 48<td>kuyulu</td> plakalar için <td>uygun Thermo Scientific 142485 hücre kültürü plastikleri</td></tr><tr><td>;</td><td>Thermo Scientific</td><td>152640</td><td>hiPSC kültür</td></tr><tr><td>nunc 6 kuyulu plakalar için uygun hücre kültürü plastikleri&nbsp;</td>hiPSC kültür nunc için uygun <td>Thermo Scientific</td><td>140685</td><td>hücre kültürü plastikleri</td></tr><tr><td>EasYDish Yemekler 100 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150466</td><td>hiPSC kültürü</td></tr><tr><td>nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta İşlemli, Düz Tabanlı Mikroplaka</td> hiPSC kültürüne uygun <td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>hücre kültürü plastikleri</td></tr><tr><td>nutriFreez D10 Kriyoprezervasyon Ortamı</td><td>Sartorius</td><td>05-713-1E&nbsp;</td><td>hiPSC ve nefron progenitör hücrelerinin kriyoprezervasyonu için serumsuz kriyoprezervasyon ortamı</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td>elektroporasyon ortamı&nbsp;</td></tr><tr><td>pCXLE-hMLN</td><td>Addgene</td><td>#27079</td><td>epizomal yeniden programlama için plazmid</td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4 plazmid</td><td>Addgene</td><td>#27077</td><td>epizomal yeniden programlama için plazmid</td></tr><tr><td>pCXLE-hSK plazmid</td><td>Addgene</td><td>#27078</td><td>epizomal yeniden programlama için plazmid</td></tr><tr><td>penisilin-streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td>bakteriyel kontaminasyonu önlemek için</td></tr><tr><td>plastik lameller</td><td>Sarstedt</td><td>&nbsp; 83.1840.002</td><td>hiPSC'lerin ve hiPSC'den türetilmiş podositlerin immünofloresan boyamaları için</td></tr><tr><td>ROTI Histofix</td><td>Roth</td><td>P087.3</td><td>ticari paraformaldehit (% 4) Hücrelerin fiksasyonu için</td></tr><tr><td>RPMI 1640 + L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>21875034</td><td>temel besiyeri Podosit bakımı için orta</td></tr><tr><td>boyama odası StainTray Siyah kapak</td><td>Roth</td><td>HA51.1</td><td></td></tr><tr><td>stemPro Accutase Hücre Ayrışma Reaktifi</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>hiPSC'lerin ayrışması için kullanılan enzimatik hücre ayırma solüsyonu</td></tr><tr><td>steril fosfat tamponlu salin (PBS) (1 x)</td><td>Gibco</td><td>14190094</td> steril suyu <td>yıkamak ve kaplamak için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td>Roth</td><td>T1432</td><td></td></tr><tr><td>iğnesiz şırınga 20 mL</td><td>BD Plastipak</td><td>300629</td><td>filtre sterilizasyonu için farklılaşma ortamı</td></tr><tr><td>TC kabı 100 mm</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,902</td><td>deri biyopsisi ve fibroblast kültürünü kesmek için kullanılan steril hücre kültürü plastikleri</td></tr><tr><td>TC kabı 35 mm</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,900</td><td>deri biyopsisinden fibroblastları çıkarmak için kullanılan steril hücre kültürü plastikleri</td></tr><tr><td>triton X 100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td>ön inkübasyon çözeltisi için&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td></td><td>tripsin-EDTA (</td><td></td></tr><tr><td>10 x)&nbsp;</td><td>Fibroblastlar ve nefron progenitör hücreleri için kullanılan</td> <td>Biowest</td><td>X0930-100</td> ayrışma reaktifi</tr><tr><td>tüp 15 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271-N</td><td></td></tr><tr><td>tüp 50 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>vitronektin ACF</td><td>Sartorius</td><td>05-754-0002</td><td>hiPSC kültürüne uygun hücre kültürü plastiklerini kaplamak için kaplama çözeltisinde kullanılan hücre dışı matris reaktifi</td></tr><tr><td>Bölünme</td> <td>sırasında hiPSC'lerin apoptozunu önlemek için</td> Y-27632 dihidroklorür (10 mg)<td>Tocris</td><td>1254</td></tr><tr><td><güçlü>Primer antikorlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4&nbsp;</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>600993.1</td><td>pluripotent markör, seyreltme 1:200</td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>60062FI.1</td><td>pluripotens markörü, seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>proliferasyon belirteci, seyreltme 1:300</td></tr><tr><td>sinaptopodin</td><td>Proteintech</td><td>21064-1-AP</td><td>podosit spesifik markör, seyreltme 1:200</td></tr><tr><td>nefrin</td><td>Progen</td><td>GP-N2</td><td>podosit spesifik belirteç, seyreltme 1:25</td></tr><tr><td>podosin</td><td>proteintech</td><td>20384-1-AP</td><td>podosit spesifik belirteç, seyreltme 1:100</td></tr><tr><td><güçlü>İkincil antikorlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>keçi anti-Gine Domuzu IgG (H + L) yüksek çapraz adsorbe edilmiş ikincil antikor, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21435</td><td>ikincil anditbody, seyreltme 1:1000</td></tr><tr><td>alexa Fluor 647 Keçi Anti-Tavşan SFX Kiti, yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş</td><td>Invitrogen</td><td>A31634</td><td>ikincil anditbody, seyreltme 1:1000</td></tr><tr><td>eşek anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>ikincil anditbody, seyreltme 1:1000</td></tr><tr><td>keçi anti-Fare IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>ikincil anditbody, seyreltme 1:1000</td></tr><tr><td>keçi anti-Fare IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>ikincil anditbody, seyreltme 1:1000</td></tr></tbody></table>

