Name: Acinetobacter Biyofilmleri için Miktar Tayini, Canlılık Değerlendirmesi ve Görselleştirme Stratejileri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-04T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Keşfedin, Acinetobacter biyofilmlerini kristal viyole ve konfokal mikroskopi ile nicelendirmeyi ve görselleştirmeyi. Farklı suşların biyofilm oluşumundaki değişkenliği anlamak için bu yöntemleri öğrenin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma, Bilim ve BİT Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Gıda Araştırma Enstitüsü'nün (KFRI) Ana Araştırma Programı (E0210702-03) tarafından desteklenmiştir.

1. Bakteri aşısının hazırlanması
<ol><li>-80 °C'de saklanan gliserol stok şişesini çıkarın.</li>
	<li>Steril bir pipet ucu kullanarak bakteri suşunu (2-10 μL) flakondan çıkarın. NOT: Bu protokolde Acinetobacter suşları, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) ve A. ursingii (24-1) kullanılmaktadır.</li>
	<li>Piyasada bulunan bir kanlı agar plakasını (% 5 koyun kanı ile desteklenmiş triptik soya agarı, Malzeme Tablosuna bakınız) bakterilerle aşılayın. NOT: Besleyici agar veya MacConkey agar gibi diğer ortamlar da kullanılabilir.</li>
	<li>Agar yüzeyini inceltmek için aralıklı alevli steril bir halka kullanarak çizin.</li>
	<li>Agar plakasını bir inkübatöre baş aşağı yerleştirin ve gece boyunca 30 °C'de 20-24 saat inkübe edin.</li>
	<li>Steril bir iğne ile bakteri kültürünün tek bir kolonisini seçin ve kültürle birlikte 5 mL steril beyin kalp infüzyon suyunu (BHI, Malzeme Tablosuna bakınız) aşılayın.</li>
	<li>Aşılanmış suyu 30 °C'de çalkalayan bir inkübatörde gece boyunca 20-24 saat yaklaşık 150 rpm'de inkübe edin.</li>
	<li>Gece kültürünün 1 mL'sini steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve gece kültürünü oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 6.000 × g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı bir pipetle çıkarın.</li>
	<li>Bir girdap kullanarak, peleti 1 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin.</li>
	<li>RT'de 10 dakika boyunca 6.000 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>Pelet, 600 nm'de yaklaşık 0.1'lik bir optik yoğunluğa kadar vorteks kullanarak steril on kat seyreltilmiş BHI'de yeniden süspanse edin. NOT: Yaklaşık 0.1'lik optik yoğunluk yaklaşık 107 CFU/mL'ye eşdeğerdir.</li>
</ol>2. Kristal viyole kullanarak biyofilm ölçümü
<ol><li>Steril polistiren 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 200 μL inokulum ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve iç kuyucukların kurumasını önlemek için en dıştaki kuyucukların her birine 200 μL deiyonize su ekleyin15.</li>
	<li>Negatif kontrol olarak aynı plakanın her bir oyuğuna 200 μL on kat seyreltilmiş BHI ekleyin.</li>
	<li>Plakayı 25 °C'de 24 saat inkübe edin.</li>
	<li>Süpernatanı bir pipetle çıkarın. NOT: Çok kanallı pipet genellikle birden fazla numune için daha uygundur.</li>
	<li>Her bir oyuğa dikkatlice 300 μL PBS ekleyin ve süpernatanı bir pipetle çıkarın. NOT: Çok kanallı pipet genellikle birden fazla numune için daha uygundur.</li>
	<li>Adım 2.5'i iki kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Her bir oyuğa 200 μL kristal viyole çözeltisi (% 1) ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve RT'de 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>2.4-2.6 arasındaki adımları tekrarlayın.</li>
