Name: Niş ve Kök Hücre Sessizliğini Özetlemek için Fare İskelet Kasının Fraksiyone Edilmemiş Toplu Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Keşfedin fare iskelet kasının fraksiyone edilmemiş toplu kültür protokolünü, uydu hücrelerinin niş ortamını ve sessizliğini incelemek için. Bu yöntem, kas biyolojisi ve rejeneratif tıp araştırmalarında yeni tedavi stratejileri geliştirmeye katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Şekil 2 için Servier Medical Art (https://smart.servier.com/) şablonlarından yararlanılmıştır. FR laboratuvarı, Association Française contre les Myopathies - AFM via TRANSLAMUSCLE (19507 ve 22946 hibeleri), Fondation pour la Recherche Médicale - FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), Agence Nationale pour la Recherche - ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) ve La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130) tarafından desteklenmektedir. Yukarıdaki fon sağlayıcıların bu çalışmanın tasarımında, toplanmasında, analizinde, yorumlanmasında veya raporlanmasında veya bu makalenin yazılmasında hiçbir rolü yoktu.

Tüm deneyler, Institut Mondor de Recherche Biomédicale'deki (INSERM U955) Fransız ve AB hayvan yönetmeliklerine, özellikle de 2010/63/UE direktifine uygundur. Hayvanlar, A94 028 379 ve D94-028-028 sertifika numaralı hayvan tesislerinde kontrollü ve zenginleştirilmiş bir ortamda tutuldu; Sadece yetkili araştırmacılar ve hayvan bakıcıları tarafından ele alındılar ve yaşamları boyunca rahatsızlık belirtileri için hayvan barınağı personeli tarafından görsel olarak incelendiler. Diseksiyon öncesi servikal çıkık ile ötenazi yapıldı. Hayvanların yaşamları boyunca hiçbir girişimsel işlem yapılmamıştır; bu nedenle, prosedür için bir Etik Komite ve Fransa Yüksek Öğrenim, Araştırma ve Yenilik Bakanlığı'ndan onay almak gerekli değildi. Gerçekten de, 2010/63/UE direktifine göre ötenazi ve ölüm sonrası diseksiyon için herhangi bir etik izni gerekli değildir. Bu yazıda sunulan sonuçlar, vahşi tip C57BL/6NRj hattından (Malzeme Tablosuna bakınız) ve transgenik Tg:Pax7-nGFP hattı12'den (ekibimiz tarafından yetiştirilmiştir) alınmıştır. Protokol, 8-12 haftalık erkek ve dişi farelere uygulandı.
1. Reaktif ve ekipman hazırlama ön sindirimi
<ol><li>Diseksiyon aletlerine (düz ve kavisli makaslar, forseps, Malzeme Tablosuna bakınız) p etanol püskürtün ve kağıtla kurulayın. Bir mantar plakayı alüminyum folyo ile kaplayın ve yakınınızda 10 cm'lik Petri kapları (hayvan başına bir tane) bulundurun. Elinizin altında kağıt ve p etanol bulundurun. NOT: Diseksiyon sonunda diseksiyon aletlerini suyla durulayın, ardından p etanol püskürtün ve kağıtla kurulayın.</li>
	<li>Dönen bir su banyosunu 37 °C'ye ayarlayın ve DMEM'i %1 penisilin-streptomisin, 0,5 U/mL kollajenaz, 3 U/mL dispas ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 50 mL tüp(ler)de %0,2 BSA ile birleştirerek sindirim karışımını (20 mL/hayvan) hazırlayın.</li>
