Name: Çizgi Taramalı Titreşimli Toplam Frekans Oluşturma Mikroskobu Kullanılarak Multimodal Doğrusal Olmayan Hiperspektral Kimyasal Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Öğrenin, titreşimli toplam frekans oluşturma mikroskobu ile çoklu modal hiperspektral görüntüleme yöntemini. Biyolojik dokuların moleküler düzeyde yapısal özelliklerini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Cihaz geliştirme, Grant NSF CHE-1828666 tarafından desteklenmektedir. ZW, JCW ve WX, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü, Hibe 1R35GM138092-01 tarafından desteklenmektedir. BY, Çin Bilimler Akademisi (CAS, 2021183) Gençlik İnovasyonu Teşvik Derneği tarafından desteklenmektedir.

1. Hiperspektral çizgi taramalı VSFG mikroskobu
<ol><li>Lazer sistemi<ol><li>1025 nm ± 5 nm'de ortalanmış darbeli bir lazer sistemi ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın. Lazer, ~290 fs darbe genişliğiyle 40 W, 200 kHz (200 μJ/darbe) olarak ayarlanmıştır. NOT: Tam tekrarlama oranı değişebilir ve yüksek tekrarlama oranlı bir lazer genellikle bu VSFG mikroskobu için daha iyi çalışır.</li>
		<li>Bir orta kızılötesi (MIR) ışını oluşturmak için tohum lazerinin çıkışını ticari bir optik parametrik amplifikatöre (OPA) yönlendirin (bkz. MIR'yi ilgi alanlarının sıklığına göre ayarlayın (Şekil 1A). NOT: Bu çalışmada, MIR 3450 nm ± 85 nm'de (~2900 ± 72 cm-1) ~290 fs darbe süresi ve ~6 μJ darbe enerjisi ile ortalanmıştır, bu da -CHx fonksiyonel grup bölgesinin bir kısmını kapsar.</li>
	</ol></li>
	<li>Yukarı dönüşüm ışını<ol><li>~4.75 cm-1'lik bir FWHM ile spektral olarak daraltılmış bir yukarı dönüşüm ışını üretmek için OPA'dan kalan 1025 nm ışını bir Fabry-Perot etalonundan (Malzeme Tablosuna bakınız) geçirin.</li>
		<li>Daralmış 1025 nm ışını 8 μm safir iğne deliği ile uzamsal olarak filtreleyin. NOT: 1025 nm ışın, bir NIR kartı kullanılarak görselleştirilebilir.</li>
		<li>1025 nm darbenin polarizasyonunu bir λ/2 dalga plakası ile kontrol edin (bkz.</li>
	</ol></li>
	<li>MIR ışını<ol><li>Zamansal örtüşmenin hassas kontrolü için MIR ışınını bir gecikme aşaması boyunca yönlendirin.</li>
		<li>MIR'in polarizasyonunu bir λ/2 dalga plakası ile kontrol edin.</li>
	</ol></li>
	<li>VSFG mikroskobu<ol><li>MIR'ye geçirgen ve NIR'ye yansıtıcı olan özelleştirilmiş bir dikroik aynada (DM, Şekil 1B) hem yukarı dönüşüm hem de MIR ışınlarını uzamsal olarak üst üste bindirin (bkz. Hizalamayı yönlendirmek için iki iris kullanın: biri DM'den hemen sonra, diğeri en uçta. MIR'nin ortalanıp ortalanmadığını belirlemek için iristen sonra bir güç ölçer kullanın ve NIR konumlarını bulmak için bir NIR kartı kullanın. NOT: Örtüşmeden sonra, NIR ışını her iki ışını da yönlendirmek için kullanılabilir.</li>
		<li>Üst üste binen ışınları, entegre bir 325 Hz tek eksenli rezonans ışın tarayıcı (entegre iki konumlu tarayıcıya (I2PS) monte edilmiş, Şekil 1B) ile ters çevrilmiş bir mikroskoba yönlendirin (bkz. NOT: Rezonans tarayıcı, üst üste binen iki ışından oluşan bir çizgiyi kondansatör objektifinin arka açıklığına yansıtır. VSFG/SHG ve parlak alan modaliteleri arasında sorunsuz yeniden yapılandırmayı sağlayan bir kaydırıcıya monte edilmiştir.</li>
		<li>Uzamsal olarak üst üste binen iki ışını, tamamen yansıtıcı bir Schwarzschild objektifi ile numuneye odaklayın (SO, Şekil 1B,D) (bkz.</li>
		<li>Numune tarafından üretilen VSFG sinyalini sonsuz düzeltmeli bir kırılma objektifi ile toplayın (RO, Şekil 1B,D) (bkz.</li>
		<li>Kolimasyonlu çıkış VSFG sinyalini doğrusal bir polarizör ve ardından iki f = 60 mm odak merceğinden (TL1 ve TL2, Şekil 1B,C) oluşan bir telesentrik tüp lens sistemi aracılığıyla yönlendirin (bkz. NOT: Tüp lenslerden gelen büyütülmüş görüntü, monokromatörün giriş yarığında oluşturulur (MC, Şekil 1B,C) ve uzamsal/frekans çözümlü veriler iki boyutlu bir CCD dedektöründe algılanır (CCD, Şekil 1B). </li>
	</ol></li>
	<li>SHG modu<ol><li>SHG görüntülemeye geçmek için, IR ışınını bloke edin ve SHG sinyalini görüntülemek için spektrografın ızgarasını 501.5 nm'ye döndürün.</li>
	</ol></li>
	<li>Parlak alan modu<ol><li>Parlak alan optik görüntülemeye geçmek için beyaz ışık kaynağını açın (bkz. Görüntüleme objektifi (RO) kondansatör ve kondansatör objektifi (SO) görüntüleme objektifi olacak şekilde ters yayılma yönünde parlak alan görüntüleri toplamak için entegre kaydırıcıyı (I2PS, Şekil 1B) hareket ettirin.</li>
		<li>Piyasada bulunan bir tüp lens sistemi kullanarak bir RGB parlak alan kamerasının sensör düzleminde kırılma objektifinin kolimasyonlu çıkışının bir görüntüsünü oluşturun (bkz.