Name: Hücresiz Protein Sentezi Reaksiyonlarını Makro Ölçekli Hidrojellere Gömme Yöntemleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Öğrenin, hücresiz protein sentezi reaksiyonlarını agaroz hidrojellere gömme yöntemlerini. E. coli lizatları kullanarak eGFP ve mCherry ko-ifadesini gerçekleştirin ve yeni nesil tanı cihazları geliştirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi'nin BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) ve BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.) ve Mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi - Savunma Bilimi ve Teknoloji Laboratuvarları ödülü EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.) ödüllerinin desteğini büyük ölçüde kabul etmektedir. Bu yayını destekleyen veriler şu adreste açıkça mevcuttur: 10.25405/data.ncl.22232452. Yazar, açık erişim amacıyla, ortaya çıkan herhangi bir Yazar Kabul Edilmiş Makale sürümüne Creative Commons Atıf (CC BY) lisansı uygulamıştır.

1. Hücre lizat tamponu ve ortam hazırlama
<ol><li>2x YT+P agar ve besiyerinin hazırlanması<ol><li>16 g/L tripton, 10 g/L maya özütü, 5 g/L NaCl, 40 mL/L 1 M K 2 HPO 4, 22 mL/L 1 M KH2PO4 ve 15 g/L agar ölçerek 2x YT+P agar hazırlayın. 2x YT+P et suyu için önceki bileşimi takip edin ancak agarı atlayın.</li>
		<li>2x YT+P'yi otoklavlayarak sterilize edin.</li>
	</ol></li>
	<li>S30A tamponunun hazırlanması<ol><li>S30A tamponunu 5.88 g/L Mg-glutamat, 12.195 g/L K-glutamat ve 25 mL/L 2 M Tris ile hazırlayın, asetik asit ile pH 7.7'ye ayarlayın.</li>
		<li>S30A tamponunu 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>S30B tamponunun hazırlanması<ol><li>S30B tamponunu 5.88 g/L Mg-glutamat ve 12.195 g/L K-glutamat ile hazırlayın, 2 M Tris ile pH 8.2'ye ayarlayın.</li>
		<li>S30B tamponunu 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hücre lizat hazırlığı (4 günlük protokol)
<ol><li>1. Gün<ol><li>2x YT+P'yi 100 μg/mL ampisilin ile desteklenmiş agar plakalarına dökün.</li>
		<li>E. coli'yi −80 °C gliserol stoğundan ayırın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>2. Gün<ol><li>2x YT+P plakasından tek bir koloniyi 1 L'lik şaşkın bir şişede 400 mL 2x YT+P et suyuna (ampisilin ile desteklenmiş) aşılayın.</li>
		<li>37 °C'de 220 rpm çalkalayarak 24 saat inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>3. Gün<ol><li>24 saatlik kültürlerin OD600'ünü ölçün ve kaydedin; 3-4'lük bir OD600'de büyüme yeterlidir. NOT: 1 mL'lik bir bakteri kültürü alikutu alın ve OD600 nm'yi ölçmeden önce orta (2x YT+P suyu) ile seri seyreltme gerçekleştirin. OD600'ü hesaplarken seyreltme etkisine izin verin.</li>
		<li>Kültürü önceden soğutulmuş 500 mL'lik santrifüj şişeleri arasında eşit olarak aktarın.</li>
		<li>4,500 °C'de 15 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın.</li>
		<li>Santrifüjleme sırasında, önceden hazırlanmış S30A tamponuna 2 mL/L 1 M DTT ekleyerek, tamponu karıştırarak ve buz üzerinde tutarak S30A tampon hazırlığını tamamlayın.</li>
		<li>Hücre peletlerini 200 mL S30A tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Tüm pelet tamamen çözünene kadar şişeleri kuvvetlice vorteksleyin ve hücreleri mümkün olduğunca buz üzerinde tutun.</li>
		<li>4,500 °C'de 15 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın.</li>
		<li>2.3.5-2.3.7 (dahil) adımlarını tekrarlayın.</li>
		<li>Her santrifüj şişesine 40 mL S30A tamponu ekleyin, peletleri yeniden süspanse edin ve önceden tartılmış 50 mL santrifüj tüplerine aktarın.</li>
		<li>4.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltarak atın ve kalan süpernatanı pipetle çıkarın ve mümkün olduğunca buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Santrifüj tüplerini yeniden tartın, yeni kütleyi kaydedin ve peletlerin kütlesini hesaplayın.</li>
		<li>Peletleri sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve −80 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>4. Gün<ol><li>Peletleri buz üzerinde çözdürün.</li>
		<li>1 g pelet başına aşağıdakileri ekleyin: 1.2 mL S30A tamponu (kullanımdan önce DTT eklenir), 275 μL proteaz inhibitörü (8 mM stok) ve 25 μL lizozim (10 mg/mL stok).</li>
		<li>Peletler kalan kümeler olmadan tamamen çözünene kadar kuvvetlice girdap yapın, onları mümkün olduğunca buz üzerinde tutun.</li>
		<li>50 mL santrifüj tüplerinde, hücre süspansiyonlarını 120 W, 20 kHz,% 30 genlik ve 20 s / 40 s açma / kapama darbelerinde 5 dakikalık sonikasyon için sonikleştirin.</li>
		<li>Hücre kalıntılarını peletlemek için 4,000 ° C'de 1 saat boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.</li>
		<li>Süpernatanı taze 50 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın.</li>
		<li>Tüpleri 37 °C'de 220 rpm'de 80 dakika inkübe edin.</li>
		<li>S30B tamponuna 1 mL/L 1 M DTT ekleyerek diyaliz malzemelerini hazırlayın. Karıştırın ve 1 L'lik steril bir behere 900 mL ekleyin. Manyetik bir karıştırıcı ekleyin ve 4 °C'de tutun.</li>
