Name: Otofaji ile İlişkili 4B Sistein Peptidaz İnhibitörleri için Hücre Bazlı İlaç Taraması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Keşfedin, ATG4 sistein proteaz ailesinin otofaji düzenlenmesindeki rolünü ve kanser ile nörodejeneratif hastalıklarda yeni küçük molekül inhibitörlerinin geliştirilmesini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, MRC-UCL Üniversite Birimi Hibe Ref MC_U12266B, MRC Demans Platformu Hibesi İngiltere MR/M02492X/1, Pankreas Kanseri Birleşik Krallık (hibe referansı 2018RIF_15) ve UCL Terapötik Hızlandırma Destek programına yönelik Birleşik Krallık Tıbbi Araştırma Konseyi çekirdek finansmanı tarafından desteklenmiştir, MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054'ün finansmanıyla desteklenmiştir. ActinLC3dNGLUC'u (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) kodlayan plazmit, Dr. Robin Ketteler'den (Berlin Tıp Fakültesi İnsan Tıbbı Bölümü) elde edildi.

4B Sistein Peptidaz Otofaji İnhibitörü için Yüksek Verimli Tarama Analizi

<ol><li>Kocaturk, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+molecular+target+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a molecular target for cancer treatment.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ATG4+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Targeting ATG4 in cancer therapy.</a> Cancers. 11 (5), 649(2019).</li>
<li>Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of autophagy.</a> EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).</li>
<li>Agrotis, A., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+ATG4B+as+drug+target+for+treatment+of+solid+tumours-the+knowns+and+the+unknowns%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns.</a> Cells. 9 (1), 53(2019).</li>
<li>Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting autophagy in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).</li>
<li>Kimmelman, A. C., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+tumor+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Autophagy and tumor metabolism.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).</li>
<li>Tran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+role+of+ATG4B+as+target+for+autophagy+inhibition+in+prostate+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).</li>
<li>Pengo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+kinases+and+phosphatases+that+regulate+ATG4B+activity+by+siRNA+and+small+molecule+screening+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148(2018).</li>
<li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delipidation+of+mammalian+Atg8-family+proteins+by+each+of+the+four+ATG4+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases.</a> Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).</li>
<li>Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8L%2FApg8L+is+the+fourth+mammalian+modifier+of+mammalian+Atg8+conjugation+mediated+by+human+Atg4B%2C+Atg7+and+Atg3%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3.</a> The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).</li>
<li>Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+of+human+ATG4+protease+isoforms+in+autophagy+and+LC3%2FGABARAP+processing+revealed+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells.</a> Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).</li>
<li>Nguyen, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+family+LC3%2FGABARAP+proteins+are+crucial+for+autophagosome-lysosome+fusion+but+not+autophagosome+formation+during+PINK1%2FParkin+mitophagy+and+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).</li>
<li>Ketteler, R., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG4%3A+More+than+a+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATG4: More than a protease.</a> Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).</li>
<li>Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+roles+of+Atg4+proteases+from+autophagy+modulation+to+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy.</a> Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).</li>
<li>Fernández, ÁF., López-Otín, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+and+pathologic+relevance+of+autophagy+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The functional and pathologic relevance of autophagy proteases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).</li>
<li>Maruyama, T., Noda, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-regulating+protease+Atg4%3A+structure%2C+function%2C+regulation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition.</a> The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).</li>
<li>Ketteler, R., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+autophagy+by+luciferase+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Quantitation of autophagy by luciferase release assay.</a> Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).</li>
<li>Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+sensor+for+genome-wide+screens+of+intracellular+proteolytic+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage.</a> Genome Biology. 9 (4), 64(2008).</li>
<li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15, 14(2014).</li>
<li>Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+transgene+expression+in+primitive+hematopoietic+progenitor+cells+and+embryonic+stem+cells+efficiently+transduced+by+optimized+retroviral+hybrid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors.</a> Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu protokol, ATG4B inhibitörlerinin tanımlanması için hücre bazlı bir raportör gen testini tanımlar. Birincil isabetlerin tanımlanması, β-aktin ve dNGLUC arasında LC3B'nin tam uzunlukta açık okuma çerçevesini eksprese eden hücrelerin işlenmesi üzerine lusiferaz aktivitesine dayanır. Bu testin bazı avantajları, hücreleri parçalamadan dNGLUC'u tespit edebildiği için hassas, oldukça kantitatif ve noninvaziv olmasıdır. Bu makale, kararlı bir hücre hattı ve birincil tarama oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. P...