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65388/65388fig01.jpg"> Şekil 1: Multimodal hiperspektral VSFG mikroskobu. (Bir) Çekirdek kurulumun üstten görünümü. Ayarlanabilir bir orta IR darbesi oluşturmak için bir OPA'ya 1025 nm'lik bir pompa lazeri gönderildi. Kalan 1025 nm, sıklıkla bir etalon (E) tarafından daraltıldı ve bir uzamsal filtre (SFG) ile uzamsal olarak bir Gauss ışınına filtrelendi. Mid-IR ve 1025 nm ışınlar, özelleştirilmiş bir dikroik aynada (DM) uzamsal olarak üst üste bindirilir ve ters mikroskopta ( A'da kutulu bölge) yönlendirilir. (B) İki ışın, entegre 2 konumlu bir kaydırıcıya (I2PS) monte edilmiş 325 Hz rezonans ışın tarayıcısına gönderilir ve parlak alan ve doğrusal olmayan optik modaliteler arasında sorunsuz geçiş sağlar. Mikroskop platformu, bir kondansatör görevi gören yansıtıcı tabanlı sonsuzluk düzeltmeli bir Schwarzschild objektifi (SO) ve dikey nano konumlandırma (VNP) z ekseni aşamasına monte edilmiş bir kırılma tabanlı sonsuzluk düzeltmeli görüntüleme objektifi (RO) ile donatılmıştır. SO, rezonans ışın tarayıcısının numuneye yansıttığı gelen ışın çizgisine odaklanırken, RO sinyallerin VSFG çizgi bölümünü toplar. Numunenin yüksek kaliteli görüntüleme için en iyi odak durumunda olmasını sağlamak için RO'nun z ekseni konumunu 1 μm hassasiyetle hassas bir şekilde kontrol etmek önemlidir. VSFG sinyalinin kolimasyonlu hattı daha sonra 2 küvet merceğinden (TL1 ve TL2) oluşan bir tüp lens sistemine yönlendirilir ve monokromatörün (MC) giriş yarığında büyütülmüş bir görüntü oluşturur. Frekansla çözülen spektrum çizgisi daha sonra bir şarj bağlantılı cihazda (CCD) hiperspektral olarak görüntülenir. Her bir hiperspektral çizgi toplandıktan sonra, numune, NP kullanılarak rezonans ışın tarayıcı tarama eksenine dik eksende taranır. Örneğin parlak alan görüntülerini toplamak için, I2PS parlak alan konumuna getirilir ve beyaz ışık kaynağını (WLS) yakalayan bir ayna kurulur. Işık daha sonra RO tarafından odaklanır ve SO tarafından görüntülenir. Daha sonra ters çevrilmiş mikroskobun tepesindeki parlak alan kamerasının (BC) sensör düzleminde bir görüntü oluşturulur. (C) Tüp lens alanından MC ve CCD'ye giden optik yolun ayrıntılı görünümü. (D) SO ve RO arasındaki örnek alanın ayrıntılı görünümü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65388/65388fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
2. Hiperspektral mikroskop hizalaması ve dikey CCD ekseni uzamsal kalibrasyonu
<ol><li>15 mm x 15 mm x 0,170 mm ± 0,005 mm lamel kaplanmış standart bir ZnO (1 μm kalınlığında) desen püskürtme numunesi kullanarak numune düzleminin (nano konumlandırıcı z ekseni) konumunu kabaca optimize edin ve parlak alan görüntüleme yöntemini kullanarak parlak alan odağına getirin. NOT: RO'nun z konumunun yanı sıra beyaz ışığın hizalanmasının gerektiği gibi ayarlanması gerekebilir. Hizalama kalibrasyonu için kullanılan cam desen üzerindeki ZnO'nun temsili bir görüntüsü Şekil 2'de gösterilmektedir.</li>
	<li>I2PS'yi doğrusal olmayan aydınlatma koluna geri taşıyın ve CCD kamerada gözlemlenen ZnO bölgeleri tarafından üretilen maksimum rezonanssız VSFG yoğunluğu için örnek yüksekliğini optimize edin. NOT: RO'nun z konumu maksimum yoğunluk için ayarlanmalıdır. Numunenin optimum yüksekliğine ve RO'ya ulaşılmadan önce 2.1 ve 2.2 adımlarının birkaç kez yinelenmesi gerekebilir.</li>
	<li>Rezonans ışın tarayıcısını açın ve görüntülerin bir satırını toplayın.</li>
	<li>Numuneyi ışın tarayıcı yönüne dik olarak tarayarak rezonans olmayan yoğunlukta görüntüler toplayın. Görüntü verilerinin dikey dilimlerini alın ve piksel:mikron oranını belirleyin. ( Şekil 3'e ve açıklamasına bakın). NOT: Bu çizgi bölümlerinin türevi, gelecekteki görüntüler için kullanılacak dikey CCD ekseni piksel:mikron oranını üretmek için analiz edilir.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65388/65388fig02.jpg"> Şekil 2: Bir ZnO modelinin parlak alan görüntüleme modalitesinin kaba hizalaması için temsili görüntü kalitesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65388/65388fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65388/65388fig03.jpg"> Şekil 3: Dikey eksen kalibrasyonu iş akışı. Bu şekil, CCD piksellerinin μm biriminde dikey uzamsal boyutlara nasıl dönüştürüleceğini göstermektedir. (A) ZnO desenli lamel bir görüntü toplanır ve yeniden oluşturulur. Ardından, desenin bir kenarından diğer kenarlarına piksel mesafesi ( A'daki küçük dikey çubuk). ZnO desen çaprazı 25 μm genişliğe sahip olacak şekilde tasarlandığından, fiziksel/piksel boyut oranını hesaplamak için burada fiziksel genişliğin piksel genişliğine oranı kullanılabilir. Temsili, dikey eksen kalibre edilmiş bir görüntü (B)'de gösterilmiştir. (C) Son olarak, kırmızı çizgi ile gösterildiği gibi dikey bir dilim alınır. (D) Uzamsal çözünürlüğü elde etmek için dikey dilimin türevi alınır. Uzamsal çözünürlüğü elde etmek için dikey dilimin türevi kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65388/65388fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
3. Hiperspektral veri toplama
<ol><li>Spektrumları yatay eksen boyunca dağılmış ve uzamsal konumlar CCD'nin dikey ekseninde kaydedilen CCD'deki VSFG sinyallerinin dikey bir çizgisinin spektrumlarını toplayın. NOT: Bu, tek satırlık bir bölüm için iki boyutlu bir veri kümesiyle sonuçlanır.</li>
	<li>Numunenin çizgi kesiti hiperspektral olarak görüntülendikten sonra, üç boyutlu nano konumlandırıcıyı kullanarak çizgi tarama eksenine dik eksende numuneyi tarayın (NP, Şekil 1). NOT: 3D nano konumlandırıcı, numune bölgelerinin (xy düzlemi) konumlandırılmasında ve numunenin odağa getirilmesinde (z ekseni) yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik için önemlidir.</li>
	<li>VSFG hiperspektral görüntüsü toplamak için adım 3.1 ile adım 3.2 arasında yineleyin.</li>
</ol>4. Hiperspektral veri analizi
