Name: İnsan Periferik Lenfositlerinde γH2AX ve 53BP1in İkili İmmünofloresansı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Öğrenin, insan periferik lenfositlerinde γH2AX ve 53BP1 fokuslarının ikili immünofloresansını kullanarak DNA çift iplikçik kırıklarını nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, genomik hasarı ölçmek ve onarım mekanizmalarını anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tam kan bağışçılarına ve kan örneklerini alan tüm sağlık personeline teşekkür ederiz.

Çalışma Pisa Üniversitesi etik kurulu tarafından onaylanmış, her donörden bilgilendirilmiş ve imzalı onam alınmıştır.
1. γH2AX ve 53BP1 odaklarının oluşumu
<ol><li>Numunelerin hazırlanması ve mutajenik tedavi<ol><li>Antikoagülan olarak lityum heparin içeren kan toplama (örneğin, Vacutainer) tüplerinde sağlıklı yetişkin bireylerden venipunktur yoluyla tam kan örnekleri toplayın.</li>
		<li>Uygun kan örneği korumasını garanti etmek için, numune alımından sonraki 24 saat içinde prosedürü başlatın.</li>
		<li>Numunenin 300 μL'sini 4.7 mL tam ortam içeren bir tüpe ekleyin (% 0.5 penisilin-streptomisin,% 0.75 fitohemaglutinin,% 10 FBS daha önce inaktive edilmiş,% 88.75 RPMI 1640).</li>
		<li>Daha sonra bleomisin sülfatı 5 μg / mL'lik bir son konsantrasyona ekleyin. DİKKAT: Bleomisin sülfat bir mutajendir. Cilt temasından ve solumaktan kaçının. Çözeltiyi hazırlayın ve numuneyi bir başlık altına ekleyin.</li>
		<li>Her numune için negatif bir kontrol ayarlayın (mutajen yokluğu).</li>
		<li>Tüpü 2 saat boyunca 37 ° C'de bir termostata yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Fiksasyon<ol><li>Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 540 x g'de santrifüj edin.</li>
		<li>Süpernatantı aspire edin ve peleti vorteks ile yeniden askıya alın.</li>
		<li>Kırmızı kan hücrelerinin hemolizine neden olmak için 5 mL hipotonik çözelti (500 mL deiyonize suda çözünmüş 2.87 g KCl) ve 400 μL pre-fiksatif çözelti (5: 3 asetik asit: metanol) ekleyin.</li>
		<li>Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 540 x g'de santrifüj edin.</li>
		<li>Süpernatantı aspire edin ve hücreleri sabitlemek için peleti oda sıcaklığında 5 mL metanol içinde en az 30 dakika boyunca yeniden askıya alın.</li>
		<li>Alternatif olarak, hücreleri kullanana kadar -20 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Slayt hazırlama<ol><li>Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 540 x g'de santrifüj edin.</li>
		<li>Süpernatantı aspire edin ve peleti 3: 1 metanolün 5 mL'sinde yeniden askıya alın: asetik asit çözeltisi. Bu adımları bir kez daha yineleyin.</li>
		<li>Sonunda, çözeltiyi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 540 x g'de tekrar santrifüj edin.</li>