		<li>Akış reaksiyonunu takiben, hücre ekstraktını adım 2.4.7'den 2 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin.</li>
		<li>Peletsiz süpernatanı 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde buz üzerinde birleştirin.</li>
		<li>Üretilen hücre ekstraktının toplam hacmini belirleyin ve gerekli sayıda 10K MWCO diyaliz kasetini 2 dakika boyunca S30B'ye batırarak nemlendirin.</li>
		<li>Kasetleri 3 mL'ye kadar ekstrakt içeren bir şırınga ile yükleyin. 4 °C'de 3 saat karıştırarak 1 L beher başına üç kasete kadar diyalize edin.</li>
		<li>Ekstraktı berraklaştıran diyaliz tamamlandıktan sonra, ekstraktı 2 mL mikro santrifüj tüplerine aktarın. 20.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Arıtılmış ekstraktı buz üzerinde taze bir santrifüj tüpünde birleştirin ve karıştırmak için kısaca girdap yapın.</li>
		<li>Bir florometre kullanarak ekstraktın protein konsantrasyonunu belirleyin.</li>
		<li>Ekstraktı önceden soğutulmuşddH2Okullanarak 44.5 mg / mL'lik bir konsantrasyona seyreltin.</li>
		<li>200 μL'lik alikotlara ayırın, sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve −80 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Liyofilize hidrojellerin hazırlanması (Yöntem A)
<ol><li>0.75 g agaroz tartın, 100 mL'lik bir hacmeddH2Oekleyin ve erimiş agaroz stoğu oluşturmak için yüksek sıcaklıklarda 30 s'de mikrodalgada pişirin.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak, 50 μL erimiş agarozu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve jelin 20-30 dakika polimerize olmasına izin verin (jeller bir buzdolabına aktarılırsa polimerizasyon daha hızlı gerçekleşir).</li>
	<li>Polimerize jelleri içeren mikrosantrifüj tüplerini sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun.</li>
	<li>Santrifüj tüplerinin kapağını çıkarın, santrifüj tüpü açıklıklarını balmumu filmiyle kapatın ve filmi bir iğne veya pipet ucuyla birkaç kez delin.</li>
	<li>Polimerize jelleri içeren mikrosantrifüj tüplerini 1-2 saat boyunca −80 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Santrifüj tüplerini −80 °C'lik depodan kurtarın ve tüplerin tamamen kuru olduğundan emin olarak bir dondurarak kurutucuya koyun.</li>
	<li>Dondurarak kurutma makinesini aşağıdaki ayarlarla devreye alın: sıcaklık: −20 °C, basınç: 0,1 mbar.</li>
	<li>Jeli gece boyunca donarak kurumaya bırakın.</li>
	<li>Jelleri dondurarak kurutucudan kurtarın ve gerekli olana kadar −80 °C'lik bir depoya koyun. NOT: Jeller 1 yıla kadar dondurularak kurutulmuş olarak saklanabilir.</li>
</ol>4. 14x enerji çözeltisi stoğunun hazırlanması
<ol><li>14x enerji çözeltisi üretmek için tüm reaksiyon bileşenlerini (Tablo 1) buz üzerinde 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde birleştirin.</li>
	<li>14x enerji çözeltisini 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine ayırın ve −80 ° C'de saklayın (daha küçük hacimli alikotlar kullanılabilir). NOT: 14x enerji çözeltisi, tüplerin tekrar tekrar donarak çözülmesi önlenirse, −80 °C'de birkaç ay saklanabilir.</li>
</ol>5. 4x amino asit stoğunun hazırlanması
<ol><li>Bir RTS Amino Asit Örnekleyici kitinin 20 amino asit bileşeninin tümünü buz üzerinde çözün. Tamamen çözündüklerinden emin olmak için amino asitleri vorteksleyin.</li>
	<li>50 mL'lik bir santrifüj tüpünde, 20 amino asidin tümünü birleştirin ve çözelti berraklaşana kadar 12 mL sterilddH2O. Vorteks ekleyin, sadece hafif bir beyaz renklenme bulanıklığı ile.</li>
	<li>4x amino asitleri 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine (500 μL alikotlar) ayırın.</li>
	<li>4x amino asit çözeltisi alikotlarını sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve alikotları −80 °C depolamaya taşıyın.</li>
</ol>6. Hücresiz tampon kalibrasyonu
NOT: Hidrojel reaksiyonları için kullanılan CFPS tamponu, Sun ve ark.35'ten modifiye edilen Banks ve ark.34'teki protokol izlenerek optimal DTT, Mg-glutamat ve K-glutamat konsantrasyonları için kalibre edilmiştir. Kalibrasyon reaksiyonu bileşimleri, K-glutamat (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1.000 mM, 1.200 mM, 1.400 mM), Mg-glutamat (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) ve DTT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM) stokları. JMP Pro 15, özel bir DOE tasarımı oluşturmak (Tablo 2) ve optimal faktör konsantrasyonlarını belirlemek için analiz yapmak için kullanıldı.
<ol><li>Hücresiz ekstraktı −80 °C depolamadan geri kazanın ve buz üzerinde çözdürün.</li>
	<li>4x amino asit, 14x enerji solüsyonu, %40 PEG-8000, plazmit DNA, 3 M K-glutamat, 100 mM Mg-glutamat ve 100 mM DTT stoklarını buz üzerinde çözün.</li>
	<li>12.5 μL 4x amino asit, 3.57 μL 14x enerji çözeltisi, 2.5 μL %40 PEG-8000, 3 μg plazmit DNA ve 10 μL hücresiz ekstrakt (44.5 mg/mL) birleştirerek bir kalibrasyon ana karışımı oluşturun ve ddH2Oile reaksiyon başına 35 μL'ye kadar yapın.</li>
