İnsan Periferik Lenfositlerinde γH2AX ve 53BP1'in İkili İmmünofloresansı
14 Temmuz 2023
Bu protokol, bleomisin ile tedavi edilen insan periferik lenfositlerinin interfaz çekirdeklerinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı tespiti yoluyla DNA çift iplikçik kırılmalarının oluşumunu ve onarımını değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır.
Bu makalenin amacı, bleomisin tarafından insan periferik lenfositlerinde indüklenen genomik hasarı değerlendirmek için Gama H2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı nicelleştirilmesinin uygunluğunu değerlendirmektir. Çeşitli faktörler çift iplikçik kopmalarına neden olabilir. Böylece hücrelere, hem Gama H2AX hem de 53 Bağlayıcı Protein 1'i içeren, çift iplikçik kırılmasının yakınında birlikte lokalize olabilen çeşitli onarım mekanizmaları sağlanır.
Tam kan örneklerini topladıktan sonra, 4.7 mililitre tam ortam içeren bir tüpe 300 mikrolitre numune ekleyin. Daha sonra mililitre bleomisin sülfat nihai konsantrasyonu başına beş mikrogram ekleyin. Her örnek için bir negatif denetim ayarlayın.
Tüpü iki saat boyunca 37 santigrat derecede bir termostata koyun. Numuneleri beş dakika boyunca 540 G'de santrifüj edin. Daha sonra pelet üzerine beş mililitre hipotonik çözelti ekleyin.
Daha sonra hemolize neden olmak için 400 mikrolitre pre fiksatif çözelti ekleyin. Numuneleri beş dakika boyunca 540 G'de santrifüj edin, ardından hücreleri sabitlemek için peletleri oda sıcaklığında beş mililitre metanol içinde en az 30 dakika boyunca tekrar askıya alın. Numuneleri beş dakika boyunca 540 G'de santrifüj edin, ardından peletleri beş mililitre fiksatif çözelti içinde tekrar askıya alın.
Bu adımı bir kez daha yineleyin. Beş dakika boyunca tekrar 540 G'de santrifüj yapın, ardından süpernatantı aspire edin, pelet süspansiyonu için yeterli çözelti bırakın. Yeniden askıya alınmış hücre peletini slaytların üzerine bırakın.
Anti-Gama H2AX ve anti-53BP1 primer antikorlarını içeren iki çözeltiyi bloke edici çözelti içinde çözünmüş olarak hazırlayın. Ardından slaytları PBS 1X'te iki kez yıkayın. Ardından slaytları engelleme çözeltisinde 30 dakika tutun.
Her slayta, blokaj çözeltisi içinde çözünmüş birincil antikorları içeren iki çözeltinin her birinin 10 mikrolitresini ekleyin. Slaytları parafilmle örtün. Gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, PBS 1X'te beş dakika boyunca üç yıkama yapın. DyLight 488 ve Alexa Fluor 568 sekonder antikorlarını içeren iki çözeltiyi bloke edici çözelti içinde çözünmüş olarak hazırlayın. Daha sonra her slayta, blokaj çözeltisi içinde çözünmüş ikincil antikorları içeren iki çözeltinin her birinden 10 mikrolitre ekleyin.
Slaytları parafilmle örtün ve iki saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bu ikinci inkübasyondan sonra, PBS 1X'te beş dakika boyunca üç yıkama yapın. Çekirdeklerin lekelenmesine karşı koymak için montajdan önce kapak fişlerinin üzerine DAPI ile 2,5 mikrolitre Antifade çözeltisi ekleyin.
Odakları kinetik olarak değerlendirmek için, prosedür şimdi tarif edilenle aynıdır. Son aşama, odakların gözlemlenmesi ve nicelleştirilmesidir. Gama H2AX ve 53BP1 odakları olmayan insan lenfositleri A, B ve C'de, farklı miktarlarda Gama H2AX ve 53BP1 odaklarına sahip insan lenfositleri gösterilmiştir.
Düşük düzeyde odaklar ko-lokalizasyon gözlenir. Beklendiği gibi, tedavi edilmemiş hücreler arasında hem Gama H2AX hem de 53BP1 odaklarının çok daha yüksek bir frekansı gözlenir. Ayrıca, iki belirtecin odak sayısında büyük bir fark gözlenir.
Gama H2AX ve 53BP1 odaklarının zaman içindeki seyri, aynı işleve katkıda bulunmalarına rağmen farklı bir davranış göstermiştir. Gama H2AX ve 53BP1 odakları analizi, hücresel yanıtı maruz kalma veya patolojik bağlamlarda değerlendirme yeteneğine sahiptir. Bununla birlikte, Gama H2AX ve 53BP1 çift immünofloresan, olayın gerçek sıklığını hafife almaya neden olabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, bleomisinle işlem görmüş insan periferik lenfositlerinin interfaz çekirdeklerinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının eş zamanlı tespiti aracılığıyla DNA çift zincir kırıklarının oluşumunun ve onarımının değerlendirilmesi için bir yöntem sunmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Genomik
Arka Plan
- Çift zincir kırılmaları çeşitli faktörler tarafından indüklenebilir.
- Hücreler, DNA hasarı için birden fazla onarım mekanizmasına sahiptir.
