Name: Epitel Doku Dinamiğinin İnverted Konfokal Mikroskopta Uzun Süreli İzlenmesi için Kolaylaştırılmış İntravital Görüntüleme Yaklaşımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: Öğrenin, ters konfokal mikroskop kullanarak canlı farelerde intravital görüntüleme yöntemiyle cilt hücre dinamiklerini uzun süreli izlemeyi. Bu yaklaşım, hücre biyolojisi araştırmalarında ev içiostaz ve hastalık ilerlemesi sırasında davranışları incelemeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

K14-mCherry-H2B fareleri için Valentina Greco'ya teşekkür ederiz. Emory Üniversitesi Fizik Bölümü Makine Atölyesi'ne cam lamel diskleri ürettiği için minnettarız. Bu çalışma, ABD Gazi İşleri Bakanlığı BLRD Hizmeti'nden LS'ye Kariyer Geliştirme Ödülü #IK2 BX005370, MJMR'ye NIH Ödülleri RF1-AG079269 ve R56-AG072473 ve MJMR'ye I3 Emory SOM/GT Hesaplama ve Veri Analizi Ödülü ile finanse edilmiştir.

Bu araştırma, Emory Üniversitesi ve Atlanta Gazi İşleri Tıp Merkezi hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Canlı görüntüleme ekinin ters mikroskop aşamasına takılması
<ol><li>3B boyutları ve tasarımı (bkz. Şekil 1 ve Şekil 2A), bir 3B yazıcıyı ve polilaktik asidi (PLA) belirten .stl dosyalarını (Ek Dosya 1, Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3) kullanarak eki oluşturun.</li>
	<li>Ek parçayı (Şekil 2B,C) büyük mikroskop tablası oluğuna dikkatlice yerleştirin (Şekil 2C ve Şekil 3A). Kesici ucun her bir köşesinde bulunan dört vida deliği aracılığıyla kesici ucu sabitlemek için vidaları kullanın (Şekil 2B-C). NOT: Ek parça çift yönlüdür ve mikroskop aşamasının ve anestezi aparatının yönüne bağlı olarak 180° döndürülebilir.</li>
	<li>Isı plakasını geçme tapasına tarafı aşağı bakacak şekilde kaydırın (Şekil 2D), böylece ünite, fiş portu s'nin altından geçecek şekilde alt geçme oluklarının üzerine uzanır.tage (Şekil 3B).</li>
	<li>Ek parçadaki yivli dairesel açıklığı 40x silikon yağına daldırma objektifi ile hizalayın (Şekil 3C) ve objektifin ortasına silikon yağı uygulayın.<ol><li>Daha uzun sürelerde (>1 saat) görüntüleme yapıyorsanız, görüntüleme boyunca lamel / objektif arayüzünde kalacak bol miktarda yağ uygulayın. Lensin kenarlarına yağ dökülmesine izin vermeyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Yivli dairesel açıklık boyunca az miktarda vakumlu gres uygulamak için bir şırınga kullanın ve ek parçaya sızdırmaz hale getirmek için lamel diskini üstüne yerleştirin (Şekil 3D). NOT: Lamel diski, 35 mm x 10 mm'lik bir cam tabanlı hücre kültürü kabının (bir makine atölyesi tarafından gerçekleştirilir) duvarlarının çıkarılmasıyla oluşturulur.</li>
	<li>40x objektifi, yağ cam lamellerin altını öpene kadar yükseltin.</li>
</ol>2. İzofluran konfigürasyonu ve fare hazırlığı
<ol><li>Düşük akışlı elektronik buharlaştırıcı bileşenlerini (anestezi odası, hortum, buharlaştırıcı, kömür kabı) burun konisinin ve bağlı borunun ek parçaya ulaşmasını sağlayacak şekilde konumlandırın (Şekil 3A). DİKKAT: İzofluran bir inhalasyon anestezisidir ve dökülmeleri önlemek ve insan maruziyetini en aza indirmek için dikkatli kullanılmalıdır.</li>
	<li>Kullanmadan önce izofluran şişesinin ağırlığını ölçün ve kaydedin. Elektronik buharlaştırıcının kapağını izofluran şişesine takın.</li>
	<li>Güç kablosunu elektronik buharlaştırıcıya bağlayın. Mavi burun konisi klipslerini kapatın ve odadan kömür kutusuna hava akışına izin vermek için beyaz indüksiyon odası klipslerini açın. Hava akışına izin vermek için makinenin sol tarafındaki kırmızı ortam havası kapağını çıkarın.</li>
	<li>Sistemin 200 mL/dk (düşük akış) ve %2 izofluranda 5 dakika ısınmasına izin verin. NOT: Burun konisi ayarı seçilse de mavi burun konisi çizgisi kapalı, beyaz indüksiyon odası çizgisi açık kalmalıdır.</li>