Otofaji, hücrelerin hücre içi homeostazı korumasına ve lizozomlar 1,2,3 yoluyla yaşlı, kusurlu veya gereksiz hücresel içerikleri parçalayarak strese yanıt vermesine izin veren korunmuş bir metabolik süreçtir. Bazı patofizyolojik koşullar altında, bu süreç, besin ve oksijen yoksunluğuna karşı çok önemli bir hücresel yanıt görevi görür ve geri dönüştürülmüş besinler ve lipitlerle sonuçlanırve hücrelerin metabolik ihtiyaçlarına uyum sağlamasına izin verir 2,3,4. Otofaji ayrıca nörodejeneratif bozukluklar, patojen enfeksiyonu ve çeşitli kanser türleri gibi çeşitli hastalıklarla ilişkili hücresel bir stres tepkisi olarak tanımlanmıştır. Kanserde otofajinin işlevi karmaşıktır ve tümörün tipine, evresine ve durumuna bağlıdır. Hasarlı hücrelerin otofajik bozunması yoluyla tümör oluşumunu baskılayabilir, ancak hipoksi, besin yoksunluğu ve sitotoksik hasargibi stresli koşullar sırasında hücre sağkalımını iyileştirerek ileri tümörlerin hayatta kalmasını da teşvik edebilir 2,4,5,6.
Birçok çalışma, otofaji inhibisyonunun bir antikanser stratejisi olarak fayda sağladığını göstermiştir. Bu nedenle, otofagozom oluşumu veya lizozomla füzyonu gibi kritik adımların inhibisyonu, kanser kontrolü için etkili bir yöntem olabilir 2,4,5,6. Artan kanıtlar, ATG4B'nin belirli patolojik durumlarda rol oynadığını göstermiştir ve potansiyel bir antikanser hedefiolarak dikkat çekmiştir 2,3,4. Örneğin, kolorektal kanser hücrelerinin ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) pozitif meme kanseri hücrelerinin, bitişik normal hücrelere göre önemli ölçüde daha yüksek ATG4B ekspresyon seviyelerinesahip olduğu gözlenmiştir 2,4. Prostat kanseri hücrelerinde, ATG4B'nin inhibisyonu, kemoterapi ve radyoterapiye hücre hattına özgü bir duyarlılıkla sonuçlandı7. Son zamanlarda, pankreatik duktal adenokarsinomun (PDAC) ATG4B inhibisyonuna karşı özellikle savunmasız olduğuna dair güçlü kanıtlar ortaya çıkmıştır. Örneğin, genetiği değiştirilmiş bir fare modelinde, ATG4B fonksiyonunun aralıklı kaybının PDAC tümör büyümesini azalttığı ve sağkalımı artırdığı gösterilmiştir 3,4. Genel olarak, ATG4B bazı kanser türlerinde yüksek oranda aşırı eksprese edilir, tümörün ilerlemesi ile ilgilidir ve kanser tedavisi direnciile bağlantılıdır 2,4,8.
Memelilerdeki ATG4 sistein proteazlarının ATG4A-ATG4D olmak üzere dört aile üyesi vardır. Bu proteinler, LC3/GABARAP (ATG8) protein ailesine 9,10,11 karşı bir miktar hedef seçicilik sergiler ve proteaz aktivitelerine12,13 bağlı olmayan ek işlevlere sahip olabilir. Ayrıca, ATG4, yeni bir translasyon sonrası modifikasyon türü olan proteinlerin ATG8-ilasyonunudüzenlemede işlev görür 11,12. ATG4B ve ana substratı LC3B en yaygın olarak çalışılanlar olsa da, otofajik ve otofajik olmayan süreçlerin düzenlenmesinde her bir alt aile üyesi için karmaşık bir rol öneren bir resim ortaya çıkmaktadır. Bu, fosforilasyon, asetilasyon, glikozilasyon ve nitrosilasyon yoluyla ATG4B aktivitesini düzenleyen karmaşık bir translasyon sonrası modifikasyon ağı ile daha da desteklenmektedir9,10,11,12,13.
Bilinen birkaç ATG4B inhibitörü yayınlanmıştır 2,4,14,15. Bunlar araştırma araçları olarak uygun olsa da, farmakodinamik profilleri, seçicilikleri veya potansiyelleri, klinik öncesi adaylar olarak gelişmelerini henüz engellemiştir 4,16. Genel olarak, daha güçlü ve seçici bileşiklerin tanımlanmasına acil bir ihtiyaç vardır. Genellikle, bileşikler protein fonksiyonunun iyi biyokimyasal inhibitörleridir, ancak hücre bazlı tahlillerdeki etkinlikleri zayıftır. Biyokimyasal yöntemler ve hücre bazlı testler dahil olmak üzere ATG4B aktivitesini izlemek için birden fazla test vardır4. Daha önce 8,17 hücrelerinde ATG4B aktivitesini izlemek için basit, lüminesans tabanlı, yüksek verimli bir test geliştirmiştik. Bu test, hücre dışı ortamda stabil ve aktif olan ve ATG4B proteolitik aktivitesine yanıt olarak hücrelerden indüklenebilir şekilde salınabilen Gaussia princeps'ten (GLUC) bir lusiferaz proteini kullanır18,19.
Bu raportör yapısında dNGLUC, hücrelerin aktin hücre iskeleti ile bağlantılıdır. β-aktin ankrajı ile dNGLUC arasına proteaza özgü bir bağlayıcı eklenebilir ve bu da sekresyonun bağlayıcının bölünmesine bağlı olmasını sağlar. LC3B bölünmesini izleyebilmek için LC3B'nin β-aktin ve dNGLUC arasında tam uzunlukta açık okuma çerçevesinikullandık 17,18,19. dNGLUC'un salgılama mekanizması tam olarak anlaşılamamış olsa da, ATG4B aktivitesini izlemek için spesifiktir, ATG5 nakavt hücrelerinde meydana geldiği gibi genel otofajiye bağlı değildir ve klasik bir sinyal peptidigerektirmeyen geleneksel olmayan mekanizmalar aracılık eder 4,18,19. Bu raporlayıcıyı küçük molekülleri ve siRNA kütüphanelerini taramak için başarıyla kullandık ve Akt protein kinazları8 gibi ATG4B aktivitesinin yeni düzenleyicilerini belirledik. Bu makale, bu lusiferaz raporlayıcının yarı otomatik, yüksek verimli bir tarama formatında kullanımı için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır.