		<li>Pelet, pipeti kuvvetli bir şekilde askıya almak, yeniden askıya alınmış hücre peletini slaytlara bırakmak ve havayla kurutmak için yeterli çözelti (0.5 mL) bırakarak süpernatantı tekrar aspire edin. Slaytları 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>İmmünofloresan NOT: İmmünofloresan, hedefin kendisini bağlayan bir primer antikor ve hedef11'in lokalizasyonuna izin veren primere bağlanan bir floresan sekonder antikor kullanarak spesifik hücre hedeflerini tanımlamak için immünolojik bir yöntemdir. Bu durumda, birincil antikorlar olarak bir fare monoklonal anti-53BP1 (1:50) ve bir tavşan poliklonal anti-γH2AX (1:50) kullanılırken, ikincil antikorlar olarak sırasıyla AlexaFluor568 anti-fare (1:400) ve DyLight488 anti-tavşan (1:200) kullanılır.<ol><li>Slaytları iki kez 50 mL 1x PBS içinde 5 dakika boyunca kuplin kavanozda yıkayın (arka arkaya 16 slayt).</li>
		<li>Daha sonra bunları bloke edici çözeltide 30 dakika bekletin (10 mL FBS, 10 mL 10x PBS, 80 mL deiyonize su, 300 μL Triton-X).</li>
		<li>Her slayta, blokaj çözeltisinde çözünmüş birincil antikorları içeren iki çözeltinin her birinin 10 μL'sini ekleyin. Slaytları parafin bantla örtün ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Kuluçkadan sonra, 5 dakika boyunca 1x PBS'de üç yıkama yapın.</li>
		<li>Her slayta, blokaj çözeltisinde çözünmüş ikincil antikorları içeren iki çözeltinin her birinin 10 μL'sini ekleyin. Slaytları parafin bantla örtün ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.</li>
		<li>5 dakika boyunca 1x PBS'de üç yıkama yapın.</li>
		<li>Çekirdekleri boyamak için montajdan önce kapaklara DAPI ile 2,5 μL antifade çözeltisi ekleyin. NOT: Fok kinetiği değerlendirmek için, prosedür 1.1 ila 1.4 arasında tarif edilenle aynıdır, hücre hasadı ve ikili immünofloresansın 0 saatte, bleomisin tedavisinden 2 saat sonra ve daha sonra mutajeni çıkardıktan sonra, tedavi sonrası 4 saat, 6 saat ve 24 saatte gerçekleştirildiğini belirtmektedir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Floresan mikroskobu ile analiz
NOT: "Floresan mikroskobu", bir görüntü oluşturmak için floresan kullanan herhangi bir mikroskopu ifade eder. Örnek, floroforlar tarafından emilen belirli bir dalga boyundaki (veya dalga boylarındaki) ışıkla aydınlatılır ve bu da daha uzun dalga boylarında ışık yaymalarına neden olur12. AlexaFluor568 ve DyLight 488, sırasıyla yaklaşık 568 ve 488 nm ışığı emer ve sırasıyla 603 ve 520 nm ışık yayar. Böylece, sırasıyla bir TRITC veya bir FITC filtresi kullanılarak kırmızı veya yeşil floresan olarak görülebilirler.
<ol><li>Her slayttaki odakların varlığını 100x daldırma hedefi altında puanlayın (Şekil 1).</li>
	<li>Slayt başına 200 çekirdek puanlayın ve her çekirdekteki γH2AX/53BP1 odaklarının sayısını sayın.</li>
	<li>Ekspresyon sonuçları, puanlanan toplam çekirdek başına ortalama odak sayısı açısından ifade eder. Bunlar arasında hem γH2AX/53BP1 pozitif (en az bir floresan sinyali gösteren) hem de negatif (herhangi bir floresan sinyali göstermeyen) çekirdekler bulunur.</li>
</ol>