	<li>Her oyuğa 200 μL mutlak etanol ekleyin ve RT'de 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Her kuyucuktan 100 μL elüsyon yeni bir 96 oyuklu plakaya aktarın.</li>
	<li>Bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı 595 nm'de ölçün (bkz.</li>
	<li>Absorbans 2.0'ı aştığında, numunenin mutlak etanolde absorbansın 2.0'ın altına kadar uygun bir şekilde seyreltilmesini sağlayın ve adım 2.11'deki gibi ölçün. Ardından, gözlemlenen değeri seyreltme faktörü ile çarparak numunenin absorbansını (nihai değer) hesaplayın.</li>
	<li>Negatif kontrolün ortalama değerini, aynı kuyu plakasındaki test numunelerinin her bir oyuğunun değerinden çıkararak numunelerin gerçek absorbansını hesaplayın.</li>
</ol>3. Biyofilm canlılık sayımı
<ol><li>Steril polistiren 12 oyuklu plakanın15 her bir oyuğuna 1 mL inokulum (adım 1) ekleyin. Plakayı 25 °C'de 24 saat inkübe edin. Süpernatanı bir pipetle çıkarın.</li>
	<li>Her bir oyuğa dikkatlice 1.5 mL steril PBS ekleyin ve süpernatanı bir pipetle çıkarın. Her kuyucuğa 1 mL steril PBS ekleyin.</li>
	<li>Takılı hücre sıyırıcıları kullanarak kuyunun alt ve duvar yüzeylerini kazıyın.</li>
	<li>Hasat edilen hücre süspansiyonunu 9 mL salin (%0.85 NaCl) ve 10-20 cam boncuk içeren steril bir plastik tüpe (10-1) aktarın (bkz. NOT: Kuyunun alt yüzeyinde kalan artık biyofilm kalıntılarını toplamak için, 10-1 tüpünden salin kullanılarak pipetle yeniden süspanse edilebilir ve aktarılabilir.</li>
	<li>10-1 tüpü maksimum hızda 60 saniye boyunca vorteksleyin.</li>
	<li>10-7'ye kadar 9 mL salin (% 0.85 NaCl) içeren bir sonraki steril tüpe (10-2) 1 mL aktararak 10 kat seri seyreltme yapın.</li>
	<li>Acinetobacter agar üzerine her seyreltmeden 100 μL yayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve agar plakalarını 30 °C'de 24-42 saat inkübe edin.</li>
	<li>Her plakadaki tipik kırmızı kolonilerin sayısını 10 ile 250 arasında manuel olarak sayın.</li>
	<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak her bir kuyucuğun biyofilmindeki canlı hücre sayısını hesaplayın: Canlı hücreler = Koloni sayısı × Seyreltme faktörleri × 10</li>
</ol>4. Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılarak biyofilm görselleştirme
<ol><li>Mikroskobik analiz için amaçlanan steril 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 200 μL inokülum ekleyin.</li>
	<li>Plakayı 25 °C'de 24 saat inkübe edin.</li>
	<li>Süpernatanı bir pipetle çıkarın.</li>
	<li>Her bir kuyucuğa dikkatlice 300 μL filtre ile sterilize edilmiş deiyonize su ekleyin ve süpernatanı bir pipetle çıkarın.</li>
	<li>Adım 4.4'ü tekrarlayın.</li>
	<li>Filtreyle sterilize edilmiş deiyonize suda sırasıyla 10 μM ve 60 μM'lik bir nihai konsantrasyona seyreltilmiş SYTO 9 ve propidyum iyodür karışımını ( Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın.</li>
	<li>Karışımı her bir oyuğa 200 μL'de ekleyin ve plakayı karanlıkta RT'de 20-30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>4.3-4.4 arasındaki adımları tekrarlayın</li>
	<li>Sırasıyla 488 nm ve 561 nm uyarma dalga boyuna ve 499-535 nm ve 568-712 nm emisyon dalga boyu aralığına sahip CLSM kullanarak alt yüzeye bağlı biyofilmleri görselleştirin.</li>
</ol>