<ol><li>MatLab görüntüleme araç kutusu hiperspektral görüntüleme kitaplığı iş akışını kullanarak verileri spektral olarak çözün41. NOT: Spektral karıştırma, uzamsal konumları benzersiz spektrumlarla ilişkilendirir. Hiperspektral veri analizi için Matlab kodu Ek Dosya 1'de verilmiştir.<ol><li>Matlab görüntü işleme araç kutusu hiperspektral görüntüleme kitaplığı41'deki hiperküp işlevini kullanarak 4 boyutlu bir hiperküp (x = uzamsal, y = uzamsal, z = frekansa bağlı yoğunluk, ω = frekans) oluşturun.</li>
		<li>Yanlış alarm olasılığı (PFA) değeri 10-7 olan countEndmembersHFC işleviyle benzersiz spektrum sayısını belirleyin.</li>
		<li>nfindr spektral karıştırma işlevini kullanarak benzersiz spektrumları tanımlayın.</li>
		<li>Son olarak, sid işlevini kullanarak, her pikseli önceki adımda tanımlanan benzersiz spektrumlardan biriyle ilişkilendirin. NOT: MatLab Hiperspektral Görüntüleme Kütüphanesi41'de sunulan alternatif fonksiyonlar/algoritmalar ile ek spektral karıştırma ve eşleştirme yöntemleri yapılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>İzole edilmiş her sayfa için toplam verileri Voigt işlevine42 (Ek Dosya 1) sığdırın. NOT: Lorentz fonksiyonu saf homojen çizgi şekli sınırını temsil ederken, Gauss fonksiyonu homojen olmayan sınırlardan kaynaklanır. Gerçekte, sistemler homojen ve homojen olmayan sınırların bir kombinasyonunda olabilir, bu da VSFG dahil olmak üzere yoğunlaştırılmış faz spektroskopisi için yaygın bir uygulama olan bir Voigt işlevi gerektirir.</li>
</ol>5. Numunenin geometrik analizi
<ol><li>Adım 5.2-5.3'te belirtilen prosedürü izleyerek numunelerin geometrisini belirleyin. Bu çalışmada SDS@2 β-CD örnek olarak kullanılmıştır. SDS@2 β-CD mezo-yaprak örneğinin moleküler alt birimininC7 simetrisine dayalı olarak χ(2)'nin simetriye izin verilen tensör elemanlarını türetin. NOT: χ(2)' ye izin verilen simetri simetriye bağlıdır. Herhangi bir simetrinin izin verilen doğrusal olmayan duyarlılığını hesaplamak için referans43'e bakın.</li>
	<li>Laboratuvar çerçevesi ölçümlerini moleküler çerçeveyle ilişkilendirmek için Euler rotasyonunu27 uygulayın. NOT: SDS@2 β-CD durumunda,C7 simetrisi, 8 çıkışla (laboratuvar çerçevesi χ(2)) 8 girişle (6 bağımsız hiperpolarize edilebilirlik β(2) ve iki açı: Θ, tüm tabakaların numune düzlemine göre eğim açısı ve φ, tabakanın düzlem içi dönüşü (Şekil 4)). İki tabakanın ortak moleküler hizalamalarını çıkarmak için iki tabaka kullanılır. φ 1 ve φ2 arasındaki ilişkiler (iki yaprağın düzlem içi dönüş açısı) parlak alan görüntülerinden çıkarılabilir. Geçerli örnekte, φ2 =φ 1 + 60°. Tüm moleküler birimlerin aynı açıda olduğu varsayılır, bu nedenle Θ1 = Θ2. Bu, 11 bilinmeyenle sonuçlanır (9 bağımsız olan, 6 bağımsız hiperpolarize edilebilirlik β(2), Θ 1 ve φ1 ve N tabakaları ileφ 2 ve Θ2 olan iki bağımlı açı arasındaki bağıl kapsama oranı) 16 bilinen için (yaprak başına 8 laboratuvar çerçevesi polarizasyonu ve iki yaprak).</li>
	<li>Polarizasyonla çözülmüş laboratuvar çerçevesi χ(2) ve moleküler çerçeve hiperpolarize edilebilirlik β(2)'yi bir sinir ağı işlev çözücüsü ile ilişkilendirin. NOT: Bu yaklaşımın ayrıntılı bir özeti referans27'de bulunabilir.<ol><li>Python44'te200-100-50 düğüm yapısından ve hiperbolik bir teğet aktivasyon fonksiyonundan oluşan Keras'ı kullanarak katmanlı bir sinir ağı modeli oluşturun.</li>
		<li>β(2), Θ 1, Θ2, φ1, φ 2 ve N değerlerinden oluşan rastgele oluşturulmuş 100000 x 11 matris oluşturun. Euler dönüşleri ile 5.2'de belirlenen denklemi kullanarak karşılık gelen laboratuvar çerçevesi 16 χ(2)'yi hesaplayın.</li>
		<li>Hesaplanan χ(2) değerlerini (toplam 100.000 x 16 değer) girdi olarak kullanın ve 16 χ(2) değeri sağlandığında 11 değeri (β(2), Θ 1, Θ 2, φ1, φ2 ve N) tahmin etmeyi öğrenin.</li>
		<li>Eğitildikten sonra, eğitilen modeli test etmek için hem giriş hem de çıkışlarla birlikte başka bir 1000 giriş kümesi kullanın. Tahmin edilen çıktı ve gerçek çıktı, eğimi 1 olan doğrusal bir ilişki göstermelidir.</li>
		<li>Son olarak, deneysel olarak ölçülen χ(2)'yi iki sayfadan sağlayın (her sayfada 8 χ(2 ) ölçülmüştür) ve diğer özelliklerle birlikte eğim açısını Θ tahmin etmek için eğitilmiş modeli kullanın.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65388/65388fig04.jpg"> Şekil 4: Euler dönüşümünün gösterimi. (A) Laboratuvar koordinatları (XYZ) ikinci dereceden duyarlılık χ(2) ve moleküler koordinatlar (xyz) hiperpolarize edilebilirlikβ ijk arasındaki Euler dönüşümünün gösterimi. z-y'-z'' Euler dönüşü, düzlem içi dönüş açısı olarak φ, eğim açısı olarak θ ve büküm açısı olarak ψ olmak üzere moleküler koordinatlarda gerçekleştirilir. ψ, moleküler eksen etrafında rastgele bükülme açıları için entegre edilmiştir. φ entegre değildir, çünkü tüm moleküller kendi kendine monte edilmiş tabakaları oluşturmak için laboratuvar çerçevesine göre belirli bir açıda döner. N, iki yaprağın nispi yüzey kaplamasıdır. (B) Sinir ağı sonuçları tarafından belirlenen bir tabaka oluşturan eğik alt birimlerin görselleştirilmesi. Bu rakam Wagner ve ark.27'den değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65388/65388fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Multimodal, Hızlı, Hiperspektral Kimyasal Analiz için VSFG Mikroskobu Kullanma