<ol><li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+damage%2C+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).</li>
<li>Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+response+to+double-strand+DNA+breaks+and+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair.</a> Cells. 9 (8), 1853(2020).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Dickey, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Her, J., Bunting, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cells+ensure+correct+repair+of+DNA+double-strand+break%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%2C+Thematic+Minireview%22%5BJournal%5D)">How cells ensure correct repair of DNA double-strand break.</a> Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).</li>
<li>Kuo, L. K., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).</li>
<li>Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+the+53BP1+protein+in+genome+protection%3A+structural+and+functional+characteristics+of+53BP1-dependent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair.</a> Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).</li>
<li>Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+microscopy+of+%CE%B3H2AX+and+53BP1+for+analyzing+the+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), 56617(2017).</li>
<li>Jezkova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particles+with+similar+LET+values+generate+DNA+breaks+of+different+complexity+and+reparability%3A+a+high-resolution+microscopy+analysis+of+%CE%B3H2AX%2F53BP1+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci.</a> Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).</li>
<li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+nuclear+phosphorylation+%28%CE%B3-H2AX%29+in+human+lymphocytes+treated+in+vitro+with+UVB%2C+bleomycin+and+mitomycin+C%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C.</a> Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).</li>
<li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li>
<li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanderson%2C+MJ+%22Fluorescence+microscopy%22">Fluorescence microscopy</a>. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of the cell membrane.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Hecht, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleomycin%3A+New+perspectives+on+the+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action.</a> Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).</li>
<li>Fei, P., El-Deiry, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P53+and+radiation+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">P53 and radiation responses.</a> Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).</li>
<li>Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+ionizing+radiation-induced+DNA+double-strand+breaks+by+non-homologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining.</a> Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).</li>
<li>Palla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX%3A+Can+it+be+established+as+a+classical+cancer+prognostic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor.</a> Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931(2017).</li>
<li>Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwaves+from+GSM+mobile+telephones+affect+53BP1+and+gamma-H2AX+foci+in+human+lymphocytes+from+hypersensitive+and+healthy+persons%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons.</a> Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).</li>
<li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+damage+in+peripheral+lymphocytes+of+obese+and+overweight+Italian+children+as+evaluated+by+the+%CE%B3-H2AX+focus+assay+and+micronucleus+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test.</a> The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).</li>
<li>Shanbhag, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+neuronal+accumulation+of+DNA+double-strand+breaks+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communication%22%5BJournal%5D)">Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77(2019).</li>
<li>Lassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+of+gamma-H2AX+and+53BP1+DNA+repair+foci+in+blood+cells+after+radioiodine+therapy+of+differentiated+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).</li>
<li>Derlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+%CE%B3-H2AX+and+53BP1+foci+in+peripheral+blood+lymphocytes+to+predict+subclinical+hematotoxicity+and+response+in+somatostatin+receptor-targeted+radionuclide+therapy+for+advanced+gastroenteropancreatic+neuroendocrine+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors.</a> Cancers (Basel). 13 (7), 1516(2021).</li>
<li>Djuzenova, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitivity+in+breast+cancer+assessed+by+the+histone+%CE%B3-H2AX+and+53BP1+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci.</a> Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).</li>
<li>Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+DNA+double-strand+breaks+-+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