- γH2AX ve 53BP1, DNA onarımında görev alan temel proteinlerdir.
- Bu proteinlerin ko-lokalizasyonu çift zincir kırılmalarının yakınında meydana gelir.
Çalışmanın Amacı
- γH2AX ve 53BP1 odaklarının eş zamanlı kantifikasyonunun uygunluğunu değerlendirmek.
- İnsan periferik lenfositlerindeki genomik hasarı belirlemek.
- Bleomisinlerin DNA bütünlüğü üzerindeki etkilerini anlamak.
Kullanılan Yöntemler
- İnsan deneklerden tam kan örnekleri toplanır.
- Örnekler bleomisin sülfat ile işleme tabi tutulur.
- Karşılaştırma için negatif kontroller oluşturulur.
- İnterfaz çekirdeklerinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının saptanması gerçekleştirilir.
Ana Sonuçlar
- γH2AX ve 53BP1 odaklarının eş zamanlı tespiti mümkündür.
- Bleomisin uygulaması, ölçülebilir DNA hasarına yol açar.
- Odakların nicelendirilmesi, genomik hasarın boyutu ile korelasyon gösterir.
- Sonuçlar, bu yöntemin DNA onarım mekanizmalarının değerlendirilmesinde kullanımını desteklemektedir.
Sonuçlar
- Protokol, DNA çift zincir kırılması oluşumunu ve onarımını etkili bir şekilde değerlendirir.
- γH2AX ve 53BP1'in eş zamanlı tespiti değerli bilgiler sağlar.
- Bu yöntem, DNA hasarı ve onarımı üzerine yapılan çeşitli çalışmalarda uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
İnsan lenfositlerinde DNA çift zincir kırığı (DSB) belirteçleri olan γH2AX ve 53BP1'in kantitatif tespiti, genomik hasarın ve onarım kinetiğinin hassas bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır. Bu çift immunofloresan yaklaşım, erken genotoksisite taramasında ve aday bileşikler için mekanistik risk azaltma süreçlerinde öngörü güvenilirliğini artırır. Bu okumaların keşif aşamasına entegre edilmesi, riske göre ayarlanmış portföy kararlarını ve translasyonel sürekliliği destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- İnsan hücrelerindeki DNA hasar yanıt yolaklarının doğrudan sorgulanmasına olanak tanır.
- DSB indüksiyonunu ve onarım kinetiğini nicelleştirerek mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Genom stabilitesinde yer alan hedeflerin fonksiyonel doğrulamasını kolaylaştırır.
- Öncü bileşiklerdeki genotoksisite riskleri için öngörü güvenilirliğini artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Primer insan hücrelerinde DNA hasarı belirteçlerinin nicelleştirilmesi için valide edilmiş bir sistem sağlar.
- Bileşik kaynaklı DSB'ler için tekrarlanabilir, kantitatif okumalar sağlar.
- DNA hasarı modülatörlerinin yüksek içerikli taraması için analiz standardizasyonunu destekler.
- Erken taramalarda bileşik güvenlik profillerinin güvenilir şekilde değerlendirilmesini kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- DNA hasarı belirteç miktar tayinini, translasyonel biyobelirteç stratejileriyle uyumlu hale getirir.
- In vitro keşiften preklinik güvenlik değerlendirmesine kadar olan sürekliliği destekler.
- Olumlu DNA onarım profillerine sahip adayların, riske göre ayarlanmış şekilde ilerlemesini sağlar.
- Hastalık ve tedavi ile ilgili hücresel yanıtlar hakkında mekanistik içgörü sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu çift immunofloresan yöntemi, erken keşif ile preklinik süreçler arasındaki sürekliliğe konumlanarak, insan lenfositlerinde DNA hasarı ve onarımının hipotez odaklı değerlendirilmesine olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: DNA onarım yolu etkileşimini ve biyolojik risk azaltmayı netleştirmek için DSB marker odaklarını nicelendirir.
- Tarama: Bileşik genotoksisite profillemesi için tekrarlanabilir, nicel çıktılar sağlar.
- Analitikler: Karşılaştırmalı analiz için γH2AX ve 53BP1 odaklarının zaman seyri ölçümlerini sunar.
- Translasyonel Araştırma: In vitro bulguları, DNA hasar yanıtı için preklinik biyobelirteç stratejileriyle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Keşif programları genelinde DNA hasar değerlendirmesi için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: DNA hasarı değerlendirmesinde öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik için DSB belirteçlerinin nicelendirilmesini standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Devam/dur kararlarına temel oluşturur ve genotoksisite için geç aşama biyolojik riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: DNA onarım profillerine göre adayların riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- İmmünofloresan mikroskopi ve kantitatif görüntü analizi konusunda uzmanlık gerektirir.
- Valide edilmiş antikorlara ve floresan görüntüleme altyapısına erişim gereklidir.
- Numune hazırlama ve kantifikasyon protokollerinin ekipler arası standartlaştırılması gerekir.
- Farklı hücre tipleri veya model sistemleri için adaptasyon gerekebilir.
- Marker ko-lokalizasyon sınırlamaları nedeniyle gerçek DSB frekansının olduğundan düşük tahmin edilmesi olasılığı vardır.