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

En kritik adımlar 1.42 ile 1.44 arasındadır. Optik uzamsal çözünürlük için objektif merceği iyi hizalamak çok önemlidir. Yayılan sinyalin toplanması, iletilmesi ve tarama ışınının giriş yarıklarında bir çizgi olarak yansıtılması da önemlidir. Doğru hizalamalar, en iyi çözünürlüğü ve sinyal-gürültü oranını garanti eder. SDS@2 β-CD 100 μm x 100 μm yaprak gibi tipik bir örnek için, yüksek sinyal-gürültü oranına sahip iyi çözünürlüklü bir görüntü (~1 μm çözünürlük) 20 dakika sürer. Bu,24,26...

İkinci dereceden doğrusal olmayan bir optik teknikolan titreşimsel toplam frekans üretimi (VSFG) 1,2, simetriye izin verilen numuneleri kimyasal olarak profillemek için bir spektroskopi aracı olarak yaygın bir şekilde kullanılmıştır 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Geleneksel olarak, VSFG, VSFG aktivitesi için bir gereklilik olan ters çevirme simetrisinden yoksunolan arayüzey sistemleri 8,9,10,11'e (yani gaz-sıvı, sıvı-sıvı, gaz-katı, katı-sıvı) uygulanmıştır. VSFG'nin bu uygulaması, gömülü arayüzlerin 12,13, arayüzlerde su moleküllerinin konfigürasyonları, 14,15,16,17,18 arayüzlerinde ve 19,20,21,22 arayüzlerinde kimyasal türlerin çok sayıda moleküler detayını sağlamıştır.
VSFG, arayüzlerdeki moleküler türleri ve konfigürasyonları belirlemede güçlü olmasına rağmen, inversiyon merkezleri olmayan malzemelerin moleküler yapılarını ölçme potansiyeli yerine getirilmemiştir. Bunun nedeni kısmen, malzemelerin kimyasal ortamlarında, bileşimlerinde ve geometrik düzenlemelerinde heterojen olabilmesi ve geleneksel bir VSFG spektrometresinin 100μm2 mertebesinde geniş bir aydınlatma alanına sahip olmasıdır. Bu nedenle, geleneksel VSFG spektroskopisi, tipik bir 100μm2 aydınlatma alanı üzerinden numunenin topluluk ortalaması alınmış bilgileri hakkında rapor verir. Bu topluluk ortalaması, zıt yönelimlere sahip iyi düzenlenmiş alanlar arasında sinyal iptallerine ve yerel heterojenliklerin yanlış karakterizasyonuna yol açabilir 15,20,23,24.
Neredeyse renk sapmalarından arınmış olan yüksek sayısal açıklık (NA), yansıtıcı tabanlı mikroskop objektiflerindeki (Schwarzschild ve Cassegrain geometrileri) ilerlemelerle, VSFG deneylerinde iki ışının odak boyutu 100 μm 2'den 1-2 μm2'ye ve bazı durumlarda mikron 25'in altına düşürülebilir. Bu teknolojik ilerlemeyi de içeren grubumuz ve diğerleri, VSFG'yi 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36 mikroskopi platformuna dönüştürdü. Son zamanlarda, çok modlu görüntülerin (VSFG, ikinci harmonik üretim (SHG) ve parlak alan optik) sorunsuz bir şekilde toplanmasını sağlayan ters çevrilmiş bir optik düzen ve geniş bant algılama şeması37 uyguladık. Çok modaliteli görüntüleme, optik görüntüleme kullanarak numunelerin hızlı bir şekilde incelenmesine, çeşitli görüntü türlerinin birbiriyle ilişkilendirilmesine ve numune görüntülerindeki sinyal konumlarının bulunmasına olanak tanır. Akromatik aydınlatma optikleri ve darbeli lazer aydınlatma kaynağı seçimi ile bu optik platform, diğerlerinin yanı sıra Floresan mikroskobu38 ve Raman mikroskobu gibi ek tekniklerin gelecekte sorunsuz entegrasyonuna olanak tanır.
Bu yeni düzenlemede, hiyerarşik organizasyonlar ve bir moleküler kendi kendine montaj sınıfı (MSA'lar) gibi örnekler incelenmiştir. Bu malzemeler, hem kimyasal bileşimin hem de geometrik organizasyonun malzemenin nihai işlevi için önemli olduğu kolajen ve biyomimetikleri içerir. VSFG ikinci dereceden doğrusal olmayan bir optik sinyal olduğundan, moleküller arası mesafe veya bükülme açıları gibi moleküller arası düzenlemelere39,40 özellikle duyarlıdır, bu da onu hem kimyasal bileşimleri hem de moleküler düzenlemeleri ortaya çıkarmak için ideal bir araç haline getirir. Bu çalışma, bir