Name: Saccharomyces cerevisiaede Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Keşfedin, Saccharomyces cerevisiae'de tek kopya gen lokus kromatin saflaştırma yöntemini. Protein-DNA etkileşimlerini incelemek için yerel kromatin bağlamında yüksek zenginleştirme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.H. laboratuvarındaki çalışmalar, SFB1064 (proje kimliği 213249687), Avrupa Araştırma Konseyi (ERC Başlangıç Hibesi 852798 Çatışma Çözümü) ve Helmholtz Gesellschaft aracılığıyla DFG tarafından desteklenmiştir.

Maya Hücrelerinden Locus'a Özgü Kromatin İzolasyonu

<ol><li>Kornberg, R. D., Lorch, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-five+years+of+the+nucleosome%2C+fundamental+particle+of+the+eukaryote+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome.</a> Cell. 98 (3), 285-294 (1999).</li>
<li>Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+enrichment+of+specific+chromatin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and enrichment of specific chromatin loci.</a> Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).</li>
<li>Korthout, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+chromatin+proteome+of+a+single+genomic+locus+by+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing.</a> PLoS Biology. 16 (7), e2005542(2018).</li>
<li>Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+landscape+at+Drosophila+melanogaster+telomere-associated+sequence+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats.</a> Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).</li>
<li>Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins+associated+with+specific+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins associated with specific genomic loci.</a> Cell. 136 (1), 175-186 (2009).</li>
<li>Ide, S., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-targeting+proteomics+of+isolated+chromatin+segments+of+a+mammalian+ribosomal+RNA+gene+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter.</a> Nature Communications. 6, 6674(2015).</li>
<li>Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+histone+acetylation+regulate+origins+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26amp%3B+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (4), 430(2010).</li>
<li>Buxton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+protein-DNA+interactions+in+human+alphoid+chromatin+via+hybridization+capture+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).</li>
<li>Kennedy-Darling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+chromatin-associated+proteins+via+sequence-specific+capture+and+mass+spectrometric+protein+identification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).</li>
<li>Liu, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi-based+genome-scale+identification+of+functional+long+noncoding+RNA+loci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells.</a> Science. 355, 7111(2017).</li>
<li>Hamperl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+chromatin+domains+from+single-copy+gene+loci+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Analysis+of+DNA+and+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae.</a> Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).</li>
<li>Hamperl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+and+structural+analysis+of+selected+chromosomal+domains+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 2(2014).</li>
<li>Weiβ, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+locus+proteomics+of+early-+and+late-firing+DNA+replication+origins+identifies+a+role+of+Ask1%2FDASH+complex+in+replication+timing+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control.</a> Cell Reports. 42 (2), 112045(2023).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol">https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol</a> (2023).</li>
<li>Vermeulen, M., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-specific+chromatin+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Locus-specific chromatin isolation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Belirli bir hedef genomik bölgenin faktörlerinin ve kromatin manzarasının tanımlanması, kromatin araştırmalarında büyük bir zorluk oluşturmaya devam etmektedir18. Bu protokol, maya kromozomlarından farklı kromatin alanlarını spesifik olarak çıkarmak ve saflaştırmak için etkili bir sistemi tanımlar. Bildiğimiz kadarıyla, bu tek aşamalı saflaştırmanın saflığı ve verimi, lokusa özgü kromatin saflaştırma yöntemlerinin birçok sınırlamasının üstesinden gelir, böylece diğer ilgisiz genomik bölgelere kıya...