γH2AX ve 53BP1 odaklarının immünofloresan analizi, bir hücre sisteminin fazlar arası çekirdeklerinde genomik hasarı değerlendirmek için uygun bir yöntemdir. Bu prosedür, deneylerin sonucunu, özellikle fiksasyon ve geçirgenlikte kullanılan ajanları, antikorların tipini ve seyreltme faktörlerini ve mutajenin konsantrasyonunu etkileyebilecek birkaç kritik noktaya sahiptir.
İmmünofloresan yöntemi, esas olarak protein olan antijenleri tanımlamayı beklediği için protein bütünlüğünün korunması esastı...

DNA hasarı, hücresel oksidatif metabolizma tarafından üretilen ROS veya hem kimyasallar hem de fiziksel1 gibi eksojen olabilen ajanlar tarafından sürekli olarak indüklenir. En zararlı lezyonlar arasında, çift iplikçik kırılmaları (DSB'ler) genomik instabiliteye katkıda bulunmada temel bir rol oynar, çünkü bunlar karsinogenez sürecini başlatabilen kromozom anormalliklerine neden olurlar. Böylece hücrelere DSB'lerin onarımı2'nin karmaşık ve verimli mekanizmaları sağlanır.
Bir DSB meydana geldiğinde, hücre, MRE11 / RAD50 / NBS1 kompleksi ile birlikte, hücre döngüsü3'ü yavaşlatan veya durduran diğer proteinleri aktive etmek için ATM veya ATR kinazların işe alındığı DNA hasar yanıtını (DDR) tetikler. Bu kinazların temel bir hedefi, DSB'lerden (yani γH2AX) birkaç megabaz içinde Ser-139 üzerinde fosforile edilen histon H2AX'tir, böylece diğerlerinin yanı sıra BRCA1 ve p53 bağlayıcı protein 1 (53BP1)3 gibi çeşitli onarım faktörlerinin işe alınmasına izin verir. Daha sonra,DSB'leri 4,5'i onarmak için homolog rekombinasyon (HR), homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya tek iplikli tavlama (SSA) arasında bir yol tetiklenir. Bu nedenle, 53BP1, İK veya NHEJ arasındaki seçimi dikte etmede, esas olarak HR6 yerine NHEJ'nin aktivasyonunu teşvik etmede rol oynar. Dahası, hem H2AX histonun hem de 53BP1'in fosforile edilmiş formu, DSB'lerin bölgelerinde odaklar oluşturabilir. Bu odaklar, çift ipliğin bütünlüğü geri kazanılana kadar devam ettiğinden, γH2AX veya 53BP1 odaklarının bir zaman aralığında ortaya çıkışını / kaybolmasını değerlendirmek, bir hücre sisteminde DSB'lerin oluşumunu ve onarımını değerlendirmek için yararlı bir yöntem olarak kabul edilir 6,7. Bununla birlikte, yukarıda tarif edilen moleküler süreçlere göre, γH2AX ve 53BP1 odaklarının DDR8,9 sırasında DSB'lerin yakınında birlikte lokalize olması beklendiğinden, bu belirteçlerin varlığını çift immünofloresanda eşzamanlı olarak tespit etmek yararlı olabilir.
Bu nedenle, bu makalenin amacı, radyomimetik ajan bleomisin tarafından insan periferik lenfositlerinde indüklenen genomik hasarı değerlendirmek için γH2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı nicelleştirilmesinin uygunluğunu değerlendirmektir. Aynı metodolojiyi kullanarak, bleomisin kaynaklı DSB'lerin onarım kinetiğini daha önce kurulmuş deneysel bir prosedür10'a göre tanımlamaya çalıştık.

<table><tbody><tr><td>AlexaFluor 568 keçi anti-fare IgG (&gama; 1)</td> <td>İnvitrojen</td><td>A21124</td><td>53BP1 ikincil antikoru</td></tr><tr><td>Bleoprim</td><td>Sanofi</td><td></td><td>bleomisin sülfat (mutajen)</td></tr> <tr><td>Penisilin-streptomisin çözeltisi Kültür</td><td></td><td>ortamı PBS için antibiyotikler</td><td>ECB3001D</td></tr><tr><td>10X</td><td>Termofisher</td><td>14200075</td><td>Fosfat tamponlu salin</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Euroclone</td><td>EC20180L</td><td>Fetal Sığır Serumu immünofloresan için</td></tr><tr><td>Keçi tavşan önleyici IgG (H + L) DyLight 488 Coniugated</td><td>Termofisher</td> <td># 35552</td> <td>& gama; H2AX ikincil antikoru</td></tr><tr><td>Fare anti-53BP1 monoklonal antikoru</td><td>Merck</td><td>MAB 3802</td><td>53BP1 birincil antikoru</td></tr><tr><td>Labophot 2</td><td>Nikon</td><td></td><td>Floresan mikroskobu</td></tr><tr><td>P-histon H2AX (Ser139) tavşan antikoru</td><td>Hücre Sinyali</td> <td># 2577</td> <td>ve gama; H2AX birincil antikoru</td></tr><tr><td>Fitohemoaglutinin</td><td>Termofisiher</td><td>R30852801</td><td>kültür ortamının bileşeni</td></tr><tr>DAPI Hücre Sinyali ile altın<td>antifade reaktifini</td><td>uzatın</td><td>#8961</td><td>Karşı boyama için DAPI ile antifade çözeltisi</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td>Kültür ortamı</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Noniyonik deterjan geçirgenlik</td></tr></tbody></table>

İnsan periferik lenfositlerinde γh2ax ve 53bp1'in İkili İmmünofloresansı

Dual Immunofluorescence of &#947;H2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes

Çift iplikçik kopmaları (DSB'ler), hücre çekirdeğinde meydana gelebilecek en ciddi lezyonlardan biridir ve onarılmazsa, kanser de dahil olmak üzere ciddi sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, hücreye DSB'leri onarmak için karmaşık mekanizmalar sağlanır ve bu yollar Ser-139 (yani γH2AX) ve p53 bağlayıcı protein 1'de (53BP1) fosforile edilmiş formunda histon H2AX'i içerir. Her iki protein de DSB'lerin bölgelerinde odaklar oluşturabildiğinden, bu belirteçlerin tanımlanması hem DSB'leri hem de onarım kinetiğini incelemek için uygun bir yöntem olarak kabul edilir. γH2AX ve 53BP1 odaklarının oluşumuna yol açan moleküler süreçlere göre, iki DNA hasar belirtecinin aynı anda tespiti ile DSB'lerin nicelleştirilmesine izin veren alternatif bir yaklaşım oluşturmak için DSB'lerin yakınındaki ko-lokalizasyonlarını araştırmak daha yararlı olabilir. Bu nedenle, bu protokol, radyomimetik ajan bleomisin tarafından insan lenfositlerinde indüklenen genomik hasarı, ikili immünofloresansta γH2AX ve 53BP1 odaklarının varlığı yoluyla değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Bu metodolojiyi kullanarak, bleomisin kaynaklı DSB'lerin onarım kinetiğini incelemek için bir ön girişim olarak, zaman içinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının sayısındaki değişimi de tanımladık.

Periferik lenfositlerin floresan mikroskop analizi ile elde edilen veriler, üç ana yönü değerlendirmemize izin verir: bleomisin tedavisinin, mutajenik etkisinden dolayı γH2AX ve 53BP1 odaklarının (ve dolayısıyla DSB'lerin) sayısını arttırmadaki etkinliği, her iki odağın da DSB'lerin bölgesinde ne ölçüde birlikte lokalize olduğu ve bleomisin kaynaklı DSB'lerin onarım kinetiğini tanımlamak için γH2AX ve 53BP1 odaklarının zaman seyri. Beklendiği gibi, tedavi edilmemiş ve tedavi edilmiş hücreler arasında hem γH2AX hem de 53B...

Bu protokol, bleomisin ile tedavi edilen insan periferik lenfositlerinin interfaz çekirdeklerinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı tespiti yoluyla DNA çift iplikçik kırılmalarının oluşumunu ve onarımını değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır.

İnsan Periferik Lenfositlerinde γH2AX ve 53BP1'in İkili İmmünofloresansı

Double strand breaks (DSBs) are one of the most severe lesions that can occur in cell nuclei, and, if not repaired, they can lead to severe outcomes, ...