<table><tbody><tr><td>50 ve mikro; L Tek Kullanımlık Uçlar - Filtresiz, Saf, İç İçe 8 Yığın (Pasif Yığın)</td><td>Tecan</td><td>30038609</td><td>Tek Kullanımlık 96 uçlu raf</td></tr><tr><td>BioTek MultiFlo</td><td>BioTek</td><td></td><td>toplu dağıtıcı</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-205904</td><td>substrat</td></tr><tr><td>Columbus Görüntü analiz yazılımı</td><td>Perkin Elmer</td><td>Sürüm 2.9.1</td><td>görüntü analiz yazılımı</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Yankı Nitelikli 384 Kuyulu Polipropilen Mikroplaka, Şeffaf, Steril</td><td>Olmayan Beckman Coulter</td><td>001-14555</td><td>384PP plaka</td></tr><tr><td>EnVision II</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>lüminesans plaka okuyucu</td></tr><tr><td>Ekspres seçim Kitaplığı (96 kuyulu)-L3600-Z369949-100&mikro; L</td><td>Selleckchem</td><td>L3600</td><td>Selleckchem</td></tr><tr><td>FMK9A</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-100522</td><td></td></tr><tr><td>Greiner FLUOTRAC 200 384 kuyulu plakalar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781076</td><td>katı siyah 384 oyuklu plakalar</td></tr><tr><td>Harmony Görüntüleme yazılımı</td><td>Perkin Elmer</td><td>Sürüm 5.1</td><td>görüntüleme yazılımı</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihidroklorür, Trihidrat - Suda 10 mg / mL çözelti</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>Labcyte Echo 550 serisi, Echo Cherry Pick yazılımı ile</td><td>Labcyte/Beckman Coulter</td><td></td><td>nano ölçekli akustik sıvı dağıtıcı</td></tr><tr><td>Milli-Q su</td><td></td><td></td><td>deiyonize su</td></tr><tr><td>Opera Phoenix Yüksek İçerikli Tarama Sistemi</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>otomatik mikroskop</td></tr><tr><td>Paraformaldehit çözeltisi PBS Santa Cruz'da %4</td><td> Biyoteknoloji</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate 384 kuyulu, siyah, optik olarak şeffaf düz dipli, doku kültürü ile tedavi edilmiş, kapaklar</td><td>Perkin Elmer</td><td>6057300</td><td>CellCarrier-384 Ultra PN</td></tr><tr><td>pMOWS-ActinLC3dNGLUC</td><td></td><td></td><td>Dr. Robin Ketteler'den (Berlin Tıp Fakültesi İnsan Tıbbı Anabilim Dalı)</td></tr> <tr><td>alınmıştır Polibren Enfeksiyonu / Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Merck</td><td>TR-1003-G</td><td>polibren</td></tr><tr><td>Puromisin dihidroklorür, %98, Thermo Scientific Chemicals</td><td>ThermoFisher</td><td>J61278.ME</td><td>Puromycin</td></tr><tr><td>Tecan Freedom EVO 200 robotu</td><td>Tecan</td><td></td><td>sıvı işleme robotik platformu</td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA Transfeksiyon Reaktifi Roche</td><td>Merck</td><td>6366244001</td><td>DNA transfeksiyon reaktifi</td></tr></tbody></table>