Ökaryotik genomların kromatine dinamik organizasyonu, DNA'yı çekirdeğin sınırlarına sığacak şekilde sıkıştırırken, gen ekspresyonu için yeterli dinamikleri ve düzenleyici faktörler için erişilebilirliği sağlar. Kısmen, bu çok yönlülüğe, histon oktamer1'in etrafına ~1.7 kez sarılmış 147 bp DNA'ya sahip bir çekirdek parçacığı içeren kromatinin temel birimi olan nükleozom aracılık eder. Nükleozom, N ve C terminal histon kuyruklarında çok sayıda histon varyantı ve posttranslasyonel modifikasyon (PTM'ler) ile bileşimine göre oldukça dinamik bir yapıdır. Ayrıca, ökaryotik kromatin, transkripsiyon faktörleri, DNA ve RNA işleme makineleri, mimari proteinler, kromatinin yeniden şekillenmesi ve modifikasyonunda yer alan enzimler ve kromatin ile ilişkili RNA molekülleri gibi çok sayıda başka temel bileşenle etkileşime girer. Transkripsiyon, replikasyon ve onarımda yer alan bu önemli makinelerin tümü, bu işlemler için doğal substrat görevi gören kromatine erişim gerektirir. Sonuç olarak, bu DNA işlemlerinin altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılması, bu makinelerin birleştiği ve biyolojik reaksiyonları kolaylaştırdığı spesifik genomik bölgelerdeki kromatin yapısındaki kolektif değişikliklerin kesin bir tanımını gerektirir.
Genetik ve protein-protein etkileşimi çalışmaları yoluyla çok sayıda kromatin faktörünün tanımlanmasına rağmen, belirli genomik bölgelerde kromatin etkileşimlerinin doğrudan, tarafsız ve kapsamlı analizlerinin yapılması önemli bir engel olarak kalmıştır 2,3. Başlangıçta, genomun yalnızca yüksek oranda bol bölgeleri (yani, tekrarlayan lokuslar) veya çok kopyalı plazmitler, ilişkili proteinlerinkütle spektrometrik tanımlaması için yeterli miktarda ve saflıkta izole edilebilirdi 4,5,6,7. Yakalama problarının kromatinize DNA'ya doğrudan hibridizasyonuna, CRISPR-dCas9 sistemi kullanılarak yakınlık biyotinilasyonuna veya diziye özgü adaptör proteinlerinin ilgilenilen lokusa bağlanmasına dayanan bir dizi yeni yaklaşım, maya ve memeli genomlarından tek kopya lokusların proteomunu çözmeye başlamıştır 8,9,10. Bununla birlikte, tüm bu yöntemler, protein-DNA etkileşimlerini stabilize etmek için formaldehit çapraz bağlama ve sonraki saflaştırma için kromatini çözündürmek için sonikasyon gerektirir. Birlikte, her iki manipülasyon da saflaştırılmış kromatinin müteakip yapısal ve fonksiyonel çalışmaları olasılığını dışlar.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, daha önce maya 11,12'den hedeflenen kromozomal alanları çıkarmak için bölgeye özgü rekombinasyon kullanan bir metodoloji tasarladık. Özünde, ilgilenilen genomik bölge, Zygosaccharomyces rouxi'den bölgeye özgü R-rekombinaz için tanıma bölgeleri (RS) ile çevrilidir ve aynı zamanda aynı bölgedeki prokaryotik transkripsiyonel baskılayıcı LexA proteini (LexA) için üç DNA bağlanma bölgesinden oluşan bir grup içerir. Maya hücreleri, R-rekombinazın eşzamanlı ekspresyonu için bir ekspresyon kaseti ve bir tandem afinite saflaştırma (TAP) etiketine kaynaşmış bir LexA proteini içerir. R-rekombinazın indüksiyonundan sonra, enzim hedeflenen bölgeyi kromozomdan dairesel bir kromatin alanı şeklinde verimli bir şekilde çıkarır. Bu alan, LexA DNA bağlanma bölgelerine ve ayrıca bir afinite desteğine bağlanan LexA-TAP adaptör proteini aracılığıyla saflaştırılabilir. Bu yöntem son zamanlarda maya kromozomu III13'ün seçilmiş replikasyon kökenlerini içeren farklı kromatin alanlarını izole etmek için kullanılmıştır.
Bu ex vivo yaklaşımın en büyük avantajlarından biri, izole edilmiş malzemenin fonksiyonel analizlerine izin vermesidir. Örneğin, bu yöntemle saflaştırılan replikasyon orijin alanları, doğal in vivo montajlı kromatin şablonlarından bir test tüpünde orijin ateşlemesinin verimliliğini değerlendirmek için in vitro replikasyon testlerine tabi tutulabilir. Sonuç olarak, izole edilmiş materyalin biyokimyasal ve fonksiyonel karakterizasyonu, doğal kromatin şablonu ile birlikte saflaştırılmış proteinler kullanılarak nükleer işlemlerin yeniden oluşturulmasına izin verebilir. Özetle, bu metodoloji, belirli bir kromozomal işlem geçiren belirli bir genomik bölgenin kolektif bileşimsel ve yapısal kromatin değişikliklerini takip etmek mümkün olacağından, kromatin araştırmalarında heyecan verici bir yol açar.