Acinetobacter Biyofilm Oluşumunun Değerlendirilmesi ve Biyofilmlerin Karakterizasyonu

<ol><li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+pathophysiological+overview+of+Acinetobacter+infections%3A+a+century+of+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges.</a> Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).</li>
<li>Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+spp.+in+food+and+drinking+water+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter spp. in food and drinking water - A review.</a> Food Microbiology. 95, 103675(2021).</li>
<li>Towner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter%3A+an+old+friend%2C+but+a+new+enemy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter: an old friend, but a new enemy.</a> Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).</li>
<li>Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+hospital+surfaces+in+the+transmission+of+emerging+health+care-associated+pathogens%3A+Norovirus%2C+Clostridium+difficile%2C+and+Acinetobacter+species%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species.</a> American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%3A+multitasking+in+a+shared+space%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix: multitasking in a shared space.</a> Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li>
<li>Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+microbial+%26%2334%3Bprotective+clothing%26%2334%3B+in+extreme+environments%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the microbial &#34;protective clothing&#34; in extreme environments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423(2019).</li>
<li>Gedefie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii+biofilm+formation+and+its+role+in+disease+pathogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+drug+resistance%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review.</a> Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).</li>
<li>Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii.</a> Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).</li>
<li>Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiologica%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii.</a> New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).</li>
<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li>
<li>Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+characteristics+and+transcriptomic+profiling+of+Acinetobacter+johnsonii+defines+signatures+for+planktonic+and+biofilm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells.</a> Environmental Research. 213, 113714(2022).</li>
<li>Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii%3A+genotype-phenotype+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation.</a> Molecules. 24 (10), 1849(2019).</li>
<li>Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-formation+in+clonally+unrelated+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates.</a> Pathogens. 9 (8), 630(2020).</li>
<li>Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+Acinetobacter+and+Bacillus+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+biofilms+against+sodium+hypochlorite+and+extracellular+matrix-degrading+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes.</a> Food Microbiology. 109, 104125(2023).</li>
<li>Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Salmonella+spp.+and+Listeria+monocytogenes+on+plastic+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface.</a> Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).</li>
<li>Boone, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+virulence+phenotypes+and+antibiotic+resistance+in+clinical+strains+of+Acinetobacter+baumannii+isolated+in+Nashville%2C+Tennessee%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee.</a> BMC Microbiology. 21 (1), 21(2021).</li>
<li>Otter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-attached+cells%2C+biofilms+and+biocide+susceptibility%3A+implications+for+hospital+cleaning+and+disinfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection.</a> Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).</li>
<li>Ravishankar, S., Juneja, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+or+resistance+responses+of+microorganisms+to+stresses+in+the+food+processing+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Stress+Adaptation+and+Food+Safety%22%5BJournal%5D)">Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment.</a> Microbial Stress Adaptation and Food Safety. Yousef, A. E., Juneja, V. K. , (2003).</li>
<li>Dewanti, R., Wong, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+culture+conditions+on+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7.</a> International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).</li>
<li>McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii%3A+human+infections%2C+factors+contributing+to+pathogenesis+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).</li>
<li>McQueary, C. N., Actis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii+biofilms%3A+variations+among+strains+and+correlations+with+other+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties.</a> The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Açıklanan protokol kullanılarak, değişen derecelerde Acinetobacter izolatlarının biyofilm oluşumu ölçüldü, görselleştirildi ve biyofilmlerdeki canlı hücreler tahmin edildi (Şekil 1, Şekil 2 ve Şekil 3).
Bu protokolde Acinetobacter'in büyümesi için 30 °C ve biyofilm oluşumu için 25 °C olmak üzere iki farklı sıcaklık kullanılmıştır. 30 °C kullanıldı, çünkü birçok çalışma Acinetobacter'...