optik parametrik amplifikatörü (OPA) pompalayan iterbiyum katkılı boşluklu katı hal lazeri, ev yapımı çok modlu ters çevrilmiş mikroskop ve iki boyutlu yüklü birleştirilmiş cihaz (CCD) dedektörüne bağlı monokromatör frekans analizöründen oluşan çekirdek cihazın VSFG, SHG ve parlak alan modalitelerini açıklamaktadır27. Adım adım yapım ve hizalama prosedürleri ve kurulumun tam bir parça listesi sağlanır. Temel moleküler alt birimi, bir molekül sodyum-dodesil sülfat (SDS), ortak bir yüzey aktif madde ve iki molekül β-siklodekstrin (β-CD) içeren bir MSA'nın derinlemesine analizi, burada SDS@2 β-CD olarak bilinen, VSFG'nin organize maddenin moleküle özgü geometrik ayrıntılarını nasıl ortaya çıkarabileceğini göstermek için bir örnek olarak verilmiştir. MSA'nın kimyasala özgü geometrik detaylarının bir sinir ağı fonksiyon çözücü yaklaşımı ile belirlenebileceği de gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>1x Kamera Por</td><td>Thorlabs</td><td>WFA4100</td><td>bir kamerayı bir mikroskoba veya optik sisteme bağlamak</td></tr><tr><td>25,0 mm Dik Açılı Prizma Ayna, Korumalı Altın</td><td>Thorlabs</td><td>MRA25-M01</td><td>ışığı yansıtır ve geri yansıma üreterek ışığı orijinal yolu boyunca geri yönlendirir</td></tr><tr><td>3" Üniversal Direk Tutucu-5'li Paket</td><td>Thorlabs</td><td>UPH3-P5</td><td></td>,</tr><tr><td>30 mm ila 60 mm Kafes Plakası, 4 mm Kalınlık</td><td>Thorlabs</td><td>LCP4S</td>, <td>30 mm kafes sistemi ile 60 mm kafes sistemi arasında dönüşüm sağlar</td></tr><tr><td>Epi Kollu 500 mm Boyunda Cerna Gövdesi</td><td>Thorlabs</td><td>CEA1500</td>, <td>mikroskopide</td></tr> <tr><td>en iyi aydınlatma tekniklerini etkinleştirme işlevini sağlar60 mm kafese monte & 50,0 mm Iris</td><td>Thorlabs</td><td>LCP50S,</td><td>bir optik sistemden geçen ışık miktarını kontrol</td></tr> eder <tr><td>60 mm Kafes Montaj Braketi</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01B</td>, <td>optik kurulumlarda 60 mm'lik bir kafes sistemini monte eder ve</td></tr><tr><td>konumlandırır Hava aralıklı Etalon</td><td>SLS Optics Ltd.</td><td>Özelleştirilmiş</td><td>dar bant 1030 nm ışık üretin&nbsp;</td></tr><tr><td>Kafes Plakası Montaj Braketi</td><td>Thorlabs</td><td>KCB2</td><td>aynaları hassas bir açıda tutar ve ayarlar</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Andor Technologies</td><td>Newton&nbsp;</td><td>Frekans ve uzamsal çözünürlük için 2D CCD</td></tr><tr><td>Doğrusal Optik Parametrik Amplifikatör</td><td>Işık Dönüşümü</td><td>Orpheus-One-HP</td><td>Ayarlanabilir MID ışık jeneratörü</td></tr><tr><td>Bakır Klorür</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A16064.30</td><td>Kendi kendine montaj bileşeni</td></tr><tr><td>Özelleştirilmiş Dikroik Ayna</td><td>Newport</td><td>Özelleştirilmiş</td>, <td>dalga boyuna veya polarizasyonuna göre ışığı seçici olarak yansıtır veya iletir</td></tr><tr><td>Ext - M32 Int Adaptör</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A34</td><td>, farklı diş tiplerine sahip bileşenler arasında uyumluluk sağlar ve bağlantıyı kolaylaştırır</td></tr><tr><td>Infinity Düzeltmeli Kırılma Objektifi</td><td>Zeiss</td><td>420150-9900-000</td><td>Kırılma Objektifi</td></tr><tr><td>Infinity Düzeltmeli Schwarzschild Objektif Pike</td><td>Technologies Inc.