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > maya suşları< / güçlü > <</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>güçlü > Kontrol Suşu: < / güçlü> MATa; ura3 ve Delta; 0; leu2 ve Delta; 0; onun3&Delta; 1; met15 ve Delta; 0; çubuk1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR</td><td></td><td></td><td>Bölüm 1, referanslar 13 ve 14</td></tr><tr><td><güçlü>Rekombinasyon Suşuna bakın: </güçlü> MATa; ura3 ve Delta; 0; leu2 ve Delta; 0; onun3&Delta; 1; met15 ve Delta; 0; çubuk1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR</td><td></td><td></td><td>Bölüm 1, referans 13 ve 14</td></tr><tr><td>Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K238 plazmid</td><td></td><td></td><td>Bölüm 1'e bakın, referans 13 'ye bakın Depolama: -20 derecede saklayın; C</td></tr><tr><td>K071 Spike-in plazmit DNA</td><td></td><td></td><td>Bölüm 7.1, referans 13 Depolama: -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td><güçlü > Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Carl Roth</td><td>5025<</td><td>> Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Amonyum asetat (NH < alt > 4 < / > Ac)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A7262</td><td>Bölüm 6 ve 7.1 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Amonyum çözeltisi (NH < alt > 4< / alt >OH) %25</td> <td>Merck Millipore</td><td>533003</td><td>Bölüm 6 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Amonyum sülfat</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-29085</td><td>Bölüm 2 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD (VWR)</td><td>90000-760</td><td>Bölüm 3 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD (VWR)</td><td>211820</td><td>Bölüm 3 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>07604</td><td>Bölüm 7.2 Depolama: 4 derecede saklayın; C</td></tr><tr><td>Kemilüminesan substrat kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>34580</td><td>Bölüm 7.2 Depolama: 4 derecede saklayın; C</td></tr><tr><td>Di-Sodyum Hidrojen fosfat dodekahidrat</td><td>Merck</td><td>1.06579.1000</td><td>Bölüm 2 ve 7.1 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Ditiyotreitol (DTT)</td> <td>ThermoFisher</td><td>15508013</td><td>Bölüm 4 Depolama: 4 derecede saklayın; C</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Bölüm 7.1 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ED</td><td>Bölüm 7.1 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Galaktoz (%20 (a/h) stok)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0625-1KG&nbsp; /&nbsp; 5KG</td><td>Bölüm 3 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Jel boya yükleme (6x)</td><td>BioLabs</td><td>B7024A</td><td>Bölüm 7.1 Depolama: -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Glusose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Bölüm Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl</td> <td>Roth.0079.4</td><td>Bölüm 2 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Glikojen (5 mg / mL)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td>Bölüm 7.1 Depolama: -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit (HCl)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>182109.1211</td><td>Bölüm 2, 4 ve 7.1 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Magnezyum Asetat (MgAc)</td><td>Bernd Kraft</td><td>15274.2600/C035</td><td>Bölüm 4 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür (MgCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>Bölüm 6 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Nu PAGE LDS numune tamponu (4x)</td><td>Invitrogen</td><td>2399549</td><td>Bölüm 7.2 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Fenol/Kloroform/İzoamil alkol (25:24:1 v/v)</td><td>İnvitrojen</td><td>15593-031</td><td>Bölüm 7.1 Depolama: 4 derecede saklayın; C</td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Bölüm 4 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Radyoaktif olarak etiketli &alfa;-32P dATP (3.000 Ci/mmol, 10 mCi/mL)</td><td>Hartmann Analitik</td><td>SRP-203</td><td>Bölüm 7.1 Depolama: 4 derecede saklayın; C</td></tr><tr><td>RadPrime etiketleme sistemi</td><td>ThermoFisher</td><td>18428-011</td><td>Bölüm 7.1 Depolama: -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Rafinoz (%20 (a/h) stok)</td><td>SERVA</td><td>34140.03</td><td>Bölüm 3 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Merck</td><td>K53710504142</td><td>Bölüm 7.1 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Sodyum sitrat (Na3C6H5O7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71402</td><td>Bölüm 7.1 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Bölüm 7.1 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Sodyum n-dodesil sülfat (SDS) (%5 stok (a/h))</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11183</td><td>Bölüm 7.1 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71496</td><td>Bölüm 2 ve 7.1 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Sodyum&nbsp; azide</td><td>Santa Cruz&nbsp; Biyoteknoloji</td><td>sc-208393</td><td>Bölüm 2 Depolama: -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>&nbsp; Trietilamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90340</td><td>Bölüm 2 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Chem Cruz</td><td>SC-3715B</td><td>Bölüm 2 ve 4 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Bölüm 2 ve 4 