Acinetobacter'in hastane enfeksiyonlarına neden olduğu bilinmektedir ve özellikle sağlık tesislerinde insan enfeksiyonu giderek daha fazla bildirilmektedir1. Hastanelerde, sağlık tesislerinde ve gıda ile ilişkili ortamlarda yaygındır 2,3,4. Yatak korkulukları, komodinler, vantilatörlerin yüzeyleri ve lavabolar gibi hastane yüzeyleri dahil ortamlarda uzun süre hayatta kalabilir4. Çevresel yüzeylerde bu tür bir kalıcılık, Acinetobacter4'ün hastane enfeksiyonlarına katkıda bulunan önemli faktörlerden biri olabilir.
Biyofilm, mikrobiyal yaşamın bir şeklidir ve canlı mikrobiyal hücrelerden ve hücrelerden hücre dışı polimerik maddelerden (EPS) oluşan mikrobiyal bir matristir5. Mikrobiyal hücreler matrise gömülüdür ve genellikle ısı, tuzlar, kuruluk, antibiyotikler, dezenfektanlar ve kesme kuvvetlerigibi çevresel streslere karşı oldukça dirençlidir 6,7.
Acinetobacter yüzeylerde biyofilmler oluşturabilir, bu da hastane yüzeyleri de dahil olmak üzere çevresel yüzeylerde uzun süreli sağkalıma ve antibiyotik tedavisinekarşı direncin artmasına katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir 8,9. Ek olarak, Acinetobacter'in biyofilm oluşumu, insan klinik sonuçlarıyla yüksek oranda ilişkili olabilir8. Bu nedenle, Acinetobacter suşlarının biyofilm şekillendirilebilirliği, çevresel sağkalımı ve insan enfeksiyonlarını tahmin etmede göstergelerden biri olabilir 8,10.
Yüzeye bağlı biyofilmler, biyofilm şekillendirilebilirliğini değerlendirmek için ölçülebilir ve görselleştirilebilir. Yüzeye bağlı biyofilmleri ölçmek için, biyofilmler normalde kristal viyole gibi biyofilm boyama boyaları ile boyanır ve boyalar çözelti içinde ayrıştırılır ve optik yoğunluk11 için ölçülür. Biyofilmlerin görselleştirilmesi, biyofilm şekillendirilebilirliğini değerlendirmek için başka bir iyi yaklaşımdır11. Floresan boyalar kullanılarak özgüllüğü kullanan konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM) görselleştirme yöntemi, SEM12,13 gibi diğer tekniklere kıyasla biyofilm morfolojisini karakterize etmek için daha yararlı olabilir.
Biyofilmlerdeki canlı hücreler, biyofilmlerdeki canlı hücrelerin sayısını tahmin etmek için sayılabilir11. Biyofilmlere gömülü canlı hücreler ayrılır, seyreltilir, agar plakalarına yayılır, inkübe edilir ve numaralandırılır. Daha fazla sayıda hücrenin enfeksiyöz dozu karşılaması muhtemel olduğundan, hücre sayısı13,14 ile ilişkili enfeksiyon potansiyelleri gibi biyofilmler hakkında daha ayrıntılı bilgi sağlayabilir.
Bu makale, (1) yüzeye bağlı biyofilmleri ölçmek, (2) biyofilmlerdeki canlı hücreleri saymak ve (3) Acinetobacter'in CLSM'sini kullanarak biyofilmleri görselleştirmek için adım adım protokoller sunmaktadır. Sunulan protokoller, Acinetobacter izolatlarının biyofilm şekillendirilebilirliğini değerlendirme ve biyofilmlerini karakterize etme yöntemlerini açıklamaktadır.

<table><tbody><tr><td>96 oyuklu hücre kültürü plakası</td><td>SPL</td><td>30096</td><td>Polistiren 96 oyuklu plaka</td></tr><tr><td>BHI (Beyin Kalp İnfüzyonu) suyu</td><td>Merck KGaA</td><td>1.10493.0500</td><td></td></tr><tr><td>Kan Agar Taban Plakası</td><td>KisanBio</td><td>MB-B1005-P50</td><td>Acinetobacter</td></tr><tr><td>CHROMagar için büyüme ortamı Acinetobacter</td><td>CHROMagar</td><td>AC092</td><td>Acinetobacter</td></tr><tr><td>Kristal viyole için seçici plaka çözüm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V5265</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer CANLI/ÖLÜ biyofilm canlılık kiti</td><td>Invitrogen</td><td>L10316</td><td>SYTO9 ve propidyum iyodür</td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200 PRO NanoQuant Biyofilm</td><td>ölçümü</td></tr><tr><td>RBC Cam Kaplama Boncukları</td><td>RBC</td><td>RG001</td><td>Cam boncuklar</td></tr> <tr><td>ve mu;-Plaka 96 Kuyu Siyah</td><td>ibidi</td><td>89621</td><td>CLSM için tasarlanmış mikroplaka</td></tr></tbody></table>

acinetobacter biyofilmleri için miktar tayini, canlılık değerlendirmesi ve görselleştirme stratejileri