	<li>Sindirim karışımını bir hücre kültürü davlumbazındaki 0.22 μm'lik bir filtreden geçirin. NOT: Sindirim karışımının her seferinde taze olarak hazırlanması tavsiye edilir.</li>
</ol>2. Sindirim sonrası reaktif ve ekipman hazırlama
<ol><li>Sindirim sonrası, karışım dondurulabilir veya kültürlenebilir. Dondurmak için,% 10 DMSO:% 90 fetal sığır serumu (FBS) ve ayrıca bir dizi kriyotüp (2 mL kriyotüp başına 1 mL hücre süspansiyonu) hazırlayın. Kültür için kültür ortamı (% 1 penisilin-streptomisin, 4 ng / mL bFGF ve% 20 FBS ile desteklenmiş DMEM) ve bir dizi 8 oyuklu plaka hazırlayın. Hücreler kaplanmadan önce plakalar kaplanmalıdır (ayrıntılar adım 7.1'de verilmiştir).</li>
	<li>Boyama için, fosfat tamponlu salin (PBS) (8 oyuklu plakanın 0.15 mL / oyuğu) ve bloke edici çözelti (PBS'de% 5 IgG içermeyen sığır serum albümini [BSA]; 0.15 mL / kuyucuk 8 oyuklu plaka). DİKKAT: PFA tozunu solumayın; Kimyasal bir başlık altında hazırlayın ve kullanın.</li>
</ol>3. Diseksiyon
<ol><li>Ötenazi yapılan hayvana% 70 etanol püskürtün. Karın hizasında büyük bir makasla yatay bir kesi (vücudun sol tarafından sağ tarafa) yapın ve bel çevresini kesin. Kasları ortaya çıkarmak için arka ayaklardaki deriyi çekin (Şekil 1A).</li>
	<li>Hayvanı alüminyum folyo kaplı mantar plakaya yerleştirin ve karşı ön ayağı ve arka ayağı sabitleyin. Tüm arka bacak kaslarını (ön ve arka) buz üzerine yerleştirilmiş 10 cm'lik bir Petri kabına hızla çıkarın (Şekil 1B,C). Kuadriseps ve arka kasların etrafındaki alanlardan yağ dokusunu çıkarmak için özel dikkat gösterin. Fasya, sinirler ve tendonlar da diseksiyon için harcanan toplam süreyi tehlikeye atmıyorsa bu noktada çıkarılabilir. NOT: Her iki arka bacak için optimal diseksiyon süresi yaklaşık 15-20 dakika olmalıdır. Diseksiyon süresinin 30 dakikayı geçmemesi tavsiye edilir.</li>
	<li>Nemli kalmaları için ara sıra kaslara DMEM damlaları ekleyin, ancak çok fazla değil, çünkü bu doğramayı zorlaştıracaktır. Diğer arka bacak için tekrarlayın. Bir hayvanın tüm kasları Petri kabına girdikten sonra (Şekil 1D), pürüzsüz bir homojenat elde etmek için 7-10 dakika makasla ince ince doğrayın (Şekil 1E). NOT: Bu protokolde L-glutamin, piruvat ve 4.5 g/L D-glikoz ile desteklenmiş DMEM kullanılır.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65433/65433fig01.jpg"> Şekil 1: Kültür öncesi kas hazırlığı. (A) Adım 3.1'de açıklandığı gibi arka bacak kaslarını ortaya çıkarmak için deri çıkarılır. (B,C) Tüm arka bacak kasları, adım 3.2'de açıklandığı gibi kemiklerin etrafında (B) ve (C) kemikler arasında toplanır. (D) Hasat edilen kaslar, adım 3.3'te açıklandığı gibi, nemli kalmaları için DMEM damlaları ile buz üzerinde 10 cm'lik bir Petri kabına yerleştirilir. (E) Kaslar, bu resimde gösterilen kıvamda pürüzsüz bir macun elde edilene kadar makasla ince ince doğranır. (F) Son santrifüjlemeden sonra peletin bir görüntüsü; Mavi ok, kesikli mavi çizginin altında tüpe karşı olan peleti vurgular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65433/65433fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