cilt biyopsilerinden hasta kaynaklı podositlerin Üretimi

Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

Podositler, glomerüler filtrasyon bariyerinin idrar bölgesinde oturan ve glomerulusun seçici filtre fonksiyonuna katkıda bulunan epitel hücreleridir. Podosit spesifik genlerdeki mutasyonlar fokal segmental glomerüloskleroza (FSGS) neden olabilir ve podositler diğer birçok primer ve sekonder nefropatide de etkilenir. Farklılaşmış doğaları nedeniyle, birincil hücre kültürü modelleri podositler için sınırlıdır. Bu nedenle, yaygın olarak şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş hücreler kullanılır. Bununla birlikte, bu şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş podositlerin (siPodositler) birkaç sınırlaması vardır: hücreler, özellikle akıcılığa ulaştıklarında, kültürde farklılaşabilir ve birkaç podosit spesifik belirteç, ya sadece hafifçe ifade edilir ya da hiç ifade edilmez. Bu da siPodositlerin kullanımını ve fizyolojik, patofizyolojik ve klinik erişim için uygulanabilirliklerini sorgulamaktadır. Burada, dermal fibroblastların hiPSC'lere epizomal olarak yeniden programlanması ve ardından podositlere farklılaşması yoluyla deri punch biyopsisinden hastaya özgü podositler de dahil olmak üzere insan podositlerinin üretilmesi için bir protokol açıklanmaktadır. Bu podositler, ayak süreçlerinin gelişimi ve podosit spesifik belirtecin ekspresyonu gibi morfolojik özellikler açısından in vivo podositlere çok daha iyi benzemektedir. Son olarak, ancak daha da önemlisi, bu hücreler hastaların mutasyonlarını korur ve podosit hastalıklarını ve potansiyel terapötik maddeleri bireyselleştirilmiş bir yaklaşımla incelemek için geliştirilmiş bir ex vivo model ile sonuçlanır.