	<li>35 μL ana karışımı 384 oyuklu siyah bir mikrotitre plakasının kuyucuklarına dağıtın.</li>
	<li>DOE tasarımını takiben, her reaksiyonu 50 μL'ye kadar yapmak içinddH2Oile birlikte her reaksiyona uygun hacimde Mg-glutamat, K-glutamat ve DTT ekleyin.</li>
	<li>Açıklanan plaka okuyucu ayarlarını kullanarak floresan algılama ve analiz için mikrotitre plakasını bir plaka okuyucuya aktarın (mCherry için): uyarma: 587 nm, emisyon: 610 nm, dalga boyu bant genişliği: 12 nm, optik: üst, sıcaklık: 37 °C, floresan okumaları toplam okuma süresinin 4 saati boyunca her 5 dakikada bir toplanır. Plakaları 60 rpm'de darbeli bir ayarda çalkalayarak inkübe edin.</li>
	<li>Sonuçları JMP DOE tasarımına yükleyin ve istenen yanıt değişkenlerine dayalı olarak K-glutamat, Mg-glutamat ve DTT için optimal konsantrasyon seviyelerini belirlemek için bir tahmin profili oluşturun; Bu durumda, maksimum floresan ve reaksiyon hızı yanıt değişkenleriydi.</li>
	<li>3X CFPS tamponunu oluşturmak için reaktifleri Tablo 2'te gösterildiği gibi birleştirin</li>
	<li>Aliquot ve −80 °C'de saklayın</li>
</ol>7. Rehidre liyofilize hidrojellerde CFPS (Yöntem A)
NOT: CFPS reaksiyonlarında kullanılan plazmitler, E. coli 36 için EcoFlex modüler araç setindeki bileşenler kullanılarak oluşturulmuştur ve Whitfield ve ark.1 JM23100 1'de açıklanmıştır. Bu bileşenler Addgene'den edinilebilir.
<ol><li>Hücresiz ekstraktı −80 °C depolamadan geri kazanın ve yaklaşık 20 dakika buz üzerinde çözdürün.</li>
	<li>2x CFPS tamponunu ve plazmit DNA'yı toplayın ve buz üzerinde çözdürün.</li>
	<li>Dondurularak kurutulmuş hidrojelleri toplayın ve jelleri tezgahta bekleterek 15 dakika oda sıcaklığına gelmelerini bekleyin.</li>
	<li>Jelleri 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın, gerekirse jelleri kuyucuklara sığdırmak için bir neşter ile kesin.</li>
	<li>1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 10 μL hücresiz ekstraktı 25 μL 2x CFPS tamponu ve 4 μg plazmit DNA ile birleştirin; CFPS çözeltisini oluşturmak için ddH2Oile toplam 50 μL hacme kadar çıkın.</li>
	<li>CFPS çözeltisini dondurularak kurutulmuş hidrojellerin üzerine pipetleyin.</li>
	<li>Jellerin oda sıcaklığında 5-10 dakika CFPS sisteminde ıslanmasına izin verin.</li>
	<li>Jelleri bir spatula kullanarak 384 oyuklu siyah bir mikrotitre plakasına aktarın.</li>
	<li>Adım 6.6'da açıklanan plaka okuyucu ayarlarını kullanarak floresan algılama ve analiz için mikrotitre plakasını bir plaka okuyucuya aktarın. Temsili sonuçlar önceki çalışmalarda mevcuttur31,33.</li>
</ol>8. Konuşlandırılabilir hidrojellerde hücresiz protein sentezi (Yöntem B)
<ol><li>−80 °C depolamadan hücresiz ekstraktı geri kazanın ve yaklaşık 20 dakika buz üzerinde çözdürün.</li>
	<li>Plazmid DNA'sını toplayın ve buz üzerinde çözdürün.</li>
	<li>Buz üzerinde 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 10 μL hücresiz ekstraktı 3 μg plazmit DNA ve 25 μL 2x CFPS tamponu ile birleştirerek toplam hacmi 37.5 μL'ye kadar birleştirin.</li>
	<li>3 g agaroz ölçün ve% 3 agaroz oluşturmak için 100 mL ddH2Otamponuna ekleyin.</li>
	<li>Mikrodalgada %3 agaroz 30 saniyede yüksek güçte patlar.</li>
	<li>12.5 μL erimiş agarozu, toplam 50 μL hacme kadar CFPS karışımı içeren 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin.</li>
	<li>Erimiş agarozun soğumasına izin verin, ancak polimerize olmayın, agarozu 50 °C'ye ayarlanmış bir ısı bloğunda bırakın.</li>
	<li>Erimiş agarozu CFPS çözeltisi ile birleştirin; pipetleme yoluyla karıştırın ve uçla karıştırın ve CFPS çözeltisi karıştırılmadan önce jel polimerizasyonunu önlemek için hızlı hareket ettiğinizden emin olun.</li>
	<li>Jellerin oda sıcaklığında soğumasını bekleyin ve yaklaşık 2 dakika polimerize edin.</li>
	<li>Polimerize agarozu bir spatula ile 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun.</li>
	<li>Flaşla dondurulan hidrojelleri 1 saat boyunca −80 °C'de saklayın.</li>
	<li>Jelleri depodan kurtarın; Mikrosantrifüj tüpü kapaklarını çıkarın, tüpleri balmumu filmiyle örtün ve nemin kurumasını sağlamak için filmi delin.</li>
	<li>Dondurarak kurutma makinesini aşağıdaki ayarlarla devreye alın: sıcaklık: −20 °C, basınç: 0,1 mbar, 18 saat dondurarak kurutma (gece boyunca).</li>
	<li>Dondurularak kurutulmuş CFPS cihazlarını kullanana kadar −80 °C'lik bir depoda saklayın.</li>
	<li>Yaklaşık 50 μL ıslak hacme sahip dondurularak kurutulmuş CFPS cihazları, fazla sıvı olmadan 50 μLddH2Oile rehidre edilebilir. Rehidrasyon yaklaşık 30 dakika sürer.</li>
	<li>Jelleri bir spatula kullanarak 384 oyuklu siyah bir mikrotitre plakasına aktarın.</li>
	<li>Adım 6.6'da açıklanan plaka okuyucu ayarlarını kullanarak floresan algılama ve analiz için mikrotitre plakasını bir plaka okuyucuya aktarın. Temsili sonuçlar önceki yayınlardamevcuttur 31,33.</li>
</ol>