4. Sindirim
NOT: Çürütmenin sonunda, bölüm 5 için 4 °C'de bir santrifüj, bir kova buz, üç hücre süzgeci (100 um, 70 um, 40 um) ve üç adet 50 mL tüp (hayvan başına) gereklidir.
<ol><li>Sindirim karışımını adım 1.2'de açıklandığı gibi hazırlayın ve süzün. Karışımı buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Tüm kaslar doğrandıktan sonra, homojenatı 20 mL sindirim karışımı ile 50 mL'lik bir tüpe koyun. Sızıntıyı önlemek için kapağın kenarlarını esnek bir filmle sarın ve tüpü düşük ila orta hızda (50 rpm) 37 °C çalkalama suyu banyosuna yerleştirin.</li>
	<li>37 °C'de 1 saat bekledikten sonra kapağı açın ve homojen bir karışım elde etmek için 10 mL'lik bir pipetle yukarı ve aşağı yedi kez hafifçe pipetleyerek karıştırın. Kapağın etrafına yeni film uygulayın ve çalkalama suyu banyosuna geri yerleştirin. 1 saat sonra tüpü çıkarın ve banyoyu kapatın. NOT: Kültür için, bölüm 7.1'e geçmeden önce plakaları adım 5'de açıklandığı gibi kaplamak için bu inkübasyon süresini kullanın.</li>
</ol>5. Filtrasyon
<ol><li>Sindirim tüpünü 50 mL'ye kadar soğuk DMEM (% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş) ile doldurun. Tüpü üç kez ters çevirerek karıştırın. Sonraki adımlar için DMEM'i bir buz kovasında tutun.</li>
	<li>50 mL'lik yeni bir tüpe 100 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Sindirilmiş karışımı hücre süzgecinden geçirerek yeni tüpe aktarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı sıvı bir atık kabına dökün.</li>
	<li>Peletleri 1 mL soğuk DMEM'de (% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş) yeniden süspanse edin. Tüpü aynı DMEM ile 50 mL'ye kadar doldurun. NOT: Santrifüjleme atlanırsa, bir sonraki peletin tanımlanması ve bakımı daha zor olacaktır.</li>
	<li>Yeni bir 50 mL'lik tüpe 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Santrifüjlenmiş/yeniden süspanse edilmiş karışımı hücre süzgecinden yeni tüpe geçirin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 80 x g'da santrifüjleyin. NOT: Bu adım zorunlu değildir, ancak hücre kalıntılarını ortadan kaldırmak için önerilir.</li>
	<li>50 mL'lik yeni bir tüpe 40 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Süpernatanı hücre süzgecinden yeni tüpe geçirin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı sıvı bir atık kabına dökün ve peleti kültür kaputunun altında FBS'de yeniden süspanse edin. Pelet bu adımda çok küçüktür (Şekil 1F). NOT: 40 μm'lik süzgeçten filtreleme, kültürlerin daha sonraki boyanmasında spesifik olmayan bir sinyal verecek olan kalıntıları giderir.</li>
</ol>6. (İsteğe bağlı) Dondurma
NOT: Bölüm 6 isteğe bağlıdır. Protokol filtrelemeden sonra duraklatılabilir, ancak bu hücre sağkalımını ve kültür başarısını azaltabilir.
<ol><li><li> </li><li></li></ol><ol><li><li> </li><li> </li><li> </li></ol><ol><li> </li><li> </li></ol><ol><li><li></ol><ol><li> </li><li><li></li><li> </li></ol>