Epizomal yeniden programlama ve farklılaşmayı birleştiren bu adım adım protokolle, podositle ilgili bir gende hastanın mutasyonunu taşıyan podositler üretmek mümkündür. Bu, hastalığa özgü podosit değişikliklerinin ex vivo analizini sağlar. Hastanın genetik arka planı, tüm farklı hücre aşamalarında protokol sırasında korunur. Ek olarak, terminal olarak farklılaşmış proliferasyon yapmayan podositlerin yetersiz hücre sayısı sınırlaması, hiPSC türevi podositler kullanılarak aşılabilir. HiPSC-podositlerin, hiPSC'lere yeniden programlama ve ardından podositlere farklılaşma yoluyla büyümüş dermal fibroblastlardan üretilmesi birkaç ay sürse de, protokolün üç farklı adımında hücreleri dondurmak mümkündür (Şekil 2). Fibroblastlar, hiPSC'ler ve nefron progenitör hücreleri için nefron progenitör diferansiyasyon ortamında 7 gün boyunca farklılaştıktan sonra donma mümkündür. Bu nedenle, çalışan hücre bankalarının ve büyük ölçekli deneylerin oluşturulması mümkündür.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig02.jpg"> Şekil 2: Bir faz kontrast mikroskobu ile protokolün bireysel adımları. (A) Büyümüş dermal fibroblastlar. (B) Yeniden programlamadan sonra hiPSC koloni oluşumu. (C) Seçilmiş hiPSC kültürü. (D) 2 günlük farklılaşmadan sonra mezoderm hücreleri. (E) Nefron progenitör farklılaşma ortamında 14 günlük farklılaşmadan sonra nefron progenitör hücreleri. (F) Terminal farklılaştırılmış hiPSC türevi podositler. Ölçek çubukları 300 μm (A,B,D-F) ve 150 μm'yi (C) temsil eder. Kar tanesi olası donma adımlarını vurgular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Üretilen hiPSC türevli podositler, hücre tipi ve morfolojisi ile ilgili ciddi değişiklikler içeren uzun bir protokolden geçtiğinden, hücre karakterizasyonu zorunludur. Boyut ve hücre şekli gibi hücre morfolojisinin yanı sıra büyüme davranışı, bir faz kontrast mikroskobu kullanılarak izlenebilir. Fibroblastlar, 150 μm ila 300 μm boyutlarında uzun iğ benzeri bir fenotip sunar (Şekil 2A). Yeniden programlamadan sonra, 50 μm küçük hiPSC'lere sahip koloniler oluşur. Bu koloniler, yüksek çekirdek-vücut oranı ve artmış proliferasyon hızı ile ayırt edilen farklı sınırlar ve hiPSC'ler gösterir (Şekil 2C). Podositler terminal olarak farklılaşmış hücreler olduğundan, proliferasyon hızı ilerleyici farklılaşma ile azalır ve hücre morfolojisi belirgin ayak süreçlerine sahip 300 μm büyüklüğünde yıldız şeklindeki podositlere dönüşür (Şekil 2F).
Akıcılık, hiPSC kültürünün kritik bir noktasıdır ve koloniler çok yoğunlaştığında kendiliğinden farklılaşma ortaya çıkabilir (Şekil 3). Bu koloniler, kültür kabının etkilenen kısımlarını kazıyarak geçmeden önce çıkarılmalıdır.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig04.jpg"> Şekil 3: Farklı kalitedeki hiPSC'lere örnekler. Başarılı bir şekilde (A) yeniden programlanmış hiPSC kolonilerinin ve (B) seçilmiş hiPSC'lerin faz kontrast görüntülerinin yanı sıra (C) spontan farklılaşma, (D, E) hiPSC olmayan koloniler ve (F) çok yoğun bir hiPSC kültürü. Ölçek çubukları 300 μm'yi temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu protokolün farklı hücre tipleri, belirli bir işaretleyicinin ekspresyonu ile ilgili olarak doğrulanmalıdır. Yeniden programlamadan sonra, hiPSC'ler pluripotens kapasitesini yeniden kazanır ve SSEA4, OCT3/4 ve Ki67 gibi proliferasyon ve pluripotens belirteçlerini eksprese eder (Şekil 4)38,39,40. Yeniden programlamanın yanı sıra uzun süreli hiPSC kültürü ve farklılaşmanın anormal bir karyotipe yol açabileceği veya daha doğrusu mutasyonlara neden olabileceği bilinmektedir41. Bu nedenle, kültürlenmiş hücrelerin genetik arka planı zaman içinde ve farklı pasajlarda g-bandı ve tüm ekzom dizilimi ile izlenmelidir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig03.jpg"> Şekil 4: İmmünofloresan boyama ile üretilen hiPSC'lerin karakterizasyonu. Üretilen hiPSC'lerin (A) proliferatif belirteç Ki67'nin yanı sıra pluripotens belirteçleri (B) OCT3/4 ve (C) SSEA4 için boyanarak karakterizasyonu. Ölçek çubukları 100 μm'yi temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Morfolojik olarak, hiPSC türevli podositler yıldız şeklinde görünür ve siPodositlere kıyasla uzun birincil ve ikincil ayak süreçlerinin farklı bir ağını ifade eder (Şekil 5). HiPSC türevi podositler, sinaptopodin, nefrin ve podosin gibi podosit spesifik belirteç proteinlerini eksprese eder (Şekil 6A-C)42.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig05.jpg"> Şekil 5: HiPSC türevli podositlerin siPodositlere kıyasla morfolojisi. Sağlıklı bir donörden alınan (A,B) hiPSC türevli podositlerin hücre morfolojisi ve filopodia açısından (A,D) siPodositlerle faz kontrast mikroskobu (A,C) ve taramalı elektron mikroskobu (B,D) kullanılarak karşılaştırılması. Ölçek çubukları 150 μm (A,C) ve 20 μm'yi (B,D) temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu nedenle, hiPSC türevli podositlerin sadece sağlıklı donörlerden değil, aynı zamanda podosit spesifik genlerde mutasyonları olan hastalardan da karşılaştırılması, hastanın mutasyonunun ex vivo olarak bireyselleştirilmiş karakterizasyonuna izin verir.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig06.jpg"> Şekil 6: HiPSC türevli podositlerde ve siPodositlerde podosit spesifik bir belirtecin karakterizasyonu. Sağlıklı bir donörden alınan (A-K) hiPSC türevi podositlerin podosit spesifik belirteç proteinleri sinaptopodin (A,D), nefrin (B,E) ve podosin (C,F) açısından (D-F) sipodositlerle karşılaştırılması. Ölçek çubukları 50 μm'yi temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1. Çalışmada kullanılan tüm hücre kültürü ortamlarının ve çözeltilerinin bileşimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/Table%201_REv2.zip" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Bu makalede, dermal fibroblastlardan hastaya özgü podositlerin epizomal yeniden programlanması yoluyla insan kaynaklı pluripotent kök hücrelere (hiPSC'ler) ve ardından podositlere farklılaşması için iki aşamalı bir protokol açıklanmaktadır.