Bu makalenin amacı, bleomisin tarafından insan periferik lenfositlerinde indüklenen genomik hasarı değerlendirmek için Gama H2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı nicelleştirilmesinin uygunluğunu değerlendirmektir. Çeşitli faktörler çift iplikçik kopmalarına neden olabilir. Böylece hücrelere, hem Gama H2AX hem de 53 Bağlayıcı Protein 1'i içeren, çift iplikçik kırılmasının yakınında birlikte lokalize olabilen çeşitli onarım mekanizmaları sağlanır.Tam kan örneklerini topladıktan sonra, 4.7 mililitre tam ortam içeren bir tüpe 300 mikrolitre numune ekleyin. Daha sonra mililitre bleomisin sülfat nihai konsantrasyonu başına beş mikrogram ekleyin. Her örnek için bir negatif denetim ayarlayın.Tüpü iki saat boyunca 37 santigrat derecede bir termostata koyun. Numuneleri beş dakika boyunca 540 G'de santrifüj edin. Daha sonra pelet üzerine beş mililitre hipotonik çözelti ekleyin.Daha sonra hemolize neden olmak için 400 mikrolitre pre fiksatif çözelti ekleyin. Numuneleri beş dakika boyunca 540 G'de santrifüj edin, ardından hücreleri sabitlemek için peletleri oda sıcaklığında beş mililitre metanol içinde en az 30 dakika boyunca tekrar askıya alın. Numuneleri beş dakika boyunca 540 G'de santrifüj edin, ardından peletleri beş mililitre fiksatif çözelti içinde tekrar askıya alın.Bu adımı bir kez daha yineleyin. Beş dakika boyunca tekrar 540 G'de santrifüj yapın, ardından süpernatantı aspire edin, pelet süspansiyonu için yeterli çözelti bırakın. Yeniden askıya alınmış hücre peletini slaytların üzerine bırakın.Anti-Gama H2AX ve anti-53BP1 primer antikorlarını içeren iki çözeltiyi bloke edici çözelti içinde çözünmüş olarak hazırlayın. Ardından slaytları PBS 1X'te iki kez yıkayın. Ardından slaytları engelleme çözeltisinde 30 dakika tutun.Her slayta, blokaj çözeltisi içinde çözünmüş birincil antikorları içeren iki çözeltinin her birinin 10 mikrolitresini ekleyin. Slaytları parafilmle örtün. Gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Kuluçkadan sonra, PBS 1X'te beş dakika boyunca üç yıkama yapın. DyLight 488 ve Alexa Fluor 568 sekonder antikorlarını içeren iki çözeltiyi bloke edici çözelti içinde çözünmüş olarak hazırlayın. Daha sonra her slayta, blokaj çözeltisi içinde çözünmüş ikincil antikorları içeren iki çözeltinin her birinden 10 mikrolitre ekleyin.Slaytları parafilmle örtün ve iki saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bu ikinci inkübasyondan sonra, PBS 1X'te beş dakika boyunca üç yıkama yapın. Çekirdeklerin lekelenmesine karşı koymak için montajdan önce kapak fişlerinin üzerine DAPI ile 2,5 mikrolitre Antifade çözeltisi ekleyin.Odakları kinetik olarak değerlendirmek için, prosedür şimdi tarif edilenle aynıdır. Son aşama, odakların gözlemlenmesi ve nicelleştirilmesidir. Gama H2AX ve 53BP1 odakları olmayan insan lenfositleri A, B ve C'de, farklı miktarlarda Gama H2AX ve 53BP1 odaklarına sahip insan lenfositleri gösterilmiştir.Düşük düzeyde odaklar ko-lokalizasyon gözlenir. Beklendiği gibi, tedavi edilmemiş hücreler arasında hem Gama H2AX hem de 53BP1 odaklarının çok daha yüksek bir frekansı gözlenir. Ayrıca, iki belirtecin odak sayısında büyük bir fark gözlenir.Gama H2AX ve 53BP1 odaklarının zaman içindeki seyri, aynı işleve katkıda bulunmalarına rağmen farklı bir davranış göstermiştir. Gama H2AX ve 53BP1 odakları analizi, hücresel yanıtı maruz kalma veya patolojik bağlamlarda değerlendirme yeteneğine sahiptir. Bununla birlikte, Gama H2AX ve 53BP1 çift immünofloresan, olayın gerçek sıklığını hafife almaya neden olabilir.

dual-immunofluorescence-h2ax-53bp1-human-peripheral

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bir moleküler marker olarak γH2AX oluşumu kullanarak DNA çift iplikli çizgiler Niceleme radyasyon biyoloji paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada hücreler radyasyona maruz kaldıktan sonra γH2AX odakları ölçümü için immünofloresan testinin kullanımını göstermek.

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

ΓH2AX odaklarının dayanarak DNA çift iplikli sonlarının kantitasyonu doku radiosensitivity ve radyasyon değiştirerek bileşikler etkileri değerlendirilmesi için, özellikle radyasyon biyoloji, paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada doku örnekleri γH2AX odaklarının kantitatif bir immünofloresan testinin kullanımını göstermek.