	<li>Sistem uygun şekilde dengelendikten sonra, kalan izofluranı odadan çıkarmak için hatları temizleyin.</li>
	<li>Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve Yüksek Akış'ı seçin. Hayvanın vücudunu ek parçanın üzerine yerleştirmeden önce tüm fare hazırlığını (yani epilasyon, topikal ilaç dağıtımı, göz merhemi uygulaması vb.) tamamlayın. Ayak parmağı kıstırma refleks yöntemini kullanarak farenin tamamen uyuşturulduğunu onaylayın.<ol><li>Bacak uzatılmışken, fiziksel hasara neden olmadan ayak parmağını sıkıca sıkıştırmak için bir tırnağınızı kullanın. Fare uyarana pozitif bir tepki gösterirse (ör., bacak çekilmesi, ayak seğirmesi, vb.), Herhangi bir reaksiyon gözlenene kadar oda içinde anestezi uygulamaya devam edin. Uygun şekilde uyuşturulduktan sonra, fare solunum hızı dakikada ~ 55-65 nefese kadar yavaşlamalıdır18.</li>
	</ol></li>
	<li>Fare tamamen uyuşturulduğunda, izofluran iletimini durdurmak için tekrar Yüksek Akış'ı seçin. Açmadan önce hazneyi boşaltın ve burun konisinden izofluran vermek için klipsleri (mavi: açık; beyaz: kapalı) ayarlayın. İzofluran dağıtımına devam etmek için burun konisi fareye takılıyken Düşük Akış'ı seçin.</li>
	<li>Ekli burun konisi ile izofluran boruyu, ek parçadaki köşe boru braketinden geçirin (Şekil 3A ve Şekil 5).</li>
</ol>3. İntravital görüntüleme için ek parçaya fare yerleşimi
<ol><li>Isı plakasını kontrolöre (ekli bir anal prob içeren) takın, gücü açın ve plakanın 36 °C'ye ulaşmasını bekleyin (Şekil 4A).</li>
	<li>Anestezi uygulanmış fareyi indüksiyon odasından çıkarın ve ısı plakasının üzerine yerleştirin (Şekil 4B ve Şekil 5A). Farenin inhalan anestezi olmadan aktif olduğu süreyi en aza indirmek için hazneden yerleştirmeye hızlı bir şekilde transfer edin.</li>
	<li>Burun konisini fareye sabitleyin (Şekil 4B,C ve Şekil 5). Gerekirse, burun konisinin açısını ve konumunu daha da sabitlemek için bant kullanın.</li>
	<li>Anal probu takın ve fare vücut sıcaklığı ~36 °C'de sabit olana kadar kontrolör sıcaklığını ayarlayın (Şekil 4A,B). Fare uygun şekilde yerleştirildikten sonra, uygun vücut sıcaklığını daha fazla desteklemek için gerekirse ısıyı hapsetmek için plastik streç film kullanın (Şekil 4C).</li>
	<li>Fareyi, kafa lamel diskiyle hizalanacak şekilde konumlandırın ve metal bir kulak klipsi (Şekil 5A,B) veya bant (Şekil 5C) kullanarak kulağı cam lamellerin ortasına sabitleyin. NOT: Metal kulak klipsinin kulak üzerindeki basıncı, klipsi ek parçaya sabitleyen vida gevşetilerek ayarlanabilir. Klips sıkma esnekliğini artırmak için metal bir yay eklenebilir.<ol><li>Kulak klipsi konumunu değiştirmek için cıvatayı 2.5 mm Alyen anahtarıyla sökün ve ikincil bölgeye aktarın (Şekil 2B,C). Kulak klipsini yeniden monte ederken, klipsi ek parçaya ve ardından rondelayı üstüne yerleştirin. Klipsi döndürmek için hafif bir kuvvetle klipsi güvenli bir şekilde sabitlemek için bir cıvata kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreler odak noktasına gelene kadar objektif z konumlandırmasını ayarlayın (Şekil 6A,D). Deneysel hedeflere göre z-stack ve time-lapse parametrelerini ayarlayın ve görüntü alımına başlayın. NOT: Doğru kurulum sağlanırsa, fare kulağı en az 3 ardışık saat boyunca görüntülenebilir (Şekil 6A',D').<ol><li>Z-yığını sınırları ayarlandıktan sonra, foto ağartmayı en aza indirmek için hiçbir z-düzleminin aşırı doygun olmadığından emin olmak için lazer gücünü ve kazancını ayarlayın. z yığınının toplam kalınlığını, adım numaralarını (Nyquist örneklemesi önerilir) ve zaman aralıklarını kullanarak hızlandırılmış parametreleri belirleyin.</li>