otofaji ile İlişkili 4b sistein peptidaz İnhibitörleri için hücre bazlı İlaç taraması

Cell-Based Drug Screening for Inhibitors of Autophagy Related 4B Cysteine Peptidase

Artan kanıtlar, yüksek otofajik akının tümör ilerlemesi ve kanser tedavisi direnci ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bireysel otofaji proteinlerinin tahlili, bu yolu hedefleyen terapötik stratejiler için bir ön koşuldur. Otofaji proteazı ATG4B'nin inhibisyonunun genel sağkalımı arttırdığı gösterilmiştir, bu da ATG4B'nin kanser tedavisi için potansiyel bir ilaç hedefi olabileceğini düşündürmektedir. Laboratuvarımız, hücrelerde ATG4B aktivitesini izlemek için seçici lusiferaz bazlı bir test geliştirmiştir. Bu tahlil için, ATG4B'nin substratı, LC3B, deniz kopepodu Gaussia princeps'ten (GLUC) salgılanabilir bir lusiferaz ile C-terminalinde etiketlenir. Bu raportör, aktin hücre iskeleti ile bağlantılıdır, böylece ayrılmadığında hücrelerin sitoplazmasında tutulur. ATG4B aracılı bölünme, geleneksel olmayan sekresyon yoluyla GLAC'ın salınmasına neden olur, bu daha sonra hücresel ATG4B aktivitesinin bir korelasyonu olarak hücre kültüründen süpernatanların toplanmasıyla izlenebilir. Bu makale, bu lusiferaz bazlı testin otomatik yüksek verimli taramaya uyarlanmasını sunmaktadır. Hücresel ATG4B aktivitesinin örnek niteliğindeki yüksek verimli analizi için iş akışını ve optimizasyonu açıklıyoruz.