Kök hücreleri ve nişlerini kültürlemek için fare iskelet kasının toplanması

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle%3A+A+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>Forcina, L., Cosentino, M., Musarò, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+regulating+muscle+regeneration%3A+Insights+into+the+interrelated+and+time-dependent+phases+of+tissue+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mechanisms regulating muscle regeneration: Insights into the interrelated and time-dependent phases of tissue healing.</a> Cells. 9 (5), 1297(2020).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
<li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li>
<li>McCarthy, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+fiber+hypertrophy+in+satellite+cell-depleted+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle.</a> Development. 138 (17), 3657-3666 (2011).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li>
<li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li>
<li>Hicks, M. R., Pyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The emergence of the stem cell niche.</a> Trends in Cell Biology. 33 (22), 112-123 (2022).</li>
<li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692(2021).</li>
<li>Gama, J. F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+regulatory+T+cells+in+skeletal+muscle+regeneration%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Role of regulatory T cells in skeletal muscle regeneration: A systematic review.</a> Biomolecules. 12 (6), 817(2022).</li>
<li>Loreti, M., Sacco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+jam+session+between+muscle+stem+cells+and+the+extracellular+matrix+in+the+tissue+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The jam session between muscle stem cells and the extracellular matrix in the tissue microenvironment.</a> NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 16(2022).</li>
<li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+regulatory+cascades+govern+extraocular+and+pharyngeal+arch+muscle+progenitor+cell+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct regulatory cascades govern extraocular and pharyngeal arch muscle progenitor cell fates.</a> Developmental Cell. 16 (6), 810-821 (2009).</li>
<li>Pereira, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cell+cycle+kinetics+by+EdU+%285-ethynyl-2%27-deoxyuridine%29-coupled-fluorescence-intensity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis.</a> Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).</li>
<li>Bismuth, K., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+skeletal+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of skeletal muscle development.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3081-3086 (2010).</li>
<li>Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+and+the+muscle+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Satellite cells and the muscle stem cell niche.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).</li>
<li>Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+functions+of+platelet%2Fendothelial+cell+adhesion+molecule-1+%28CD31%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31).</a> Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+From+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: From the known and the unknown.</a> Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).</li>
<li>Abou-Khalil, R., Le Grand, F., Chazaud, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+murine+skeletal+muscle+reserve+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Niche%22%5BJournal%5D)">Human and murine skeletal muscle reserve cells.</a> Stem Cell Niche. 1035, 165-177 (2013).</li>
<li>Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+muscle+stem+cells+by+fluorescence+activated+cell+sorting+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2011).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Montarras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).</li>
<li>Qu, Y., Edwards, K., Barrow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+use+of+primary+murine+myoblasts+in+small-molecule+screens%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and use of primary murine myoblasts in small-molecule screens.</a> STAR Protocols. 4 (2), 102149(2023).</li>
<li>Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells%3A+Background+and+methods+for+isolation+and+analysis+in+a+primary+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells: Background and methods for isolation and analysis in a primary culture system.</a> Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2011).</li>
<li>Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+macrophage+conditioned-medium+on+murine+and+human+muscle+cells%3A+analysis+of+proliferation%2C+differentiation%2C+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion.</a> Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).</li>
<li>Giordani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+single-cell+cartography+reveals+novel+skeletal+muscle-resident+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations.</a> Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).</li>
<li>Tabula Muris Consortium et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li>
<li>Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopattern+surface+improves+cultured+human+myotube+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation.</a> Skeletal Muscle. 11 (1), 12(2021).</li>
<li>Denes, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+C2C12+myotubes+on+micromolded+gelatin+hydrogels+accelerates+myotube+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation.</a> Skeletal Muscle. 9 (1), 17(2019).</li>
<li>LaFramboise, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+muscle+origin+and+phenotype+on+satellite+cell+muscle-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).</li>
<li>Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regenerative+potential+of+Pax3%2FPax7+on+skeletal+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Generic+Engineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury.</a> Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143(2022).</li>
<li>Hardy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+injury+models+for+studying+muscle+regeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0147198(2016).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Yetişkin iskelet kası fonksiyonu, ince bir şekilde düzenlenmiş bir dizi hücresel etkileşim ve moleküler sinyal ile desteklenir. Burada, bu parametrelerin fizyolojik mikro çevreye çok benzeyen bir ex vivo ortamda incelenmesine izin veren bir yöntem sunulmaktadır.
Birkaç grup, miyojenik hücreleri kültürlemek için in vitro yöntemler bildirmiştir. Bu yöntemler, miyojenik progenitör özelliklerini incelemek için uydu hücrelerini izole etmeyi amaçladı. Saf uydu hücrelerini, soleus v...