CFPS Reaksiyonlarının Çeşitli Hidrojel Matrislerine Gömülmesi

<ol><li>Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+Engineering+in+an+open+world%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+System+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world.</a> Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).</li>
<li>Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+Engineering+beyond+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853(2016).</li>
<li>Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+enabled+rapid+prototyping+for+metabolic+engineering+and+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+System+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology.</a> Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).</li>
<li>Kopniczky, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+as+a+prototyping+platform+for+mammalian+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).</li>
<li>Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+cell-free+biosensors+to+monitor+enzymatic+production%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).</li>
<li>Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+potential+of+cell-free+protein+synthesis+for+extending+the+abilities+of+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248(2019).</li>
<li>Focke, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+in+vitro+folding+with+cell+free+protein+synthesis+for+membrane+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression.</a> Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).</li>
<li>Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+synthesis+of+complex+biomolecular+assemblies%3A+wheat+germ+cell-free+protein+expression+in+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958(2021).</li>
<li>Bashir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+concepts+of+hydrogels%3A+synthesis%2C+properties%2C+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications.</a> Polymers. 12 (11), 2702(2020).</li>
<li>Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+hydrogels-A+promising+platform+in+enhancing+water+security+for+a+sustainable+future%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Material+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future.</a> Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580(2021).</li>
<li>Whitfield, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+in+hydrogel+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis in hydrogel materials.</a> Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).</li>
<li>Yao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+strategies+for+adhesive+hydrogels+with+natural+antibacterial+agents+as+wound+dressings%3A+Status+and+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends.</a> Materials Today Bio. 15, 100429(2022).</li>
<li>Musgrave, C. S. A., Fang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+lens+materials%3A+A+materials+science+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Contact lens materials: A materials science perspective.</a> Materials. 12 (2), 261(2019).</li>
<li>Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+hydrogel+from+baby+diaper+wastes+and+its+application+for+enhancing+soil+irrigation+management%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Management%22%5BJournal%5D)">Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management.</a> Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).</li>
<li>Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+drug+delivery+systems%3A+A+review+of+current+characterization+and+evaluation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1188(2020).</li>
<li>Jacob, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+hydrogels+in+drug+delivery+systems%2C+tissue+engineering+and+wound+management%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management.</a> Pharmaceutics. 3 (3), 357(2021).</li>
<li>Senapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+drug+delivery+vehicles+for+cancer+treatment+and+their+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7(2018).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biocompatible%2C+stimuli-responsive%2C+and+injectable+hydrogel+with+triple+dynamic+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds.</a> Molecules. 25 (13), 3050(2020).</li>
<li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactuators+based+on+stimulus-responsive+hydrogels+and+their+emerging+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22NPG+Asia+Materials%22%5BJournal%5D)">Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications.</a> NPG Asia Materials. 11, 64(2019).</li>
<li>Fan, M., Tan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+conjugation+for+biodegradable+hydrogels+as+drug+and+cell+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Cogent+Engineering%22%5BJournal%5D)">Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds.</a> Cogent Engineering. 7 (1), 1736407(2020).</li>
<li>Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+expression+and+in+situ+immobilization+of+proteins+for+generation+of+three-dimensional+protein+arrays+in+a+hydrogel+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix.</a> Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).</li>
<li>Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+protein+expression+in+hydrogel+particles%3A+Towards+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells.</a> Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).</li>
<li>Huang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiobitsTM+explorer%3A+A+modular+synthetic+biology+education+kit%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit.</a> Science Advances. 4 (8), 5105(2018).</li>
<li>Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mechanical+analysis+of+agarose-based+biopolymers+with+potential+use+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+Proceeding%22%5BJournal%5D)">Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine.</a> Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).</li>
<li>Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+on+recent+progress+of+the+hydrogels%3A+from+material+resources%2C+properties+to+functional+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications.</a> Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785(2022).</li>
<li>Salati, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose-based+biomaterials%3A+Opportunities+and+challenges+in+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering.</a> Polymers. 12 (5), 1150(2020).</li>
<li>Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cells%3A+Synthetic+compartments+with+life-like+functionality+and+adaptivity%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).</li>
<li>Kahn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+microgels+as+a+platform+for+cell-free+protein+expression+and+display%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display.</a> Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+transcription+and+translation+in+clay+hydrogel+and+implications+for+early+life+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution.</a> Scientific Reports. 3, 3165(2013).</li>
<li>Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+protein+expression+in+hydrogel+particles%3A+Towards+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells.</a> Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).</li>
<li>Whitfield, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+genetic+devices+confer+autonomic+and+adaptive+properties+to+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels.</a> BioRxiv. , (2019).</li>
<li>Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+DNA+hydrogel%3A+Design%2C+synthesis+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications.</a> Progress in Polymer Science. 98, 101163(2019).</li>
<li>Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoward%2C+T+%222020+Chemical+Communications%22">2020 Chemical Communications</a>. , Newcastle University. UK. (2020).</li>
<li>Banks, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+reaction+components+affect+the+kinetics+and+performance+robustness+of+cell-free+protein+synthesis+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli-based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
<li>Moore, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoFlex%3A+A+multifunctional+MoClo+kit+for+E.+coli+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).</li>
<li>Benítez-Mateos, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro+compartmentalized+cell-free+protein+synthesis+in+hydrogel+%C2%B5-channels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).</li>
</ol>

Burada, E. coli hücresi lizat bazlı CFPS reaksiyonlarının agaroz hidrojellere dahil edilmesi için iki protokol özetlenmiştir. Bu yöntemler, materyal boyunca eşzamanlı gen ekspresyonuna izin verir. Protokol diğer CFPS sistemleri için uyarlanabilir ve burada ayrıntıları verilen laboratuvarda hazırlanmış hücre lizatlarına ek olarak ticari olarak temin edilebilen CFPS kitleri ile başarılı bir şekilde yürütülmüştür. Daha da önemlisi, protokol, harici bir sıvı fazın yokluğunda gen ekspresyonuna izin verir. Bu, sistemi...