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter hastane enfeksiyonlarına neden olur ve biyofilm oluşumu hastane ortamları gibi kuru yüzeylerde sağkalıma katkıda bulunabilir. Bu nedenle, biyofilm ölçümü ve görselleştirme, Acinetobacter suşlarının hastane enfeksiyonlarına neden olma potansiyelini değerlendirmek için önemli yöntemlerdir. Mikroplakanın yüzeyinde oluşan biyofilmler, hacim ve hücre sayıları açısından ölçülebilir. Biyofilm hacimleri, kristal viyole kullanılarak boyanarak, yıkanarak, etanol kullanılarak leke çıkarılarak ve ardından bir mikroplaka okuyucu kullanılarak çözündürülmüş boyanın ölçülmesiyle ölçülebilir. Biyofilmlere gömülü hücrelerin sayısını ölçmek için, biyofilmler hücre sıyırıcılar kullanılarak sıyrılır, tuzlu suda hasat edilir, cam boncukların varlığında kuvvetlice çalkalanır ve Acinetobacter agar üzerine yayılır. Daha sonra plakalar 30 °C'de 24-42 saat inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, biyofilmlerdeki hücre sayısını tahmin etmek için kırmızı koloniler numaralandırılır. Bu uygulanabilir sayım yöntemi, karışık tür biyofilmlerdeki Acinetobacter hücrelerini saymak için de yararlı olabilir. Acinetobacter biyofilmleri, floresan boyalar kullanılarak görselleştirilebilir. Biyofilm oluşturmak için mikroskobik analiz için tasarlanmış ticari olarak temin edilebilen bir mikroplaka kullanılır. Daha sonra, alt yüzeye yapıştırılan biyofilmler SYTO9 ve propidyum iyodür boyaları ile boyanır, yıkanır ve daha sonra konfokal lazer tarama mikroskobu ile görselleştirilir.

Protokolü takiben, orijinal olarak mutfak yüzeylerinden izole edilen Acinetobacter izolatlarının biyofilmleri, kristal viyole ile boyanmış polistiren 96 oyuklu bir plaka üzerinde oluşturuldu ve boyalar etanol içinde çözündürüldü ve biyofilm kütlesi için ölçüldü (Şekil 1). Biyofilm sayısı, OD 0.04 ila 1.69 arasında değişen suşlara bağlı olarak büyük ölçüde değişmiştir (Şekil 1). Stepanović ve ark.16 tarafından belirlenen kriterler...

Bu protokol, aşının hazırlanmasını, kristal viyole boya kullanılarak mikrotitre plakalar üzerinde biyofilm miktarının belirlenmesini, biyofilmlerdeki canlı sayımı ve Acinetobacter biyofilmlerinin görselleştirilmesini açıklar.

Acinetobacter Biyofilmleri için Miktar Tayini, Canlılık Değerlendirmesi ve Görselleştirme Stratejileri

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

Biyofilmler canlı mikrobiyal hücrelerden oluşur ve yüzeylerden çıkarılması zordur. Çevremizde yaygın olarak bulunan ve hastane enfeksiyonlarına neden olan Acinetobacter suşlarının da yüzeylerde biyofilm oluşturduğu bilinmektedir. Bu nedenle, Acinetobacter biyofilmlerini hem ölçmek hem de görselleştirmek için yöntemler geliştirmeyi amaçlıyoruz.Protokolümüz, Acinetobacter'in biyofilmlerini ölçmek ve görselleştirmek için basit ve kolay bir yöntem sağlar. Biyofilmlerin içindeki canlı hücre sayısı, canlı sayım yöntemi kullanılarak ölçülür. Araştırma bulgularımız, doğal olarak var olan Acinetobacter vektör suşlarının biyofilm oluşumu için oldukça değişken potansiyellere sahip olduğunu ortaya koymaktadır.Ayrıca, çeşitli biyofilmler içinde belirgin morfolojik farklılıklar olacaktır. Bu, Acinetobacter suşları arasında bu kadar büyük bir varyasyonun nedenlerine odaklanan araştırmaların önünü açtı.

quantification-viability-assessment-visualization-strategies-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kaynak: Tay, S. B. ve diğerleri. Mühendislik Amaçlı Kuorum Söndüren Laktonazlar Kullanılarak Patojenik Biyofilmlerin Anti-Virülent Bozulması.  J. Vis. Exp. (2016)Video, patojenik bir bakteride biyofilm biyokütlesini nicelendirme yöntemini gösteriyor; tedavi edilmemiş kontroller ve yeterli güç söndürme enzimiyle işlenmiş örnekler karşılaştırılıyor. Bu enzim, erken kuluçka sırasında bakteriyel sinyalleri bozarak hücre yapışmasını azaltır. Yıkama ve daha fazla kuluçkadan sonra, kontrol kuyuları...

Patojenik Bakterilerde Enzim Kaynaklı Biyofilm Bastırmanın Nicelendirilmesi

Biyofilmler içindeki üç hücresel ve hücre dışı bileşenin eşzamanlı niceliği ve karşılaştırılması için bir protokol sunulmuştur. Metodoloji, konfokal lazer tarama mikroskobu, biyofilm yapısal analiz ve görselleştirme yazılımı ve istatistiksel analiz yazılımının kullanımını içerir.

Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

Bu yöntemler kağıt amacı tipik insan Mikrobiyal dental plak tespit türler içeren çok tür biyofilm gelişmesi için mikroakışkan sisteminin kullanımını tarif etmektir. Yöntem biyofilm mimarisi, biyofilm canlılığı ve vurgulanır kültür-bağımlı veya kültür-bağımsız analizler için hasat biyofilm bir yaklaşım açıklamak için.

Yüksek verimli bir kullanımı<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikroakışkan Sistemi Ağız Çok türler biyofilm Geliştirmek İçin

Bu çalışma, biyofilm inhibitörlerini ve bunların Bacillus subtilis çok hücrelilik üzerindeki etkilerini incelemek için tekrarlanabilir metodolojilerin geliştirilmesini sunmaktadır.

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

Bu protokol büyümek ve niteliksel konfokal ve elektron mikroskobu ile mantar hif bakteri biyofilm analiz etmek için yeni bir yöntem açıklanır.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Bu protokol, bir slayt odası modeli kullanılarak konak faktörlerine maruz kaldıktan sonra biyofilm gelişiminin görselleştirilmesini açıklar. Bu model, biyofilm gelişiminin doğrudan görselleştirilmesinin yanı sıra bilgisayar yazılım programları kullanılarak biyofilm parametrelerinin analizine olanak tanır.

Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme

Pseudomonas aeruginosa biyofilm mimarisinde antimikrobiyal kaynaklı değişiklikler, kistik fibroz ve kronik akciğer enfeksiyonu olan hastalardan kültürlenen klinik izolatlar arasında farklılık gösterir. Konfokal mikroskobu takiben, anti-enfektif ajanların etkinliğini değerlendirmek için bireysel izolatlar için biyofilm mimarisindeki (örneğin, yüzey alanı, kalınlık, biyokütle) varyasyonları ölçmek için COMSTAT yazılımı kullanılabilir.

Antimikrobiyallerin İn vitro Biyofilm Mimarisi Üzerindeki Etkilerinin COMSTAT Yazılımı Kullanılarak Ölçülmesi

Sentetik kistik fibrozis balgam ortamı (SCFM2), bakteriyel agregaları yüksek çözünürlükte gözlemlemek için hem konfokal lazer tarama mikroskopisi hem de floresan ile aktive hücre sıralama ile birlikte kullanılabilir. Bu makalede, antimikrobiyal tedavi sırasında toplam popülasyonları gelecekteki çalışmalar için bir platform olarak değerlendirme yöntemleri ayrıntılı olarak açıklar.

Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyon Modelinin Gerçek Zamanlı Değerlendirilmesi için Araçlar

Bu protokol, süt endüstrisinde biyofilmlerin eradikasyonunda organik peroksiasitlerin etkinliğini değerlendirmek için statik ve dinamik yöntemleri birleştiren bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bu yaklaşım, biyofilmleri kontrol etmek için yeni biyolojik veya kimyasal formülasyonların etkinliğini test etmek için de kullanılabilir.

Organik Peroksiasitlerin Süt Biyofilmlerinin Eradikasyonunda Etkinliğinin Statik ve Dinamik Yöntemleri Birleştiren Bir Yaklaşım Kullanılarak Değerlendirilmesi

Bu protokol, kristal-mor biyokütle testleri, zaman geçişli faz kontrast kinetikleri, konfokal 3-D/matris haritalama, SEM ultrayapı ve in vivo hamster enfeksiyon modülünü birleştirerek Leptospira biyofilminin işlevsel rolünü geliştirmek, niceliklendirmek, karakterize etmek ve araştırmak için modüler, BSL-2 iş akışı sunar; böylece mutantların standart değerlendirilmesini ve laboratuvarlar arasında anti-biyofilm müdahalelerini mümkün kılar.

Leptospira Biyofilmlerinin Nicel, Yapısal ve Fonksiyonel Analizi İçin Modüler İş Akışı

Keşfedin, Acinetobacter biyofilmlerini kristal viyole ve konfokal mikroskopi ile nicelendirmeyi ve görselleştirmeyi. Farklı suşların biyofilm oluşumundaki değişkenliği anlamak için bu yöntemleri öğrenin.

Acinetobacter Biyofilmleri için Miktar Tayini, Canlılık Değerlendirmesi ve Görselleştirme Stratejileri

Daha fazla video keşfet