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

DNA çift iplikli tatili yanıt Ser-139 H2AX fosforilasyon aşağıdaki formu γH2AX odakları, mikroskobik analiz radyasyon biyoloji paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada çekirdeğin içinde radyasyona bağlı γH2AX oluşumu uzamsal dağılımını değerlendirmek için, aktif transkripsiyonu ökromatin bir epigenetik işaretleyici olarak mono-metil histon H3 lizin 4 antikor kullanılır.

Radyasyondan aşağıdaki γH2AX Mekansal Dağılımı Değerlendirilmesi

Bu videoda, insan mononükleer hücrelerinde DNA çift sarmallı kırılma bölgelerinde lokalize olan spesifik DNA hasar yanıt proteinlerini tespit etmek için immünofloresan mikroskopi tekniğini açıklıyoruz. Proteinler, spesifik birincil antikorlar tarafından tanınır ve bu antikorlar, mikroskobik görselleştirme sırasında floresan olan florofor etiketli ikincil antikorlara bağlanır ve proteinlerin hücre çekirdeği içinde farklı floresan odaklar olarak görselleştirilmesini sağlar.

DNA Çift İplikli Kırılmaların Analizi için İmmünofloresan Mikroskobu

Bu el yazması bir iletişim kuralı tarafından γH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu DNA çift iplikli kırılmalara analiz için sağlar.

ΓH2AX ve 53BP1 oluşumu ve DNA çift iplikli kırılmalara tamiri analiz etmek için ayirt mikroskobu

Çift iplikli kırılmalara DNA tamiri lezyon ele sonra sadece onarım kompleksleri, tatili, aynı zamanda onların çözünürlük oluşumu gerektiren dinamik bir süreçtir. Burada, ayirt mikroskobu geçici ve uzun ömürlü çift iplikçikli tatili için bir araç olarak bu genom bakım mekanizma incelemek için kullanırız.

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

Bor nötron yakalama terapisinde (BNCT) kullanılan nötron karışık ışınıile aktive edilen radyasyona bağlı DNA hasar tepkisi tam olarak belirlenmemiştir. Bu protokol, nötron-karışık ışın ile ışınlama sonra insan kolon kanseri hücre hatlarında immünofloresan boyama tarafından onarım proteinlerinin radyasyonkaynaklı foci (RIF) tespit etmek için adım adım bir prosedür sağlar.

İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinde DNA Hasarı ve Onarım Foci İmmünofloresan Görüntüleme

DNA hasarının ardından, insan hücreleri genomlarının bütünlüğünü geri yüklemek için gerekli onarım yollarını aktive ederler. Burada, dolaylı immünoffloresan yöntemini DNA onarım proteinlerini tespit etmek, mekansal ve zamansal işe alımlarını analiz etmek ve DNA hasarı nın olduğu yerlerde protein-protein etkileşimini sorgulamaya yardımcı olmak için bir araç olarak tanımlıyoruz.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

Bu protokol, periferik kan lenfositleri üzerinde γ-H2AX odak analizinin slayt hazırlanmasını ve otomatik puanlamasını sunar. Tahlil yöntemini ve hassasiyetini göstermek için, izole lenfositler in vitroışınlandı. Dna DSB algılamanın bu otomatik yöntemi, hızlı ve yüksek verimli biyolojik dozimetri uygulamaları için yararlıdır.

İnsan Periferik Kan Lenfositlerinde γ-H2AX Odak Analizi için Otomatik Mikroskobik Puanlama Yöntemi

Burada, DNA hasar bölgelerinde protein etkileşiminin tespiti için basit ve hızlı bir protokol sunuyoruz.

DNA Hasar Bölgelerindeki Proteinleri Lokalize Etmek için Yakınlık Ligand Testi

Öğrenin, insan periferik lenfositlerinde γH2AX ve 53BP1 fokuslarının ikili immünofloresansını kullanarak DNA çift iplikçik kırıklarını nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, genomik hasarı ölçmek ve onarım mekanizmalarını anlamak için değerlidir.

İnsan Periferik Lenfositlerinde γH2AX ve 53BP1'in İkili İmmünofloresansı

Daha fazla video keşfet