</td><td>891-0007</td><td>Yansıtıcı objektif</td></tr><tr><td>Lazer</td><td>Karbür, Işık Dönüşümü</td><td>C18212</td><td>Lazer kaynağı</td></tr><tr><td>M32x0.75 Dahili RMS Thorlabs'a Harici</td><td></td><td>M32RMSS</td><td>diş açma boyutunu veya mikroskop objektiflerinin türünü uyarlamak veya dönüştürmek&nbsp;</td></tr><tr><td>M32x0.75 M27x0.75 İç Gravür</td><td>Thorlabs</td><td>M32M27S</td><td>diş açma boyutunu veya mikroskop tipi hedeflerini uyarlar veya dönüştürür&nbsp;</td></tr><tr><td>Manuel Orta Yükseklikte Kondenser Odak Modülü</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>ZFM1030 bir optik elemanın odağını ayarlar</td></tr><tr><td>Monokromatör</td><td>Andor Teknolojileri</td><td>Shamrock 500i</td><td>Her satır taraması için frekans çözünürlüğü sağlar</td></tr><tr><td>Kenara Monte Kollar için 1" Hareketli Motorlu Modül</td><td>Thorlabs</td><td>,</td><td>görüntüleme objektifinin dikey konumunu kontrol</td>ZFM2020</tr><tr><td>Nanopositioner</td><td>Mad Şehir Laboratuvarları A.Ş.</td><td>MMP3</td><td>3D örnek sahne</td></tr><tr><td>Rezonans Tarayıcı</td><td>EOPC</td><td>SC-25</td><td>325Hz rezonans ışın tarayıcı</td></tr><tr><td>RGB Renkli CCD Kamera</td><td>Thorlabs</td><td>DCU224C</td><td>Brightfield kamera, üretilmiyor ancak diğer kameralar da aynı şekilde çalışacak</td></tr><tr><td>RGB tüp lens</td><td>Thorlabs</td><td>ITL200</td><td>beyaz ışık toplama</td></tr><tr><td>Dik Açı Kinematik Breadboard</td><td>Thorlabs</td><td>OPX2400</td><td>İki sabit konumlu kayar bir mekanizma içerir</td></tr><tr><td>Dik Açılı Kinematik Ayna Montajı, 30 mm</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>aynaları hassas bir açıda tutar ve ayarlar</td></tr><tr><td>Dik Açılı Kinematik Ayna Montajı, 60 mm</td><td>Thorlabs</td><td>KCB2</td><td>aynaları hassas bir açıda tutar ve ayarlar</td></tr><tr><td>SM2, Cerna Odaklama Aşaması için 60 mm Kafes Kolu</td><td>Kondansatörleri</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>güvenli bir şekilde monte etmek ve konumlandırmak için Thorlabs CSA210060 mm Kafes için Kafes Kapağı, 24 inç Uzunluğunda,</td> <td>Thorlabs</td><td>C60L24</td>, <td>kafesin içindeki bileşenleri çevreler ve korur</td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>J63394. AK</td><td>Kendinden montaj bileşeni</td></tr><tr><td>1" Cerna Seyahat Aşamaları için Üç Parçalı Kontrol Cihazı ve Topuz Kutusu</td><td>Thorlabs</td><td>MCM3001</td><td>kontrol ZFM2020</td></tr><tr><td>Tüp lens</td><td>Thorlabs</td><td>LA1380-AB - N-BK7</td><td>SFG sinyal toplama</td></tr><tr><td>Görünür LED Seti</td><td>Thorlabs</td><td>WFA1010</td><td>görüntüleme kurulumunda aydınlatma sağlar</td></tr><tr><td>Beyaz Işık Kaynağı</td><td>Thorlabs</td><td>WFA1010</td><td>Parlak alan görüntüleme için beyaz ışık aydınlatma kaynağı</td></tr><tr><td>WPH05M-1030 - &Oslash; 1/2 "sıfır dereceli yarım dalga plakası, & oslash; 1" Montaj, 1030 nm&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>WPH05M-1030</td>, <td>içinden geçen ışığın polarizasyon durumunu değiştirir</td></tr><tr><td>WPLQ05M-3500 - &Oslash; 1/2 "Montajlı Düşük Dereceli Çeyrek Dalga Plakası, 3.5 & m&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>WPLQ05M-3500</td>, <td>içinden geçen ışığın polarizasyon durumunu değiştirir</td></tr><tr><td>X ekseni Uzun Hareket Mesafesi Çelik Uzatılmış Kontak Kızak Aşamaları</td><td>Optosigma</td><td>TSD-65122CUU</td><td>yatay (X) yönde uzatılmış hareket sunan konumlandırma aşamaları</td></tr><tr><td>XT95 4in Raylı Taşıyıcı</td><td>Thorlabs</td><td>XT95RC4</td><td>optik bileşenleri monte edin ve konumlandırın</td></tr><tr><td>XY Ekseni Öteleme Aşaması, 360 derece Döndürme</td> <td>ileThorlabs</td><td>XYR1</td>, <td>nesnelerin iki boyutta hassas hareketi ve konumlandırılması, platformu döndürme yeteneği ile birlikte</td></tr><tr><td>XY (1/2 ") Merkezi SM1 Delikten Doğrusal Çevirmen</td><td>Thorlabs</td><td>XYT1</td>, <td>iki boyutta hassas hareket ve konumlandırma sağlar</td></tr><tr><td>Yb katkılı Katı Hal Lazer</td><td>Işık Dönüşümü</td><td>CB3-40W</td><td>Tohum lazer</td></tr> <tr><td>ve beta;-Siklodekstrin</td><td>Termo Fischer Scientific</td><td>J63161.22</td><td>Kendi kendine montaj bileşeni</td></tr></tbody></table>