Önceki bir yayında8, bu testi küçük molekül ve siRNA kütüphanelerini taramak için başarıyla kullandık ve ATG4B'nin yeni düzenleyicilerini tanımladık. Burada, bu lusiferaz raporlayıcının protokolünü ve temsili sonuçlarını yarı otomatik, yüksek verimli bir tarama formatında açıklıyoruz. Şekil 8 , hem hücre çekirdeği hem de lüminesans için ham veri analizinin bir örneğini göstermektedir. Lüminesans ölçümünün tipik bir sonucu Şekil 8A'da göst...

Burada, yarı otomatik, yüksek verimli bir tarama formatında lusiferaz bazlı bir raportör testinin kullanımı için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Otofaji ile İlişkili 4B Sistein Peptidaz İnhibitörleri için Hücre Bazlı İlaç Taraması

Growing evidence has shown that high autophagic flux is related to tumor progression and cancer therapy resistance. Assaying individual autophagy proteins ...

Laboratuvarımdaki araştırmanın temel amacı, otofajinin ve özellikle ATG4 sistein proteanının düzenlenmesini anlamak ve bu bilgiyi, özellikle pankreas kanseri gibi hastalıklar için bu yolu hedefleyen küçük molekül inhibitörleri geliştirmek için kullanmaktır. İlaç hedeflerini ve ilaç adaylarını belirlemek için yüksek içerikli, yüksek verimli tarama teknolojileri kullanıyoruz ve ATG4 sistein proteaz ailesine odaklanıyoruz çünkü bunun çeşitli kanser türleri için çok iyi bir ilaç hedefi olduğunu düşünüyoruz. Bir süredir ATG4 ailesi üyelerini inceliyoruz.Bu protein ailesinin ve hücrelerinin işlev bozukluğuna dair önemli keşifler yaptık. Ayrıca ATG4 ailesi üyelerinin yeni translasyon sonrası regülasyon mekanizmalarını belirledik ve şu anda kanser ve nöro dejenerasyon gibi hastalıklar için ATG4 ailelerinin küçük molekül inhibitörleri ve aktivatörleri geliştiriyoruz. Hücrelerde ATG4 proteaz aktivitesini izlemek için çok fazla test yoktur.Bu nedenle, bu aktiviteyi izlemek için lusiferaz bazlı bir test geliştiren ilk kişilerden biriydik. Ve tahlilimiz oldukça sıra dışı çünkü salgılı, diyelim ki ifade kullanıyor, bu nedenle hücreleri lisanslamamıza gerek yok ve bu protokolü yüksek verimli tarama yöntemlerine ve laboratuvar otomasyonuna kolayca uyarlayabiliriz. Bir süredir ATG4 B protein proteazına odaklandık.ATG4 ailesi üyelerinin nakavt hücre hatlarını oluşturduk. ATG4'ün yeni translasyon sonrası düzenleme mekanizmalarını tanımladık ve nihayetinde ATG4 B proteazını inhibe edebilecek ve hatta aktive edebilecek birkaç yeni küçük molekül bileşiği de belirledik. Gelecekte, ATG4 ailesi üyeleri üzerindeki çalışmalarımıza devam etmek istiyoruz.Bunun şu anda bilinmeyen ve hala ortaya çıkarılmayı bekleyen çok şey olduğunu düşünüyoruz. Örneğin, bu proteinlerin nöronlardaki otofajiyi nasıl düzenlediği şu anda tam olarak anlaşılamamıştır. Ayrıca, tanımladığımız bu küçük moleküllü bileşiklerin doğrulanmasına ve potansiyel olarak nörodejeneratif hastalıklarda aktivatörleri kullanmaya odaklanmak istiyoruz.

cell-based-drug-screening-for-inhibitors-autophagy-related-4b

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Otofaji hücreler protein ve organellerin aşağılamak ve geri dönüşüm sağlayan her yerde bulunan bir süreçtir. Biz görselleştirmek ve küçük ölçmek için gelişmiş floresan mikroskop geçerli, ama autolysosomes içine oluşumu ve autophagosomes ve lizozomlar dağılımı, ve füzyon da dahil olmak üzere otofaji indüksiyon ile ilgili temel, fiziksel değişiklikler,.