Sentetik biyoloji, doğada bulunmayan işlevleri yerine getirebilen biyolojik tabanlı parçalar, cihazlar ve sistemler tasarlamak ve tasarlamak için çeşitli mühendislik disiplinlerini bütünleştirir. Çoğu sentetik biyoloji yaklaşımı hala canlı hücrelere bağlıdır. Buna karşılık, hücresiz sentetik biyoloji sistemleri, geleneksel hücre tabanlı gen ekspresyon yöntemlerininkısıtlamalarının çoğunu ortadan kaldırırken, biyolojik sistemlerin mühendisliği için daha fazla esneklik ve kısaltılmış bir süre sağlayarak, tasarımda benzeri görülmemiş düzeyde kontrol ve özgürlüğü kolaylaştırır 1,2,3. CFPS, yapay hücreler oluşturmak, genetik devrelerin prototipini oluşturmak, biyosensörler geliştirmek ve metabolitler üretmek de dahil olmak üzere çok sayıda disiplinde artan sayıda uygulamada kullanılmaktadır 4,5,6. CFPS ayrıca, agregasyona eğilimli proteinler, transmembran proteinler ve toksik proteinler 6,7,8 gibi canlı hücrelerde kolayca eksprese edilemeyen rekombinant proteinlerin üretilmesi için özellikle yararlı olmuştur.
CFPS tipik olarak sıvı reaksiyonlarda gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu, herhangi bir sıvı hücresiz cihazın bir reaksiyon kabı içinde bulunması gerektiğinden, bazı durumlarda konuşlandırılmalarını kısıtlayabilir. Burada sunulan yöntemlerin geliştirilmesinin gerekçesi, hücresiz sentetik biyoloji cihazlarının hidrojellere gömülmesi için sağlam protokoller sağlamaktı, kendi başına bir protein üretim platformu olarak değil, bunun yerine, hidrojellerin hücresiz cihazların laboratuvarın ötesinde konuşlandırılması için fiziksel bir şasi olarak kullanılmasına izin vermekti. Hidrojellerin CFPS şasisi olarak kullanılmasının çeşitli avantajları vardır. Hidrojeller, yüksek su içeriğine rağmen (bazen% 98'den fazla), katı özellikleresahip polimerik malzemelerdir 9,10,11. Macunlar, yağlayıcılar ve yapıştırıcılar olarak kullanımları vardır ve kontakt lensler, yara örtüleri, deniz yapışkan bantları, kir iyileştiriciler ve bebek bezleri 9,11,12,13,14 gibi çeşitli ürünlerde bulunurlar. Hidrojeller ayrıca ilaç dağıtım araçlarıolarak aktif olarak araştırılmaktadır 9,15,16,17. Hidrojeller ayrıca biyouyumlu, biyolojik olarak parçalanabilir ve kendi 9,18,19,20 uyaran tepkilerine sahip olabilir. Dolayısıyla buradaki amaç, moleküler biyolojiden türetilen işlevsellik ile malzeme bilimi arasında bir sinerji yaratmaktır. Bu amaçla, hücresiz sentetik biyolojiyi kollajen, laponit, poliakrilamid, fibrin, PEG-peptid ve agaroz 11,21,22 dahil olmak üzere bir dizi malzemeyle entegre etmenin yanı sıra cam, kağıt ve kumaş yüzeylerini kaplamak için çaba sarf edilmiştir 11,23,24 CFPS cihazları ile. Burada sunulan protokoller, örnek malzeme olarak agaroz kullanılarak CFPS reaksiyonlarını makro ölçekli (yani >1 mm) hidrojel matrislerine gömmek için iki yöntemi göstermektedir. Agaroz, yüksek su emme kapasitesi, kontrollü kendi kendine jelleşme özellikleri ve ayarlanabilir mekanik özelliklerinedeniyle seçilmiştir 11,24,25,26. Agarose ayrıca fonksiyonel CFPS'yi destekler, diğer birçok hidrojel alternatifinden daha ucuzdur ve biyolojik olarak parçalanabilir, bu da onu deneysel bir model sistem olarak çekici bir seçim haline getirir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin daha önce CFPS'yi bir dizi alternatif hidrojele gömmek için uygun olduğu gösterilmiştir11. Hidrojellerin geniş uygulama yelpazesi ve CFPS'nin işlevselliği göz önüne alındığında, burada gösterilen yöntemler, araştırmacıların kendi amaçlarına uygun biyolojik olarak geliştirilmiş hidrojel malzemeleri geliştirebilecekleri bir temel sağlayabilir.
Önceki çalışmalarda,23,27,28,29,30,31 reaksiyon tamponuna batırılmış hidrojellerde CFPS gerçekleştirmek için 1 μm ila 400 μm boyut aralığına sahip mikrojel sistemleri kullanılmıştır. Bununla birlikte, hidrojelleri CFPS reaksiyon tamponlarına daldırma gerekliliği, kendi başlarına malzeme olarak konuşlandırılma fırsatlarını sınırlar. Burada sunulan protokoller, jelleri reaksiyon tamponlarına daldırmaya gerek kalmadan hidrojeller içinde CFPS reaksiyonlarının gerçekleşmesine izin verir. İkincisi, makro ölçekli jellerin (2 mm ila 10 mm boyutunda) kullanılması, hidrojeller ve hücresiz gen ekspresyonu arasındaki fiziksel etkileşimin incelenmesine izin verir. Örneğin, bu teknikle, hidrojel matrisinin CFPS reaksiyonlarını11 nasıl etkilediğini ve CFPS reaksiyonlarının hidrojel matrisini31 nasıl etkileyebileceğini incelemek mümkündür. Daha büyük boyutlardaki hidrojeller ayrıca yeni, biyo-programlanabilir malzemelerin geliştirilmesine de izin verir32. Son olarak, CFPS reaksiyonlarını hidrojellere gömerek, plastik reaksiyon kaplarına olan gereksinimde de potansiyel bir azalma olur. Hücresiz sensörlerin konuşlandırılması için bu, plastik malzemelere bağımlı cihazlara göre açık avantajlara sahiptir. Birlikte ele alındığında, CFPS reaksiyonlarının hidrojellere gömülmesi, hücresiz cihazların laboratuvarın ötesinde konuşlandırılması için çeşitli avantajlar sağlar.
Burada sunulan yöntemlerin genel amacı, hidrojel matrisleri içinde CFPS reaksiyonlarının çalışmasına izin vermektir. Hücresiz protein üretim reaksiyonlarını makro ölçekli hidrojel malzemelere gömmek için iki farklı yöntem gösterilmiştir (Şekil 1). Yöntem A'da, CFPS bileşenleri, aktif bir sistem oluşturmak için liyofilize agaroz hidrojellere eklenir. Yöntem B'de, erimiş agaroz, tam bir CFPS hidrojel sistemi oluşturmak için CFPS reaksiyon bileşenleri ile karıştırılır, daha sonra liyofilize edilir ve ihtiyaç duyulana kadar depolanır. Bu sistemler, reaksiyonu başlatmak için bir hacim su veya tampon ve analit ile rehidre edilebilir.