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bernd Kraft</td><td>18014332</td><td>Bölüm 4 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Maya özütü</td><td>BD (VWR)</td><td>212720</td><td>Bölüm 3 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Maya çiftleşme faktörü alfa (1 & mikro; g/mL stok )</td><td>&nbsp; Biomol</td><td>Y2016.5</td><td>Bölüm 3 Depolama: -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Maya Sentetik Bırakma ortamı LEUCINE</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1376</td><td>Bölüm 1'e bakın, referans 14</td></tr><tr><td><güçlü>Enzimler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HpaI kısıtlama enzimi (5.000 U/mL)</td> <td>NEB</td><td>R0105S</td><td>Bölüm 7.1 Depolama: -20 derecede saklayın; C</td></tr><tr><td>Proteaz ve Fosfataz İnhibitör Kokteyli (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78446</td><td>Bölüm 4 Depolama: 4 &° Depolayın; C</td></tr><tr><td>Proteinaz K (10 mg/mL)</td><td>SERVA</td><td>33756</td><td>Bölüm 7.1 Depolama: -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>RNase A (10 mg/mL)</td><td>&nbsp; ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td>Bölüm 7.1 Depolama: -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>TEV proteaz (10000 U/&mikro; L)</td> <td>NEB</td><td>P8112S</td><td>Bölüm 5 Depolama: -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>< güçlü > Malzemeler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BcMag Epoksi ile Aktive Edilmiş Manyetik Boncuk</td><td>Biyoklon A.Ş.</td><td>FC-102</td><td>Bölüm 2 Depolama: 4 &°C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Kuru buz</td><td></td><td></td><td>Bölüm 4</td></tr><tr><td>Düşük bağlayıcı santrifüj tüpleri 2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td>Bölüm 4</td></tr><tr><td>Microspin&nbsp; G-25 Sütunları</td><td>Cytiva</td><td>27-5325-01</td><td>Bölüm 7.1 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td>Merck P7793</td><td>Bölüm 4</td></tr><tr><td>Pozitif naylon membran</td><td>Biozol</td><td>11MEMP0001</td><td>Bölüm 7.1 Depolama: Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>PVDF transfer membranı</td><td>Immobilon-Merck Kırlangıç IPVH00010</td><td></td><td>Bölüm 7.2 Depolama: Odada saklayın sıcaklık</td></tr><tr><td>SDS-PAGE jel% 4-12 bis-tris (15 kuyu, 1.5 mm)</td> <td>İnvitrojen</td> <td>ve nbsp; NP0336BOX</td><td>Bölüm 7.2 Depolama: 4 &°C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Şırınga (25 mL) luer bağlantılı</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4200-000V0</td><td>Bölüm 3</td></tr><tr><td>Whatman kağıdı (Sınıf 3MM CHR Selüloz Batı Kurutma Kağıt Levhası)</td> <td>Cytiva</td><td>3030-917</td><td>Bölüm 7.1 Depolama: Oda sıcaklığında</td></tr> <tr><td>saklayın < güçlü > Antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Anti-LexA, tavşan poliklonal IgG, DNA bağlanma bölgesi antikoru</td><td>Merck Millipore</td><td>06-719</td><td>Bölüm 7.2 Depolama: -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L), Yaban turpu peroksidaz konjugatı</td><td>Invitrogen</td><td>G21234</td><td>Bölüm 7.2 Depolama: -20 ° C'de saklayın; </td></tr><tr><td>TAP etiketli proteinlerin tespiti için tavşanda üretilen C Peroksidaz Anti-Peroksidaz (PAP) antikoru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1291-500UL</td><td>Bölüm 7.2 Depolama: -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Tavşan IgG antikorları</td><td>Sigma</td><td>I5006-100MG</td><td>Bölüm 2 Depolama: 4 derecede saklayın; C</td></tr><tr><td>< güçlü>Primerler (10 & mikro; M)</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>ARS316:</güçlü> fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT</td><td></td><td></td><td>Bölüm 7.1</td></tr><tr><td><güçlü>K071 Spike-in plazmit DNA:</güçlü> fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT</td><td></td><td></td><td>Bölüm 7.1</td></tr><tr><td><şablon olarak maya genomik DNA'sından güçlü>PCR fragmanı &nbsp; ARS316 amplifikasyonu için (güney blot için):</güçlü> fwd 5'- AAATTCTGCCCTTGATTCGT&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; rev 5'- TTTGTTTATCTCATCACTAAT</td><td></td><td></td><td>Bölüm 7.1</td></tr><tr><td>PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT</td><td></td><td></td><td>Bölüm 7.1</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kahve değirmeni</td><td>Gastroback</td><td>42601</td><td>Bölüm 4</td></tr><tr><td>Dewar şişesi</td><td>NAL GENE</td><td>4150-2000</td><td>Bölüm 3</td></tr><tr><td>DynaMag TM-2 manyetik raf</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Bölüm 4, 5 ve 6</td></tr><tr><td>Hibridizasyon fırını</td><td>Hybaid Mini10</td><td>Ri418</td><td>Bölüm 2</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>Bölüm 4 ve 7.1</td></tr><tr><td>UV çapraz bağlayıcı</td><td>Analizi</td><td>95-0174-02</td><td>Bölüm 7.1</td></tr></tbody></table>