Çizgi taramalı titreşimli toplam frekans oluşturma mikroskobu kullanılarak multimodal doğrusal olmayan hiperspektral kimyasal görüntüleme

Multimodal Nonlinear Hyperspectral Chemical Imaging Using Line-Scanning Vibrational Sum-Frequency Generation Microscopy

İkinci dereceden doğrusal olmayan bir optik sinyal olan titreşimsel toplam frekans üretimi (VSFG), geleneksel olarak ~100 μm uzamsal çözünürlüğe sahip bir spektroskopi tekniği olarak arayüzlerdeki molekülleri incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, spektroskopi bir numunenin heterojenliğine duyarlı değildir. Mezoskopik olarak heterojen örnekleri incelemek için, diğerleriyle birlikte, VSFG spektroskopisinin çözünürlük sınırını ~ 1 μm seviyesine kadar zorladık ve VSFG mikroskobunu oluşturduk. Bu görüntüleme tekniği, yalnızca görüntüleme yoluyla örnek morfolojileri çözmekle kalmaz, aynı zamanda görüntülerin her pikselinde geniş bantlı bir VSFG spektrumu kaydeder. İkinci dereceden doğrusal olmayan bir optik teknik olan seçim kuralı, diğerlerinin yanı sıra biyoloji, malzeme bilimi ve biyomühendislikte yaygın olarak bulunan sentrosimetrik olmayan veya kiral kendinden montajlı yapıların görselleştirilmesini sağlar. Bu makalede, izleyiciler, sabitlenmemiş örneklerin görüntülenmesine izin veren ters çevrilmiş bir iletim tasarımı aracılığıyla yönlendirilecektir. Bu çalışma aynı zamanda VSFG mikroskobunun kendi kendine monte edilmiş tabakaların kimyasala özgü geometrik bilgilerini, bir sinir ağı fonksiyon çözücüsü ile birleştirerek çözebileceğini göstermektedir. Son olarak, çeşitli örneklerin parlak alan, SHG ve VSFG konfigürasyonları altında elde edilen görüntüler, VSFG görüntülemenin ortaya çıkardığı benzersiz bilgileri kısaca tartışmaktadır.

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65388/65388fig05.jpg"> Şekil 5: SDS@β-CD'nin moleküler yapısı, morfolojisi ve potansiyel oryantasyonu. (A) SDS@β-CD'nin üstten görünüş ve (B) yandan görünüş kimyasal yapısı. (C) Numune düzlemi üzerinde orta ölçekli tabakaların temsili heterojen numune dağılımı. Moleküler alt birim, substrat üzerinde bilinmeyen farklı yöne...

Geniş bantlı titreşimsel toplam frekans üretimi (VSFG) görüntülerinin yanı sıra parlak alan, ikinci harmonik üretim (SHG) görüntüleme modaliteleri elde etmek için çok modlu, hızlı bir hiperspektral görüntüleme çerçevesi geliştirilmiştir. Kızılötesi frekansın moleküler titreşimlerle rezonans olması nedeniyle, simetriye izin verilen numunelerin mikroskobik yapısal ve mezoskopik morfoloji bilgisi ortaya çıkar.

Çizgi Taramalı Titreşimli Toplam Frekans Oluşturma Mikroskobu Kullanılarak Multimodal Doğrusal Olmayan Hiperspektral Kimyasal Görüntüleme

Vibrational sum-frequency generation (VSFG), a second-order nonlinear optical signal, has traditionally been used to study molecules at interfaces as a ...

Biyolojik dokular gibi mezoskopik olarak heterojen kendi kendine monte edilmiş numuneleri, kimyasal bileşimlerini ve moleküler düzenlemelerini ortaya çıkarmak için incelemeyi amaçlıyoruz. Bu öz malzemelerin mikroskobik düzeninin ve mezoskopik morfolojisinin mikroskobik özellikleriyle nasıl ilişkili olduğunu araştırıyoruz. Yüksek sayısal açıklık ve yansıtıcı tabanlı mikroskop hedeflerindeki ilerlemelerle, biz ve diğerleri, aynı anda yumuşak malzemelerin görüntülerini kaydedebilen ve aynı zamanda spektrali uzamsal olarak çözebilen, hiperspektral görüntüleri oluşturan, bir kare mikron çözünürlüğe sahip titreşimsel toplam frekans üretim mikroskobu gösterdik.Hiperspektral görüntüleme, deneysel verileri çok boyutlu, ikisi uzayda, biri frekansta ve muhtemelen bir zaman içinde kaydeder. Bununla birlikte, bilgiyi en üst düzeye çıkarmak için bu tür büyük verilerin hızlı bir şekilde toplanması, depolanması ve analizi bir zorluk olmaya devam etmektedir. Görüntüyü yalnızca yararlı veri noktaları toplamak için örneklemek de zordur.Daha hızlı bir çizgi tarama teknolojisi geliştirerek, veri toplama süresini 100 kat hızlandırabildik. Ayrıca mikroskop, toplam frekans üretimi veya SFG, ikinci harmoni

multimodal-nonlinear-hyperspectral-chemical-imaging-using-line

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Spektral görüntüleme, birden fazla floresan sinyalin tek bir örnekte tanımlanması ve ayrılması için güvenilir bir çözüm haline gelmiştir ve ilgi sinyallerini arka plandan veya otofloresanstan kolayca ayırt edebilir. Uyarma-tarama hiperspektral görüntüleme aynı anda sinyal-gürültü oranını artırırken gerekli görüntü edinme süresini azaltarak bu tekniği geliştirir.