Bu çalışmada Escherichia coli hücre lizat bazlı sistemler kullanılmaktadır. E. coli hücre lizat preparatı basit, ucuz ve yüksek protein verimi sağladığı için bunlar en popüler deneysel CFPS sistemlerinden bazılarıdır. Hücre lizatı, ribozomlar, tRNA'lar, aminoasil-tRNA sentetazları ve başlatma, uzama ve sonlandırma faktörleri dahil olmak üzere transkripsiyon ve translasyonu gerçekleştirmek için gereken makromoleküler bileşenlerle tamamlanır. Spesifik olarak, bu makale, E. coli hücre lizatları kullanılarak agaroz hidrojellerde eGFP ve mCherry üretimini gösterir ve bir plaka okuyucu ve konfokal mikroskopi kullanarak floresan görünümünü izler. Mikrotitre plaka okuyucu için temsili sonuçlar Whitfield ve ark.31'de görülebilir ve temel veriler kamuya açıktır 33. Ayrıca, jeller boyunca floresan proteinlerin ekspresyonu konfokal mikroskopi kullanılarak doğrulanır. Bu yazıda gösterilen iki protokol, hücre içermeyen gen devrelerinin saha dağıtımını destekleyecek şekilde dağıtımı için uygun bir fiziksel ortam yaratma nihai hedefi ile CFPS tabanlı genetik cihazların materyalde birleştirilmesine ve depolanmasına izin verir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Malzeme< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>3-PGA</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-214793B</td><td></td></tr><tr><td>Asetik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10752.22</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Severn Biotech</td><td>30-15-50</td><td></td></tr><tr><td>Amino Asit Örnekleyici Kiti</td><td>VWR</td><td></td><td></td>BTRABR1401801</tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937-1G</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501-1G</td><td></td></tr><tr><td>Koenzim A (CoA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282-100MG</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Alfa Aesar</td><td>J14121.MC</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Folinik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878-100MG</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Karbosynth</td><td>NG01208</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-25G</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149-100G</td><td></td></tr><tr><td>Lizozim</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605-250G</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522-250MG</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Hidroksit (KOH)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>757551-5G</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat Dibazik (K2HPO4)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat Monobazik (KH2PO4)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD037-500G</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü kokteyli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>Kübit Protein konsantrasyon kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A50668</td><td></td></tr><tr><td>Rossetta 2 DE 3 E.coli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71397-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür (NaCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558-1G</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Alfa Aesar</td><td>J23160.MC</td><td></td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625-1KG</td><td></td></tr> < <tr><td>güçlü > Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS4323-500EA</td><td></td></tr><tr><td>10K MWCO diyaliz kasetleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>66381</td><td></td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpü</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>50 mL santrifüj şişeleri</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>500 mL santrifüj şişeleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120-9500</td><td></td></tr><tr><td>Alpha 1-2 LD Plus dondurarak kurutucu</td><td>Mesih</td><td>Parça No. 101521, 101522, 101527</td><td></td></tr><tr><td>Tezgah Üstü Santrifüj</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H-X3R</td><td></td></tr><tr><td>Siyah 384 kuyulu mikrotitre plakaları</td><td>Fischer Scientific</td><td>66</td><td></td></tr><tr><td>Küvetler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>222S</td><td></td></tr><tr><td>Elga Purelab Korosu</td><td>Elga</td><td>#####</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Mikrosantrifüj 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>EP00532</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hızlı Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34183</td><td></td></tr><tr><td>JMP lisansı</td><td>SAS Enstitüsü</td><td>15</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik Karıştırıcı</td><td>Fischer Scientific</td><td>15353518</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Amcor</td><td>PM-966</td><td></td></tr><tr><td>Fotospektrometre (Biyofotometre)</td><td>Eppendorf</td><td>16713</td><td></td></tr><tr><td>Pipetler ve uçlar</td><td>Gilson</td><td>#####</td><td></td></tr> <tr><td>Hassas Denge</td><td>Sartorius 16384738</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Florometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalama İnkübatörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE8000</td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator (Sonikatör)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12893543</td><td></td></tr><tr><td>Statik İnkübatör</td><td>Sanyo</td><td>MIR-162</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga ve iğneler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>66490</td><td></td></tr><tr><td>Thermo max Q8000 (Çalkalamalı İnkübatör)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE8000</td> Varioskan Lux plaka okuyucu Thermo Fisher Scientific VLBL00GD1 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Cole-parmer</td><td>OU-04724-05</td><td></td></tr><tr><td>VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/&deg; c metre</td><td>VWR</td><td>662-1657</td><td></td></tr></tbody></table>