		<li>Anestezi altında hayvan canlılığı, lazerle indüklenen fotoağartma/fototoksisite ve canlı görüntülemenin amacı (yani hücre bölünmesi dinamikleri, hücre-hücre etkileşimleri vb.) dahil olmak üzere birden fazla faktörü kullanarak görüntüleme parametrelerini (zaman aralıkları, toplam görüntüleme süresi vb.) belirleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Görüntülemenin sonlandırılması
<ol><li>Su sirkülasyonlu ısı yastığını açın ve görüntü alımının sonlandırılmasından en az 35 dakika önce Sürekli Döngü ve 30 °C'ye ayarlayın.</li>
	<li>Görüntüleme tamamlandıktan sonra, izofluran iletimini durdurmak için elektronik buharlaştırıcıda Düşük Akış'ı seçin ve fareyi ambulatuvar olana kadar bir ısı yastığına taşıyın.</li>
	<li>Uyandıktan sonra, tamamen yürüyene kadar bir ısı yastığı üzerinde tutmaya devam ederken fareyi transfer kabına geri getirin. Yanıt verene kadar ısı yastığı üzerindeyken fareyi sürekli olarak izleyin.</li>
	<li>Elektronik buharlaştırıcıda, Menü Seç'e > Anestezik Kontrol'e tıklayın > Boş'a tıklayın. İzofluran şişesini sistemden çıkarın ve üreticinin kapağını şişeye geri yerleştirin.</li>
	<li>İzofluran şişesinin ve kömür bidonunun ağırlığını ölçün ve ağırlıkları kütüğe girin. Kömür bidonunun ağırlığı temel ölçümün 50 g üzerinde olduğunda, bidonu atın ve yeni bir ünite ile değiştirin. İzofluranı kilitli kutuya geri koyun.</li>
	<li>Lamel diskini çıkarın ve lens kağıdı ve lens solüsyonu ile silerek temizleyin. Yeniden kullanım için çizikleri önlemek için uygun şekilde saklayın.</li>
	<li>Anestezi tüpünü insert braketinden çıkarın ve insert parçayı mikroskop aşamasından sökün.</li>
</ol>

Cilt hücresi dinamiklerini izlemek için ters mikroskop kullanarak intravital görüntüleme

<ol><li>Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+metastatic+pulmonary+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment.</a> Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).</li>
<li>Nal Chen,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+promote+glioblastoma+tumor+cell+migration+after+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy.</a> Cells. 11 (14), 2196(2022).</li>
<li>Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+to+study+platelet-leukocyte-endothelial+interactions+in+the+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver.</a> Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).</li>
<li>Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+imaging+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multidimensional imaging of breast cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 13 (5), (2022).</li>
<li>Fischer, M., Edelblum, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+to+visualize+murine+small+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration.</a> Current Protocols. 2 (8), (2022).</li>
<li>Pineda, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+hair+follicle+regeneration+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).</li>
<li>Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+to+study+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging to study cancer progression and metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).</li>
<li>Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+techniques+to+image+wound+healing+in+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin.</a> Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).</li>
<li>Pal Arndt,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+3D+intravital+look+at+the+juxtaglomerular+renin-cell-niche+reveals+an+individual+intra%2Fextraglomerular+feedback+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system.</a> Frontiers in Physiology. 13, 980787(2022).</li>