Cilt Biyopsilerinden Hasta Kaynaklı Podositlerin Üretimi

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the ...

Dermal fibroblastları insan kaynaklı pluripotent kök hücrelere epizomal olarak yeniden programlayarak insan podositleri üretmek için bir protokol tanımladık. Bu hücreler, podosit gıda süreçleri ve podosit spesifik belirteçlerinin ekspresyonu açısından in vivo podositlere ölümsüzleştirilmiş podositlerden çok daha iyi benzemektedir. Podositler terminal olarak farklılaşmış hücrelerdir.Bu nedenle, bu hücreler artık çoğalmaz ve hücre kültüründe primer podosit analizi sınırlıdır. Sınırlı hücre sayısı sorunu, şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş podositler kullanılarak aşılmasına rağmen, bu podositler, temel araştırmalarda kullanımlarını sorgulayan farklılaşmamış bir fenotip ve davranış sunar. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin yardımıyla, podositler, farklı gıda süreçleri ve podosit spesifik belirtecinin ekspresyonunu içeren tipik podosit morfolojisi ile neredeyse sınırsız sayıda in vitro olarak üretilebilir.Podositlere farklılaşmak için hastaya özgü kök hücreleri kullanırken, hücrenin hastalığa özgü değişikliklerini ex vivo olarak incelemek mümkündür. Olguda, ilk deri biyopsisi genetik podosit hastalığı olan bir hastadan alındı. Protokolümüzle üretilen podositler, hastanın mutasyonunu taşıyan kişiselleştirilmiş hastalıklı hücrelerdir.Bu nedenle, bu hücreler podosit hastalıklarını ve potansiyel terapötik maddeleri bireyselleştirilmiş bir yaklaşımla incelemek için geliştirilmiş bir ex vivo modeli temsil eder.

generation-of-patient-derived-podocytes-from-skin-biopsies

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, tanımlanmış kimyasal koşullar altında hücre farklılaşması yoluyla indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden insan böbrek podositlerini türetme protokolünü açıklıyoruz. Üretilen podositler, nefrotoksisite testi ve hastalık modellemesi için kullanılabilir.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Böbrek Podositlerinin Türetilmesi: Olgun Böbrek Podositlerinin Kök Hücrelerden Yönlendirilmiş Farklılaşması İçin Bir Prosedür

Bu makalenin amacı, epidermal keratinositlerden ve devitalize insan dermisinden genetik olarak değiştirilmiş insan organotipik derisinin nasıl oluşturulacağına dair kapsamlı ve ayrıntılı bir protokol sağlamaktır.