hücresiz protein sentezi reaksiyonlarını makro Ölçekli hidrojellere gömme yöntemleri

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

Sentetik gen ağları, bilim insanlarının ve mühendislerin genetik düzeyde kodlanmış işlevselliğe sahip yeni sistemler tasarlamaları ve inşa etmeleri için bir platform sağlar. Gen ağlarının konuşlandırılması için baskın paradigma hücresel bir şasi içinde olsa da, sentetik gen ağları hücresiz ortamlarda da konuşlandırılabilir. Hücresiz gen ağlarının umut verici uygulamaları arasında biyosensörler bulunur, çünkü bu cihazlar biyotik (Ebola, Zika ve SARS-CoV-2 virüsleri) ve abiyotik (ağır metaller, sülfürler, böcek ilaçları ve diğer organik kirleticiler) hedeflere karşı gösterilmiştir. Hücresiz sistemler tipik olarak bir reaksiyon kabı içinde sıvı halde konuşlandırılır. Bununla birlikte, bu tür reaksiyonları fiziksel bir matrise gömmek, daha geniş bir ortam kümesinde daha geniş uygulamalarını kolaylaştırabilir. Bu amaçla, hücresiz protein sentezi (CFPS) reaksiyonlarını çeşitli hidrojel matrislerine gömmek için yöntemler geliştirilmiştir. Bu çalışmaya elverişli hidrojellerin temel özelliklerinden biri, hidrojel malzemelerin yüksek su sulandırma kapasitesidir. Ek olarak, hidrojeller, işlevsel olarak faydalı olan fiziksel ve kimyasal özelliklere sahiptir. Hidrojeller, depolama için dondurularak kurutulabilir ve daha sonra kullanılmak üzere yeniden sulandırılabilir. CFPS reaksiyonlarının hidrojellere dahil edilmesi ve tahlili için iki adım adım protokol sunulmaktadır. İlk olarak, bir CFPS sistemi, bir hücre lizatı ile rehidrasyon yoluyla bir hidrojele dahil edilebilir. Hidrojel içindeki sistem daha sonra hidrojel yoluyla tam protein ekspresyonu için yapısal olarak indüklenebilir veya eksprese edilebilir. İkincisi, hücre lizatı, polimerizasyon noktasında bir hidrojele eklenebilir ve tüm sistem, hidrojel içinde kodlanan ekspresyon sistemi için indükleyiciyi içeren sulu bir çözelti ile daha sonraki bir noktada dondurularak kurutulabilir ve yeniden sulandırılabilir. Bu yöntemler, hidrojel malzemelere duyusal yetenekler kazandıran hücresiz gen ağlarına izin verme potansiyeline sahiptir ve laboratuvarın ötesinde konuşlanma potansiyeline sahiptir.

Bu protokol, CFPS reaksiyonlarını hidrojel matrislerine gömmek için iki yöntemi detaylandırır ve Şekil 1 , iki yaklaşımın şematik bir özetini sunar. Her iki yöntem de dondurarak kurutmaya ve uzun süreli depolamaya uygundur. Yöntem A, iki nedenden dolayı en çok kullanılan metodolojidir. İlk olarak, bir dizi hidrojel malzeme ile çalışmak için en uygun yöntem olduğu gösterilmiştir11. İkincisi, Yöntem A, genetik yapıların paralel olarak test edilmesine izin verir. Yöntem ...

Burada, hücresiz protein sentezi reaksiyonlarını harici bir sıvı faza ihtiyaç duymadan makro ölçekli hidrojel matrislerine gömmek için iki protokol sunuyoruz.

Hücresiz Protein Sentezi Reaksiyonlarını Makro Ölçekli Hidrojellere Gömme Yöntemleri

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...

Canlı sistemlerin sürekli olarak birçok farklı kaynaktan gelen bilgileri entegre ettiğini ve bu sinyallerin karmaşık ve ince tepkileri tetiklediğini biliyoruz. Bu bilgi işlemenin çoğu moleküler düzeyde gerçekleşir. Bu süreçleri malzemeler içinde, ancak hücreler olmadan çalıştırmakla ilgileniyoruz.Amaç, malzemelere yeni işlevsellik kazandırmaktır. Bu çalışmadaki zorluklar, hidrojel ile çalışmaktan ziyade, öncelikle hücresiz protein sentezi reaksiyonu ile ilişkilidir. Hücre reaksiyonu, iyi çalışması için yüksek kaliteli hücre lizatının yanı sıra yüksek kaliteli ve saflıkta DNA gerektirir.Bu protokol, araştırmacıların moleküler biyoloji reaksiyonlarını laboratuvar dışına alınabilecek fiziksel bir biyolojik olarak parçalanabilen malzemeye yerleştirmelerine olanak tanır. Ayrıca, reaksiyon çıktısı doğrudan malzeme şasisi ile etkileşime girdiğinden, yeni algılama ve tepki yeteneklerine sahip malzemelerin geliştirilmesi için potansiyel vardır. Kısa vadede, bu yöntemlerin hücresiz teşhis cihazlarının konuşlandırılması için yeni bir yol sağladığını görüyoruz.Bu protokol, sıvı reaksiyonlar için mümkün olmayan bir şekilde bir dizi cihazın oluşturulmasına ve uzamsal olarak düzenlenmesine izin verir. Gelecekteki çıkarlarımız iki yönlüdür. İlk olarak, işe daha fazla malzeme işlevselliği getirmek için kullandığımız hidrojellerin doğasını genişletmekle ilgileniyoruz.İkincisi, jellerde işlettiğimiz gen ağlarının karmaşıklığını ve performansını artırmak, bu sistemlerin biyolojik işlevselliğini genişletmekle ilgileniyoruz.