saccharomyces cerevisiae'de tek kopya gen lokus kromatin saflaştırması

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

Ökaryotik kromatinin temel organizasyon birimi, bir histon oktamerinin etrafına ~1.7 kez sarılmış DNA'yı içeren nükleozom çekirdek parçacığıdır (NCP). Kromatin, NCP'lerin ve transkripsiyon faktörleri, kromatin yeniden şekillenmesi ve modifiye edici enzimler dahil olmak üzere çok sayıda başka protein kompleksinin varlığı olarak tanımlanır. Bu protein-DNA etkileşimlerinin, hücre döngüsünün farklı aşamalarında spesifik genomik lokuslar düzeyinde nasıl düzenlendiği hala belirsizdir. Bunun başlıca nedeni, bu tür dinamik etkileşimlerin hassas ölçümlerini elde etmeyi zorlaştıran mevcut teknik sınırlamalardır. Burada, doğal kromatin durumunda ilgilenilen tek kopyalı bir gen lokusunu izole etmek için bölgeye özgü rekombinasyonu verimli bir tek adımlı afinite saflaştırma protokolü ile birleştiren geliştirilmiş bir yöntemi açıklıyoruz. Yöntem, hedef lokusun genomik kromatin üzerinde sağlam bir şekilde zenginleştirilmesine izin vererek, bu tekniği protein etkileşimlerini tarafsız ve sistematik bir şekilde, örneğin kütle spektrometrisi ile tanımlamak ve ölçmek için etkili bir strateji haline getirir. Bu tür bileşimsel analizlere ek olarak, bu yöntemle saflaştırılan doğal kromatin, muhtemelen nükleozom konumlandırma ve histon modifikasyonları ile ilgili in vivo durumu yansıtır ve bu nedenle, mayadaki hemen hemen her genomik lokustan türetilen kromatinin daha ileri yapısal ve biyokimyasal analizlerine uygundur.