Hareket, solunum, metabolizma, vücut duruşu ve vücut ısısının korunması iskelet kasına bağlıdır ve iskelet kasındaki arızalar bu nedenle zayıflatıcı patolojilere (yani miyopatiler, kas distrofileri, vb.) neden olabilir. 1. Temel işlevleri ve bolluğu göz önüne alındığında, iskelet kası, normal kas fonksiyonunu destekleyen ve terapötik hedefler olarak hizmet edebilecek temel yönleri anlamaya çalışan dünya çapındaki araştırma laboratuvarlarının dikkatini çekmiştir. Ek olarak, iskelet kası, rejenerasyon ve kök hücre fonksiyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılan bir modeldir, çünkü sağlıklı kas, çoğunlukla yerleşik kök hücreleri nedeniyle tam yaralanma ve dejenerasyondan sonra tamamen kendi kendini onarabilir2; Bunlar aynı zamanda uydu hücreleri olarak da adlandırılır ve kas liflerinin çevresindeki bazal lamina altında lokalizedir3.
Yetişkin iskelet kasının çekirdek hücreleri, miyolifler (uzun sinsityal multinükleer hücreler) ve uydu hücreleridir (bir yaralanma onları aktive edene kadar hareketsiz olan miyojenik potansiyele sahip kök hücreler). İkinci hücreler, kas rejenerasyonunun merkezi hücreleridir ve bu süreç onların yokluğunda gerçekleşemez 4,5,6,7. Yakın mikro çevrelerinde, onlara sinyal veren çok sayıda hücre tipi ve moleküler faktör vardır. Bu niş, gelişim boyunca ve yetişkinliğe kadar kademeli olarak kurulur8. Yetişkin kası birden fazla hücre tipi içerir (endotel hücreleri, perisitler, makrofajlar, fibro-adipojenik progenitörler-FAP'ler, düzenleyici T hücreleri, vb.) 9,10 ve hücre dışı matriks bileşenleri (lamininler, kollajenler, fibronektin, fibrilinler, periostin vb.) Sağlık, hastalık ve rejenerasyon bağlamında birbirleriyle ve uydu hücreleriyle etkileşime giren 11.
Bu karmaşık nişi deneysel ortamlarda korumak temel ama zordur. Aynı derecede zor olan, uydu hücreleri için kritik olan bir hücre durumu olan sessizliği korumak veya geri dönmektir9. Bu zorlukların kısmen üstesinden gelmek için, her birinin avantajları ve dezavantajları olan çeşitli yöntemler tanıtılmıştır (tartışma bölümünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır). Burada, bu iki engeli kısmen aşabilecek bir yöntem sunulmaktadır. Kaslar başlangıçta toplanır ve daha sonra heterojen hücre karışımı kültüre sokulmadan önce mekanik ve enzimatik olarak parçalanır. Kültür boyunca, nişin birçok hücre tipi tespit edilir ve sessizliğe geri dönen uydu hücreleri gözlenir. Protokolün son adımı olarak, evrensel olarak kabul edilmiş belirteçlerin kullanılmasıyla her hücre tipinin saptanmasına izin veren immünofloresan adımları sunulmaktadır.