methods-for-embedding-cell-free-protein-synthesis-reactions-macro

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz, sentetik hidrojeller içinde hücreler 3 boyutlu (3D) kapsülleme için protokolleri mevcut. Kapsülleme işlemi kapsüllü hücre davranışlarını değerlendirmek için iki yaygın olarak kullanılan çapraz bağlanma yöntemleri (michael-tipi hafif başlatılan ek ve serbest radikal mekanizmaları) yanı sıra bir dizi teknik özetlenmiştir.

Doku Mühendisliği 3D Hidrojeller Hücresel Kapsülleme

Bu protokolde, teknolojinin dayandığı dikey yerinden mesajların microactuator dizi imalat, ve nasıl bu temel teknoloji, yüksek verimli mekanik dinamik hücre kültürü, hem de iki boyutlu ve üç boyutlu kültür yapmak için değiştirilebilir göstermektedir paradigmalar.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

Bu video zincir polimerizasyonların gizlenmemesi ve hidrojel sentezini sağlayan, poli (etilen glikol), metakrilat, hızlı, verimli bir yöntem gösterecektir. Bu benzer, fonksiyonlandırmalar verimliliğini değerlendirmek giderme ve gelişmiş değişiklikler için öneriler sunmak ve tipik hidrojel karakterizasyon teknikleri göstermek için peptidler, detay ortak analitik yöntemler içine metakrilamit işlevlerini tanıtmak için nasıl gösterecektir.

Mikrodalga destekli Poli işlevselleştirilmesi (etilen glikol) ve zincir polimerizasyonu ve Hidrojel formasyonunda kullanılan On-reçine Peptides

Bir bölünmüş intein aracılı protein hidrojel sentezini sunar. Bu hidrojel yapı blokları, her bir bölme intein bir çapraz bağlayıcı ve bir yarısı olarak görev yapan bir trimerik bir protein alt-birimini ihtiva eden iki protein kopolimerleridir. İki protein kopolimerlerinin Karıştırma bir hidrojel halinde kendi kendine birarada monte edilmiş bir polipeptit ünitesi, sonuçta bir intein trans-ekleme reaksiyonunu tetikler. Bu hidrojel yüksek pH ve sıcaklık-stabil, organik solventler ile uyumlu ve...

Bir Intein aracılı yapay protein Hidrojel sentezi

Üç boyutlu hücre kültürü uygulamaları için sentetik hidrojel matrislerinin ışık aracılı oluşumu ve ardından biyokimyasal modellemesi için sıralı bir süreci tanımlıyoruz. Hidrojellerin sitouyumlu fototıklama kimyası ile yapımı ve modifikasyonu gösterilmiştir. Ek olarak, bu hidrojeller içindeki kalıpları ölçmek ve gözlemlemek ve hücre canlılığını belirlemek için basit teknikler sunulmaktadır.

Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Protein bazlı hydrogels üç boyutlu mimarisinde işlemek için farklı yöntemler burada malzeme özellikleri ile ilgili olarak değerlendirilir. Macroporous ağlar ile bir hücre yapışkanlı peptid functionalized ve onların fizibilite hücre kültüründe iki farklı model hücre hatları kullanılarak hesaplandı.

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Bu yöntemde, photopolymerization kullanıyoruz ve polietilen glikol (PEG) hydrogels, sağlayan yüzeyinde protein veya peptid desen oluşturmak için tıklatın kimya teknikleri biyoaktif sinyaller hücresel yanıt vitro incelenmesi için immobilize .

Biyoaktif proteinler veya peptidler hidrojel Photochemistry biyolojik uygulamalarda kullanarak üzerinde desenlendirme

Polimer omurga ve bu nedenle, hücre microenvironment tam ayar için izin olarak Rekombinant protein mühendislik hydrogels 3D hücre kültürü için avantajlı olan. Burada, rekombinant elastin benzeri protein arıtma süreci ve kendi uygulamasında 3D hidrojel hücre kapsülleme açıklanmaktadır.

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Burada, bir protokol Kapsüllenen ve bir fluorogenic matriks metalloproteinaz (MMP) functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels hücrelerde kültür sunulan-parçalanabilir peptid. Hücresel MMP ve metabolik aktivite doğrudan bir standart Mikroplaka Okuyucu kullanarak hidrojel kültürler ölçülür.

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Bu makalede, mikroakışkan cihazlar kullanılarak yüksek verimli jelatin metakriloil mikrojel üretimi, mikrojellerin yeniden askıya alınabilir toza (mikro-aerojeller) dönüştürülmesi, granüler hidrojel iskeleleri oluşturmak için mikrojellerin kimyasal montajı ve 3D biyobaskı için korunmuş mikroporoziteye sahip granüler hidrojel biyomürekkeplerinin geliştirilmesi için protokoller açıklanmaktadır.

Jelatin Metakriloil Granül Hidrojel İskeleleri: Yüksek Verimli Mikrojel İmalatı, Liyofilizasyon, Kimyasal Montaj ve 3D Biyobaskı

Öğrenin, hücresiz protein sentezi reaksiyonlarını agaroz hidrojellere gömme yöntemlerini. E. coli lizatları kullanarak eGFP ve mCherry ko-ifadesini gerçekleştirin ve yeni nesil tanı cihazları geliştirin.

Hücresiz Protein Sentezi Reaksiyonlarını Makro Ölçekli Hidrojellere Gömme Yöntemleri

Daha fazla video keşfet