<li>Oal Yam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+conversion+to+a+tumor-killing+phenotype+underpins+effective+microbial+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy.</a> Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).</li>
<li>Huang, S., Rompolas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+for+intracutaneous+imaging+of+stem+cell+activity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice.</a> Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).</li>
<li>Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximum+imaging+depth+of+two-photon+autofluorescence+microscopy+in+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008(2011).</li>
<li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li>
<li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+between+confocal+and+multiphoton+microscopy+for+rapid+histopathological+evaluation+of+unfixed+human+breast+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021(2016).</li>
<li>Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-induced+cell+death+and+epithelial+phagocytosis+regulate+hair+follicle+stem+cell+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool.</a> Nature. 522, 94-97 (2015).</li>
<li>Ral Li,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfra+marks+a+cellular+lineage+with+distinct+contributions+to+myofibroblasts+in+lung+maturation+and+injury+response%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Tal Tumbar,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303 (5656), 359-363 (2004).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563(2011).</li>
<li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634(2023).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu çalışmada, inverted konfokal mikroskoplarda sağlam fare derisi epitelinin stabil, uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştıran yeni bir araç sunuyoruz. Bu buluş, en yaygın ve ucuz 3D yazdırılabilir malzeme olan PLA'dan yapılmıştır; Bu ek parça için tüm şirket içi 3D baskı maliyetleri 5 < tutarındadır. İki ayrı kesici uç parçası (Şekil 1, Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2) ayar vidaları kullanılarak kolayca monte edilebilir (bkz. Malzeme Tablosu).</...

İntravital mikroskopi, hücre davranışlarının bozulmamış in vivo ortamlarında izlenmesini sağlayan güçlü bir araçtır. Bu benzersiz yöntem, akciğer1, beyin2, karaciğer3, meme bezi4, bağırsak5 ve cilt6 dahil olmak üzere karmaşık memeli organ sistemlerinin iç işleyişi hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Ayrıca, bu yaklaşım, tümör gelişimi 7, yara iyileşmesi 8,9, inflamasyon 10 ve diğer çeşitli patolojiler sırasında hücre davranış değişikliklerini ortaya çıkarmıştır. Bu çalışmada, sağlam fare derisinde canlı epitelyal ve stromal dinamikleri görüntülemek için intravital mikroskopinin erişilebilirliğini artırmaya odaklandık. Memeli derisindeki hücre davranışlarını anlamak, bu dokunun olağanüstü rejeneratif ve tümörjenik kapasitesi nedeniyle yüksek klinik öneme sahiptir.
Farelerde intravital görüntüleme, doku derinliklerinde >100 μm11,12 yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlama yetenekleri nedeniyle öncelikle dik çoklu foton mikroskopları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu cihazlar, daha kullanıcı dostu ve uygun maliyetli olan, kültürlenmiş hücreleri görüntüleme yeteneği sağlayan, görüntü elde etme sırasında tam karanlık gerektirmeyen ve genellikle daha güvenli olan ters konfokal mikroskopların çok yönlülüğünden ve daha genel erişilebilirliğinden yoksundur13,14. Bu çalışmada, bu yaklaşımı ters konfokal mikroskoplar için uyarlayarak intravital görüntüleme erişilebilirliğini önemli ölçüde artıran yeni bir araç sunuyoruz.