<table><tbody><tr><td>anti-CD31</td><td>BD</td><td>550274</td><td>seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>anti-FOSB</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7203</td><td>seyreltme 1:200</td></tr><tr><td>anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>seyreltme 1:1000</td></tr><tr><td>anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td>seyreltme 1:1000</td></tr><tr><td>anti-MyHC</td><td>DSHB</td><td>MF20-c</td><td>seyreltme 1:400</td></tr><tr><td>anti-MYOD</td><td>Aktif Motif</td><td>39991</td><td>seyreltme 1:200</td></tr><tr><td>anti-MYOG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-576</td><td>seyreltme 1:150</td></tr><tr><td>anti-Pax7</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-81648</td><td>seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>anti-PDGFR ve alfa;</td><td>İnvitrojen</td><td>PA5-16571</td><td>seyreltme 1:50</td></tr><tr><td>b-FGF</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td>konsantrasyon 4 ng/mL</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA) &ndash; sindirim için kullanılır&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-1006</td><td>konsantrasyonu %0.2</td></tr> <tr><td>BSA IgG içermez, proteaz içermez ve boyama için kullanılır</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td>konsantrasyon %5</td></tr> <tr><td>Hücre süzgeci 40 um</td><td>Dominique Dutscher</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci 70 um</td><td>Dominique Dutscher</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci 100 um</td><td>Dominique Dutscher</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td>konsantrasyonu 0,5 U/mL</td></tr><tr><td>Kültür plakası</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.802</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>Euromedex</td><td>UD8050-05-A</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>konsantrasyonu 3 U/mL</td></tr><tr><td>Diseksiyon forseps boyutu 5</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon forseps boyutu 55</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon makası (büyük, düz)</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>9146-11</td><td>doğrama için ideal</td></tr><tr><td>Diseksiyon makası (küçük, kavisli)</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>15017-10</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon makası (küçük, düz)</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>EdU Click-iT kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu ve seçenek 1</td><td>Eurobio</td><td>CVF00-01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu &ndash; seçenek 2</td><td>Gibco</td><td>10270-106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>354234</td><td>kaplama çözeltisi</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Dominique Dutscher</td><td>090261</td><td>esnek film</td></tr><tr><td>Paraformaldehit ve seçenek 1</td><td>PanReac AppliChem ITW Reaktifleri</td><td>2115111.1209</td><td>konsantrasyon %4</td></tr> <tr><td>Paraformaldey & ndash; seçenek 2</td><td>ThermoFisher</td><td>28908</td><td>konsantrasyon %4</td></tr><tr><td>Penisilin streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalama su banyosu</td><td>ThermoFisher</td><td>TSSWB27</td><td></td></tr><tr><td>TritonX100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8532-500 ML</td><td>konsantrasyon %0,5</td></tr> <tr><td>Yabani tip fareler</td><td>Janvier</td><td>C57BL/6NRj</td><td></td></tr></tbody></table>

niş ve kök hücre sessizliğini Özetlemek için fare İskelet kasının fraksiyone edilmemiş toplu kültürü

Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence

İskelet kası vücudun en büyük dokusudur ve hareketten vücut ısısı kontrolüne kadar birçok işlevi yerine getirir. İşlevselliği ve yaralanmalardan iyileşmesi, çok sayıda hücre tipine ve çekirdek kas hücreleri (miyofiberler, kas kök hücreleri) ve bunların nişleri arasındaki moleküler sinyallere bağlıdır. Deneysel ortamların çoğu bu karmaşık fizyolojik mikro ortamı korumaz ve onlar için çok önemli olan bir hücre durumu olan sessizlik içindeki kas kök hücrelerinin ex vivo çalışmasına da izin vermez. Burada, kas kök hücrelerinin nişlerinin hücresel bileşenleri ile ex vivo kültürü için bir protokol özetlenmiştir. Kasların mekanik ve enzimatik parçalanması yoluyla, 2D kültüre konan hücre tiplerinin bir karışımı elde edilir. İmmün boyama, 1 hafta içinde, miyofiberlerin ve daha da önemlisi, hareketsiz kas kök hücrelerinin özelliklerini gösteren Pax7 pozitif hücrelerin yanı sıra kültürde birden fazla niş hücrenin bulunduğunu göstermektedir. Bu benzersiz özellikler, bu protokolü hücre amplifikasyonu ve temel ve translasyonel soruları ele almak için kullanılabilecek hareketsiz benzeri kök hücrelerin üretilmesi için güçlü bir araç haline getirir.

Bu protokol, uydu hücrelerini ve çoğu hücreyi endojen nişlerinden korurken kas hücresi kültürüne izin verir. Şekil 2, protokolün ana adımlarını özetlerken, diseksiyon ve sindirimin temel kısımları Şekil 1'de sunulmaktadır. Arka bacak kas sisteminin diseksiyonu önerilir (Şekil 1A-C), çünkü bu kas grubu iyi çalışılmıştır ve gelişimsel bir kökeni ve moleküler hiyerarşileri paylaşır14<...