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Patojen yayılmasını karşı koymak için, konakçı hücreler bakteriler ve bölümlere Otofaji uyarabilme iskeletinin yeniden. Doku kültürü hücreleri, ev sahibi ve bu işlem altında patojen belirleyicileri kullanılarak Shigella enfeksiyonu tespit ve karakterize edilir. Shigella enfeksiyonu Zebra balığı modellerini kullanarak, keşfedilen moleküllerin ve mekanizmaların rolü in vivo incelenmiştir.

Kullanımı<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak

Burada, otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için, 3 autofagy markörün parlak detaylı görüntülerini karşılaştıran ve LC3 nokta sayımı ile birlikte lokalizasyonunu niceleyen analitik bir özelliğe sahip multispektral görüntüleme akış sitometrisi kullanılmıştır.

Multifektral Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak LC3, p62 ve LAMP1 Birlikte Lokalizasyonu Ölçülerek Otofajik Fluxın Değerlendirilmesi

Sunulan iki antikor tabanlı protein-protein etkileşimi araştırma tekniği vardır: ayirt ve immunoprecipitation. Bu teknikler proteinlerin hücresel sinyal yollar roman bileşenleri keşfi ve anlayış protein dinamikleri arasında fiziksel etkileşimleri çalışmak için uygundur.<br...

Protein-protein etkileşimlerinin Autophagy araştırma çalışma

Mitophagy, takas zarar mitokondri, süreci mitokondrial homeostazı ve sağlık bakım için gereklidir. Bu makale en son mitophagy bazılarını algılama yöntemleri insan hücreleri, Caenorhabditis elegansve fareler sunar.

Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

Memeli hücreleri toplu autophagic tutma etkinliği ölçmek için basit ve iyi doğrulanmış bir iletişim kuralı burada açıklanmıştır. Bu yöntem laktat dehidrogenaz (karaciğer) oranı miktarının toplam hücresel karaciğer düzeylere göre sedimentable hücre kesirler dayanır.

Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem

Bu kağıt akış sitometresi-tabanlı bir tahlil kimyasal inhibitörleri ekran kitaplıklarına inhibitörleri ve T hücre reseptör sinyal etkileyen hedefleri tanımlaması için kullanır. Yöntem tanımlamak burada da yüksek üretilen iş gösterimleri için genişletilebilir.

T-hücre reseptör üzerinden tarama kimyasal inhibitörü kütüphanelerin sinyal arabulucu tanımlaması

Kiaz inhibitörlerinin taranması için kendi kendine biraraya getirilen insan proteinmikrodizilerinin üretimi için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur.

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

Bu çalışmada, Herpes simpleks virüs tip-1 (HSV-1) enfekte monosit kaynaklı dendritik hücrelerde otofatik akı ile müdahale etmek için inhibitör ve siRNA tabanlı stratejiler sürünmektedir.

Herpes Simpleks Virüs Tip 1-Enfekte Monosit Türetilmiş Dendritik Hücrelerde Otofaji Modüle siRNA Elektroporasyon

Bu protokolün amacı, LC3 immünofloresan ve LC3 nokta ölçümü yoluyla pankreas kanseri ve pankreas asinar hücrelerinde otofajik düzeyleri belirlemektir.

LC3 İmmünofloresan Kullanılarak İki Farklı Pankreas Hücre Modelinde Otofaji Düzeylerinin Değerlendirilmesi

Keşfedin, ATG4 sistein proteaz ailesinin otofaji düzenlenmesindeki rolünü ve kanser ile nörodejeneratif hastalıklarda yeni küçük molekül inhibitörlerinin geliştirilmesini.

Otofaji ile İlişkili 4B Sistein Peptidaz İnhibitörleri için Hücre Bazlı İlaç Taraması

Daha fazla video keşfet