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Biz İndüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı lenfositi ve fibroblastlar ayırt etmek ve bir 3B cilt organoid oluşturmak gösterilmiştir bir protokol bu lenfositi ve fibroblastlar kullanarak öneriyoruz. Bu iletişim kuralı insanlaşmış fareler model oluşturma ek bir adım içerir. Burada sunulan teknik dermatolojik araştırma artıracaktır.

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

Burada sunulan, insan böbrek podositlerinin yüksek verimli (%&gt;90) ve genetik manipülasyonlardan veya alt popülasyon seçiminden bağımsız olarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetülmesi için kimyasal olarak tanımlanmış bir protokoldür. Bu protokol 26 gün içinde istenen hücre tipini üretir ve nefrotoksisite testi ve hastalık modellemesi için yararlı olabilir.

Olgun Böbrek Podositlerinin Kimyasal Olarak Tanımlanmış Koşullar Altında İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Rehberli Farklılaşması

Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden farklılaşan genetik olarak eşleşen epitel ve vasküler endotel hücrelerini entegre ederek böbrek glomerüler filtrasyon bariyerinin yapısını ve işlevini özetleyen kişiselleştirilmiş bir çip üzerinde organ sistemi tasarlamak için bir protokol sunulmaktadır. Bu biyomühendislik sistemi, böbrek hassas tıbbını ve ilgili uygulamaları ilerletebilir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Üretilen İzojenik Böbrek Glomerulus Çipi

Belirli doku tiplerinin hücreleri Dissociating doku aggitation için belirli parametreler uygulanabilir kültürlenebilen hücrelerinin yüksek ses elde etmek için gereklidir. Miltenyi gentleMACS Dissociator basit, pratik bir protokol ile bu görevi en iyi hale getirir. Bu yayında, nerual doku bu cihazların kullanımı açıklanmıştır.

Fare Sinir Doku Hücre Tek Cezalar Üretimi

Insan derisi canlı yetişkin epitelyal kök hücreleri izole bir hızlı, sağlam bir şekilde açıklanmıştır. Bu yöntem cilt kollajen matriks enzimatik sindirim, saç folikülleri ve hücre kültürü için, tek bir hücre süspansiyonları ya da doku parçalarının izolasyonu koparma kullanır.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

Onlar pluripotency için standart testleri geçmek bile oluşturuluyor indüklenen pluripotent kök hücre (IPSC) hatları gelişim potansiyeli birbirinden farklı çizgiler üretir. Burada sahip tam olarak pluripotency IPSC hattı tanımlayan iPSCs, tamamen edilen fareler üretmek için bir protokol...

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

Proteinler ya doğal bir yapıyı benimseyebilir ya da çözünmeyen amiloid'e yanlış katlanabilir. Yanlış katlanma yolunu destekleyen koşullar, farklı tipte amiloid fibrillerin oluşumuna yol açar. Burada açıklanan yöntemler, doğal proteinlerin in vitro olarak amiloid'e hızlı bir şekilde dönüştürülmesine izin verir.

İn vitro Yerli Proteinlerden Hızlı Amiloid Üretimi

Burada, biz insana biyolojik özelliklerini özetlemek permisif kültür koşulları altında kasılma myofibers (myospheres) üç boyutlu kümeler oluştururlar iskelet kası atalarıdır, homojen bir nüfusa üreten doğru insan embriyonik kök hücreleri (hESC) epigenetik yeniden programlama dayalı bir protokol açıklar iskelet kasları.

Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Keşfedin, cilt biyopsilerinden hasta kaynaklı podosit üretimi için epizomal yeniden programlama yöntemini. Bu protokol, kişiselleştirilmiş böbrek hastalığı modelleri oluşturarak tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olur.

Cilt Biyopsilerinden Hasta Kaynaklı Podositlerin Üretimi

Daha fazla video keşfet