İskelet kası, her biri kas homeostazına ve rejenerasyonuna özel bir katkısı olan yerleşik kök hücreler de dahil olmak üzere birden fazla hücre tipinden oluşur. Burada, fizyolojik, in vivo ve çevresel özelliklerin çoğunu koruyan ex vivo bir ortamda kas kök hücrelerinin 2 boyutlu kültürü ve kas hücresi nişi açıklanmaktadır.

Niş ve Kök Hücre Sessizliğini Özetlemek için Fare İskelet Kasının Fraksiyone Edilmemiş Toplu Kültürü

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...

Araştırmamız, uydu hücrelerine özel önem vererek sağlıklı ve hastalıklı iskelet kası çalışmasını içermektedir. Araştırdığımız temel yönlerden biri, hücreye özgü gen ekspresyonunu koordine eden transkripsiyonel arttırıcıların tanımlanmasıdır. Bu protokol, özgüllüğü belirlemek için hızlı testler yapmamıza izin verir.İskelet kası araştırmaları alanında, homeostaz, rejenerasyon ve hastalıkta farklı hücre popülasyonlarını incelemek için tek hücreli ve tek çekirdekli RNA dizileme yaklaşımları sıklıkla kullanılmaktadır. Ayrıca, uydu hücreleri, floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması veya FACS ile izole edilebilir ve hipotez testi ve sıralama sonucu doğrulaması için kültürlenebilir. Uydu hücrelerini in vitro olarak incelemek önemli bir zorluk teşkil etmektedir.Son çalışmalar, uydu hücrelerinin fizyolojisindeki rolünü vurguladı. FACS ile izole edilmiş uydu hücrelerini kültürlemek yaygın olsa da, uydu hücreleri nişinin in vitro olarak çoğaltılması henüz başarılamamıştır. Protokolümüz, endotel hücreleri ve fibro edoprogenetik progenitörler gibi miyojenik olmayan hücreler de dahil olmak üzere tüm kas dokusunu kültürlemenin verimli ve pratik bir yolunu sunar.Hareketsiz hücrelerin kültürden sonraki bir hafta içinde ortaya çıktığını gösterdik. Bu protokol, diğer hücrelerin bu hareketsiz havuzu yeniden kurma üzerindeki etkisini incelemek için de kullanılabilir.

unfractionated-bulk-culture-mouse-skeletal-muscle-to-recapitulate

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mikro-disseke eksplantlar tekniği, iskelet kas kök hücre kaynağı olarak çocuk, yetişkin ya da embriyonik kasları proliferatif iskelet kas hücreleri izole için sağlam ve güvenilir bir yöntemdir. Benzersiz, bu hücrelerin klonal in vivo nakli için kullanılan iskelet kas kök hücre hatları üretmek için türetilmiştir.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Myofibers izolasyonu ve kültürü altın...

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Hareketsiz uydu hücrelerin saf nüfusun izolasyonu ve kültürü, kas kök hücre topluluğu, kas kök hücre biyolojisi ve rejenerasyon, hem de kas distrofisi ve diğer dejeneratif hastalıklarda tedavileri için kök hücre nakli anlaşılması için gereklidir.

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

İnsan kasından türetilen ana yapışık hücre tipleri miyojenik hücreler ve fibroblastlardır. Burada, hücre popülasyonları, CD56 antijenine dayalı olarak manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak zenginleştirilir. Spesifik antikorlarla müteakip immüno-etiketleme ve görüntü analiz tekniklerinin kullanılması, tek tek hücrelerde sitoplazmik ve nükleer özelliklerin miktar tayinine izin verir.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

Miyoblastlar polinükleatlı miyotüpler ve sonunda iskelet kası miyofiberleri oluşturmak için farklılaşan öncül hücrelerdir. Burada, genç yetişkin fare iskelet kaslarından etkili izolasyon ve birincil miyoblast kültürü için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, kültürdeki kas hücrelerinin moleküler, genetik ve metabolik çalışmalarını mümkün kılar.