~ 1.4 kb ARS316 kromatin alanının saflaştırılmasına, yapısal olarak eksprese edilen LexA-TAP adaptör proteini aracılık etti. Negatif bir kontrol olarak hizmet etmek için, LexA-TAP'ı eksprese eden ancak entegre RS ve LexA bağlanma bölgeleri içermeyen izojenik bir suş kullanarak saflaştırmalar gerçekleştirdik. Şekil 3 , ARS316 lokusunu hedef alan hem kontrol hem de rekombinasyon yetkin bir suş üzerinde gerçekleştirilen standart bir saflaştırma deneyinden elde edilen DNA analiz sonucunu gösterm...

Bu protokol, tomurcuklanan maya, Saccharomyces cerevisiae'den doğal kromatin bağlamında ilgilenilen tek kopyalı bir gen lokusunu saflaştırmak için bölgeye özgü rekombinasyona dayalı lokusa özgü bir kromatin izolasyon yöntemi sunar.

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

Ökaryotik bir çekirdek, aynı anda meydana gelen birçok biyolojik süreçle çok kalabalıktır. Araştırmamızın kapsamı, tüm bu süreçlerin, aksi takdirde genomik kararsızlığa ve insan hastalıklarına yol açacak büyük kazalar olmadan genomlarımız üzerinde nasıl koordine edildiğini anlamaktır. Bu protokol, genomun belirli bir lokusunu doğal durumunda saflaştırmamıza izin vererek, protein DNA etkileşimlerinin ölçümleri gibi izole edilmiş materyalin hem bileşimsel hem de fonksiyonel karakterizasyonuna izin verir.Bu protokol, lokusa özgü kromatin izolasyonunun mevcut birçok sınırlamasının üstesinden gelen, hedeflenen bir lokusun muazzam düzeyde zenginleştirilmesini sağlar. Malzeme çapraz bağlanmamıştır. Bu aynı zamanda in vitro transkripsiyon veya in vitro replikasyon gibi birçok aşağı akış fonksiyonel analizine de izin verir.Bu protokol, maya kromozomlarından farklı replikasyon kökenlerini çıkarmamızı ve saflaştırmamızı sağlayarak, proteomik bir analiz yapmamıza ve yeni orijin etkileşimli kromatin faktörlerini tanımlamamıza ve dolayısıyla DNA replikasyonunun araştırma alanını ilerletmemize olanak sağladı. Bu protokol, kromatin durumlarını, histon modifikasyonlarını incelemek ve endojen kromozomlardan alınan doğal nükleozomal şablonlar üzerinde yapısal analiz yapmak için saflaştırılmış orijin materyalini kullanarak in vitro replikasyon çalışmalarını mümkün kılar ve kromatin araştırmalarını ilerletir.

single-copy-gene-locus-chromatin-purification-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu makale, ekstrakromozomal dairesel DNA'yı (eccDNA) saflaştırmak için Circle-Seq adı verilen hassas bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, kolon saflaştırmayı, kalan doğrusal kromozomal DNA'nın çıkarılmasını, yuvarlanan daire amplifikasyonunu ve yüksek verimli dizilemeyi kapsar. Circle-Seq, ökaryotik eccDNA'nın genom ölçeğinde taranması ve genom kararsızlığı ve kopya sayısı varyasyonunun incelenmesi için geçerlidir.