Floresan Sinyallerini Etkin Bir Şekilde Ayırt Etmek Için Uyarma-Tarama hiperspektral görüntüleme mikroskobu

Bu yazıda, SRS deneysel kurma işleminin lazer tarama mikroskobu ile entegrasyonu ile elde edilen, stimüle edilen Raman saçılma (SRS) mikroskobu uygulaması açıklanmıştır. SRS mikroskobu iki femtosaniye (FS) lazer kaynakları, bir TI-safir (TI: sa) ve senkronize optik parametrik osilör (OPO) dayanmaktadır.

Stimululated Raman saçılma dayalı doğrusal olmayan mikroskop uygulanması

Bu makalede, altın nanopartiküllerin ve kanser hücrelerinin hızlı hiperspektral görüntülenmesini sağlayan spektral odaklama modülü ve çift çıkışlı darbe lazerinin entegrasyonu sunulmaktadır. Bu çalışma, multimodal doğrusal olmayan optik tekniklerin ayrıntılarını standart bir lazer tarama mikroskobu üzerinde göstermeyi amaçlamaktadır.

Multimodal Doğrusal Olmayan Optik Mikroskopi Kullanılarak Nanopartiküllerin Hücresel Alımının Biyomoleküler Görüntülenmesi

Bu makale, aynı mikroskop platformuna entegre edilmiş uyarılmış Raman saçılmasının (SRS) ve tutarlı anti-Stokes Raman saçılmasının (CARS) çözünürlüğünü, hassasiyetini ve görüntüleme kontrastlarını doğrudan karşılaştırmaktadır. Sonuçlar, CARS'ın daha iyi bir uzamsal çözünürlüğe sahip olduğunu, SRS'nin daha iyi kontrastlar ve spektral çözünürlük sağladığını ve her iki yöntemin de benzer hassasiyete sahip olduğunu göstermektedir.

Kimyasal Görüntüleme için Hiperspektral Uyarılmış Raman Saçılması ve Tutarlı Anti-Stokes Raman Saçılma Mikroskobunun Doğrudan Karşılaştırılması

Geniş bant uyarılmış Raman saçılma (SRS) mikroskobu ile kimyasal görüntüler elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Diferansiyel çok kanallı kilitleme tespiti ile çalışan bir SRS mikroskobuna dayanan protokol, numune hazırlamayı, SRS cihazının ayarlanmasını ve kimyasal olarak heterojen numunelerin farklı bileşenlerini çözmek için kemometriyi açıklar.

Geniş Bant Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskobuna Dayalı Multipleks Kimyasal Görüntüleme

Etiketsiz optik görüntüleme modalitelerini birleştiren çok modlu bir platform kullanarak, hücresel dinamikleri ve metabolizmayı görselleştirmek ve ölçmek için bir protokol geliştirdik. Çoklu foton floresansı, ikinci harmonik üretimi ve uyarılmış Raman saçılma mikroskobu yoluyla görüntüleme yoluyla, hücresel ve moleküler çevreye bütünsel bir genel bakış oluşturabiliriz.

Hücresel metabolizmayı incelemek için multimodal optik görüntüleme platformu

Kompakt ve ultra stabil bir çift kırma interferometresine dayanan geniş alanlı Fourier dönüşümlü mikroskobu, 2D dedektörün tüm pikselleri için paralel spektrum elde edilmesini sağlar. Zaman alanı yaklaşımı, fotolüminesans ve Raman sinyallerinin çözülmesini sağlar ve ~1-μm uzaysal ve 23-cm-1 spektral çözünürlükle hızlı Raman eşlemesi (~5 ms/piksel) sağlar.

Multimodal Geniş Alanlı Fourier Dönüşümlü Raman Mikroskobu

Bu protokol, lazer ışık kaynağının nasıl oluşturulacağı, bir doku örneğinin nasıl hazırlanacağı, görüntüleme yapılacağı ve verilerin nasıl analiz edileceğine ilişkin ayrıntılar da dahil olmak üzere Eşzamanlı Etiketsiz Otofloresan Çoklu Harmonik (SLAM) mikroskobik teknik için adım adım bir kılavuz sunar. SLAM, doku mikro ortamını araştırmak için dört tamamlayıcı etiketsiz kontrastı ölçerek doğrusal olmayan mikroskobu geliştirir.

Eş Zamanlı Etiketsiz Otofloresan Çoklu Harmonik Mikroskopi

Radikal tabanlı biomimetic kimya biyolojik gelişimi için gerekli bina-up kütüphaneler uygulanmıştır.

Kimyasal Biyoloji Serbest Radikaller: Kimyasal Davranış den Biyomarker Kalkınma

Bir Nile Red boyama prosedürü kullanılarak alg hücrelerinin nötral lipid içeriğini belirlemek için basit bir protokol tarif edilmektedir. Bu zaman tasarrufu tekniği geleneksel gravimetrik esaslı lipid miktar protokoller için bir alternatif sunuyor. Bu izleme biyoproses performansı belirli bir uygulama için tasarlanmıştır.

Floresan kullanma Alg hücrelerinde nötral Lipidler Ölçüm Basit ve Hızlı Protokolü

Öğrenin, titreşimli toplam frekans oluşturma mikroskobu ile çoklu modal hiperspektral görüntüleme yöntemini. Biyolojik dokuların moleküler düzeyde yapısal özelliklerini incelemek için kullanılır.

Çizgi Taramalı Titreşimli Toplam Frekans Oluşturma Mikroskobu Kullanılarak Multimodal Doğrusal Olmayan Hiperspektral Kimyasal Görüntüleme (Video) | JoVE Journal

Çizgi Taramalı Titreşimli Toplam Frekans Oluşturma Mikroskobu Kullanılarak Multimodal Doğrusal Olmayan Hiperspektral Kimyasal Görüntüleme

Daha fazla video keşfet