Fare İskelet Kas Ekstranında Primer Miyoblastların İzolasyon ve Farklılaşması

Burada, homozigot mutant Lamin Δ8-11 fare modeli, Emery-Dreifuss kas distrofisi (EDMD) için çok ciddi bir model erken doğum sonrası gelişim aşamalarında verimli bir şekilde tek kas lifleri elde etmek için bir yöntem öneriyoruz.

Erken Doğum Sonrası Gelişimde Emery-Dreifuss Musküler Distrofi'nin Murine Modelinden Tek Miyofiber İzolasyon ve Kültür

Bu protokolde, kas kök hücreleri için endojen nişleriyle etkileşimlerinin çoğunu koruyan bir in vitro kültleme ve fonksiyonel analiz yöntemi tanımlanmıştır.

Yetişkin Kas Kök Hücre İşlevselliğinin Değerlendirilmesi için Tek Miyofiber Kültür Tahlil Ex Vivo

Fibro-adipojenik progenitör hücrelerin (FAP'lar) ve kas kök hücrelerinin (MuSC'ler) kesin olarak tanımlanması, fizyolojik ve patolojik koşullarda biyolojik işlevlerini incelemek için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, FAP'ların ve MuSC'lerin yetişkin fare kaslarından izolasyonu, saflaştırılması ve kültürü için kılavuzlar sağlar.

FACS-İzolasyon ve Fibro-Adipojenik Progenitörlerin ve Kas Kök Hücrelerinin Bozulmamış ve Yaralı Fare İskelet Kasından Kültürü

Bu protokol, kas kök hücrelerinin ve fibro-adipojenik progenitörlerin farelerde bireysel iskelet kaslarından izolasyonunu tanımlar. Protokol, tek kas diseksiyonu, floresan aktive hücre sıralama ile kök hücre izolasyonu, immünofloresan boyama ile saflık değerlendirmesi ve 5-etinil-2'-deoksiüridin dahil etme testi ile S-faz girişinin kantitatif ölçümünü içerir.

Sessiz Kök Hücre Popülasyonlarının Bireysel İskelet Kaslarından İzolasyonu

Mevcut protokol, farelerden yüksek oranda homojen kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini (BMSC'ler) saflaştırmak, genişletmek ve karakterize etmek için uygun maliyetli bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu yaklaşım, yüksek proliferasyon ve farklılaşma potansiyeline sahip büyük miktarlarda BMSC'lerin elde edilmesini kolaylaştırır, fare modellerini destekler ve klinik öncesi araştırmaları ilerletir.

Fare Kaynaklı Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin Saflaştırılması, Genişletilmesi ve Akış Sitometrisi Tabanlı Fenotiplendirilmesi

Bu protokol, yetişkin ve yenidoğan fare iskelet kaslarından birincil miyoblastların doku ayrışması, ardışık filtrasyon, ön kaplama ve tanımlanmış kültür koşulları yoluyla izole edilmesi ve zenginleştirilmesi için standartlaştırılmış bir yöntem sunar; böylece uydu hücresinden türetilen miyoblast kültürlerinin sonraki deneysel uygulamalar için oluşturulması ve bakımı mümkün olur.

In vitro miyogenez çalışmaları için iskelet kası uydu hücrelerinin izolasyonu

Keşfedin fare iskelet kasının fraksiyone edilmemiş toplu kültür protokolünü, uydu hücrelerinin niş ortamını ve sessizliğini incelemek için. Bu yöntem, kas biyolojisi ve rejeneratif tıp araştırmalarında yeni tedavi stratejileri geliştirmeye katkı sağlar.

Niş ve Kök Hücre Sessizliğini Özetlemek için Fare İskelet Kasının Fraksiyone Edilmemiş Toplu Kültürü

Daha fazla video keşfet