Ökaryotik Hücrelerde gelen ekstrakromozomal dairesel DNA genom Arıtma

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Burada, tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeüzerinden değiştirilmiş Histon Kromatin immunoprecipitation için bir protokol açıklayın. Immunoprecipitated DNA kantitatif PCR için daha sonra bereket ve Histon translasyonel modifikasyonlar genom boyunca yerelleştirilmesini sorguya eskiden.

Histon değişiklikler Saccharomyces cerevisiae üzerinden Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

CRISPR/Cas12a sistemi, tek bir crRNA dizisi ile birlikte aynı anda birden çok loci 'de S. cerevisiae genomunun verimli çok katmanlı düzenlemesini sağlar. Bu daha sonra Maya piksel sanatı oluşturmak için kullanılan karotenoid üreten maya suşları oluşturarak gösterilmiştir.

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome düzenleme Saccharomyces cerevisiae ve Maya Pixel Art oluşturulması

Burada Saccharomyces cerevisiaeartan bir kopya numarası bastırıcı ekran aracılığıyla genetik etkileşimleri belirlemek için bir protokoldür. Bu yöntem araştırmacılar, klon ve kısa ömürlü maya mutantlar test bastırıcılar sağlar. SIR2'nin kopya sayısı artışının otofaji null mutantında kullanım ömrü üzerindeki etkisini test ediyoruz.

Saccharomyces cerevisiae Kronolojik Yaşam Süresini Düzenleyen Genetik Bağlantıların Karakterizasyonu için Bastırıcı Ekran

Bu çalışma, Schizosaccharomyces pombe'de çok kopyalı baskılayıcı genetik ekran için bir protokolü açıklamaktadır. Bu ekran, bir sorgu mutant suşu ile ilişkili bir fonksiyon kaybı fenotipinin baskılayıcı klonlarını tanımlamak için genom çapında bir plazmid kütüphanesi kullanır. Bu ekran kullanılarak ell1 null mutantının yeni genetik baskılayıcıları tanımlandı.

Şizosakkaromices pombe'de Multicopy Suppressorların Tanımlanması için Genetik Ekran

Bu el yazması, mutasyonlar termo için ekran insan serotonin taşıyıcı arındırmak, yüksek afiniteli antikorların üretilmesi ve antidepresan ilaç S -citalopramın bağlı serotonin taşıyıcı-antikor kompleksi kristalize açıklamaktadır. Bu protokol için diğer zor membran ileticileri, reseptör ve kanal çalışması için adapte edilebilir.

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em&gt; S</em&gt; -citalopram

Burada, S100A12'yi (calgranulin C) ifade etmek ve saflaştırmak için bir yöntem sunuyoruz. İnsan patojen H. pylori'ye karşı antimikrobiyal aktivitesini ölçmek için bir protokolü açıklıyoruz.

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Kromatin yetişkin fare iskelet kas kas lifleri gen düzenlemesi çalışmanın Kromatin immunoprecipitation tarafından uyarlanmış üzerinden hazırlanması için yeni bir protokol sunulmuştur.

Kromatin Immunoprecipitation üzerinden fare kas iskelet için geliştirilmiş iletişim kuralı

Burada büyük ölçüde yüksek hassasiyet ile bağlama benzeşim denge ve çözüm belirlemek için yeni bir yöntem mevcut. Bu transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı kantitatif analiz artırır. Yönteminin otomatik floresans anizotropi ölçümlerde kontrollü bir iletim sistemi temel alır.

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Keşfedin, Saccharomyces cerevisiae'de tek kopya gen lokus kromatin saflaştırma yöntemini. Protein-DNA etkileşimlerini incelemek için yerel kromatin bağlamında yüksek zenginleştirme sağlar.

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

Daha fazla video keşfet