A Validatable Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of Adeno-Associated Viral Vectors in Bioshedding Studies of Tears

Bryanna Longacre; Amanda Souaysene; Carrie A. Vyhlidal; Matthew R. Pennington

doi:10.3791/65495

Gözyaşlarının Biyodökülme Çalışmalarında Adeno-İlişkili Viral Vektörlerin Tespiti için Doğrulanab...

JoVE Journal
Biology

This content is Free Access.

JoVE Journal Biology

A Validatable Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of Adeno-Associated Viral Vectors in Bioshedding Studies of Tears

Gözyaşlarının Biyodökülme Çalışmalarında Adeno-İlişkili Viral Vektörlerin Tespiti için Doğrulanabilir Bir Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu Testi

Full Text

2,913 Views

07:43 min

July 14, 2023

DOI: 10.3791/65495-v

Bryanna Longacre¹, Amanda Souaysene¹, Carrie A. Vyhlidal¹, Matthew R. Pennington¹

¹Cell and Gene Therapy,KCAS Bioanalytical and Biomarker Services

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a protocol for the detection and quantification of adeno-associated viral vectors (AAV) in human tears using droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR). It addresses significant regulatory gaps in laboratory practices for molecular studies and aims to provide a reliable framework for clinical applications.

Key Study Components

Research Area

Gene therapy vectors
Viral vector detection
Clinical trial assays

Background

Current regulatory gaps in biosafety evaluation
Challenges of detecting rare viral events in complex samples
Importance of accurate quantification in clinical samples

Methods Used

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR)
Adeno-associated viral vectors (AAV)
Sample validation processes without specific DNA extraction

Main Results

Achieved intra-assay precision of 3.7% at high spike level and 12.2% at low level
Established accuracy metrics for different QC levels
Demonstrated robustness for potential application in various viral shedding studies

Conclusions

This study showcases a validated ddPCR protocol suitable for regulatory studies of viral vectors in clinical settings.
It contributes significantly to the field of gene therapy and molecular diagnostics.

Frequently Asked Questions

What is ddPCR?

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive method for quantifying DNA without the need for a standard curve.

Why is accurate detection of AAV important?

Accurate detection is crucial for assessing the performance and safety of gene therapy interventions.

What challenges do complex matrices present in viral vector studies?

PCR interference and the presence of inhibitors can significantly affect the accuracy of quantification in complex samples like tears.

Can this protocol be applied to other viral vectors?

Yes, the framework developed here is adaptable for various viral vector shedding studies beyond AAV in human tears.

What are good laboratory practices?

Good laboratory practices are a set of principles intended to ensure the quality and integrity of laboratory studies and results.

How does this method improve assay validation?

By streamlining the validation process and eliminating specific DNA extraction steps, this method enhances reproducibility and efficiency.

Burada, gen tedavisi vektörlerinin klinik gelişimini desteklemek için damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu ile insan gözyaşlarında adeno ilişkili viral vektörlerin uyumlu tespitinde iyi laboratuvar uygulamalarının geliştirilmesi ve doğrulanması için bir protokol sunuyoruz.

Protokolümüz, karmaşık matrislerdeki adeno ilişkili viral vektörleri nicelleştirir. Doğru tespit ve niceliklendirme, klinik çalışmalardaki performanslarını değerlendirmek için esastır. Bu protokol özellikle iyi laboratuvar uygulamalarının uyumlu moleküler çalışmalarının tasarımındaki mevcut düzenleyici boşlukları doldurmayı amaçlamaktadır.

Viral vektör gelişiminin bir parçası olarak, düzenleyici kurumlar vektör biyo-dökülmesinin değerlendirilmesini gerektirir. ddPCR, standart bir eğri kullanmadan doğru nicelemeye ve qPCR'ye kıyasla gelişmiş hassasiyete izin verdiği için bu değerlendirme için umut verici bir teknolojidir. Gözyaşları gibi klinik ortamlarda karşılaşılan karmaşık matrislerde doğru nicelleştirme, PCR girişimi ve inhibisyonu nedeniyle doğrulanması zor olabilir.

Sınırlı klinik numune miktarları, tahlil yeterince hassas değilse, nadir olayları tespit etme yeteneğini de sınırlayabilir. Yaklaşımımız, düzenlenmiş çalışmalarda kullanılmak üzere tahlilleri doğrulamak için tekrarlanabilir ve uyarlanabilir ddPCR tabanlı bir çerçeve geliştirir. Bu yöntem, belirli bir DNA ekstraksiyon adımından kaçınarak daha akıcı doğrulamaya izin verir ve sağlamlık ve tekrarlanabilirliği sağlamak için tahlil performansını değerlendirmek için net kriterler sağlar.

Bu protokol, burada sunulduğu gibi, sadece gözyaşlarında AAV'nin tespitine değil, herhangi bir viral vektör dökülme çalışmasına uygulanma potansiyeline sahiptir. Birden fazla amaca uygun, düzenlenmiş programın geliştirilebileceği sağlam ve tekrarlanabilir bir çerçeve oluşturur.

Explore More Videos

Biyoloji Sayı 197 damlacık dijital PCR (ddPCR) AAV gözyaşı viral vektör iyi laboratuvar uygulamaları validasyon