Burada, ters konfokal bir mikroskopta fare kulağı derisinin stabil, uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştırmak için birkaç temel özelliği içeren 3D baskılı özel bir sahne eki tasarımı sunuyoruz (Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5). Bu özel özellikler, görüntüleme sırasında yetişkin bir farenin tüm gövdesinin tamamen düz durmasına izin veren bir ofset objektif deliği içerir. Bu, fare vücut hareketlerinin görüntüleme üzerindeki titreşimsel girişimini en aza indirir ve genellikle intravital görüntüleme ile birleştirilen bir uygulama olan solunumu azaltmak için ketamin ve ksilazin uygulama ihtiyacını ortadan kaldırır6. Ek olarak, kesici uçtaki köşe parantezleri, farenin yüzüyle hizalanacak şekilde bir izofluran burun konisini doğru şekilde konumlandırır, metal bir kulak klipsi, fare kulağını özel olarak oluşturulmuş bir lamel diskine sabitler ve isteğe bağlı çıkarılabilir kapalı döngü biofeedback ısı plakası, uzun görüntüleme oturumları sırasında fare vücut sıcaklığını desteklemek için ek parçanın içinde aynı hizada bulunur. Fare kafasının ve kulağının düz durması için gerekli olan düz bir yüzey sağlayan özel lamel diski, bir makine atölyesinde, genel bir lamel içeren hücre kültürü kabının duvarlarının kaldırılmasıyla üretildi. Lamel diski ve özel sahne eki ile birlikte 40x silikon yağına daldırma lensinin (1,25 sayısal açıklık [N.A.], 0,3 mm çalışma mesafesi) kullanılması, kulak dermisinin derinliklerinde >50 μm derinliğinde yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlar.
Bu yeni ters çevrilmiş mikroskop aşaması ekinin işlevselliğini test etmek için, canlı bir transgenik K14-H2B-mCherry15 yetişkin farenin kulağında 3 saatlik bir zaman seyri boyunca tüm epidermal epitel katmanlarını kapsayan z-yığınlarını yakaladık (bu fare serisindeki epitel çekirdekleri kırmızı bir floresan etiketi içerir) (Şekil 6A-A'). Ayrıca, canlı bir transgenik Pdgfra-rtTA16'nın kulağında 3 saatlik bir zaman seyri boyunca cilt dermisi içindeki birkaç fibroblast tabakasını kapsayan z-yığınlarını yakaladık; pTRE-H2B-GFP17 yetişkin fare (bu fare serisindeki fibroblast çekirdekleri, doksisiklin indüksiyonunu takiben yeşil bir floresan etiketi içerir) (Şekil 6B-D'). Yüksek çözünürlüklü verilerimiz, x, y ve z düzlemlerinde sapma olmaması nedeniyle tutarlı bir kararlılık göstermekte ve böylece bu yeni intravital görüntüleme aracının ters mikroskoplarda kullanım için etkinliğini kanıtlamaktadır. Daha da önemlisi, bu 3D baskılı aşama ekinin boyutları, Ek Dosya 1, Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3'te açıklandığı gibi, herhangi bir ters çevrilmiş mikroskoba uyacak şekilde ayarlanabilir ve objektif açıklığın konumu, ilgilenilen belirli bir doku ve/veya hayvan modelinin görüntülenmesine daha iyi uyması için ek içindeki alternatif konumlara taşınabilir. Bu buluş, böylece bireysel laboratuvarları veya çekirdek tesis konfokal erişimi olan araştırmacıları, bu aracı benzersiz intravital görüntüleme ihtiyaçlarına uyarlamak için güçlendirebilir ve böylece çeşitli in vivo hücre biyolojisinin değerlendirilmesini kolaylaştırabilir.

<table><tbody><tr><td>3D Yazıcı</td><td>Qudi Tech</td><td>i-PLA</td><td>malzeme kullanarak hızlı 3D baskılar</td></tr><tr><td>40x 1.25NA silikon objektif lens</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxR Lazer Tarama Konfokal Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pamuk Uçlu Çubuk</td><td>VWR</td><td>76337-046</td><td>Krem / merhem uygulaması</td></tr><tr><td>Doksisiklin hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>Pdgfra-rtTA'da fibroblast çekirdeklerinin GFP etiketlemesini indükler; pTRE-H2B-GFP fareler</td></tr><tr><td>Düz Başlı Tornavida (2,5 mm)</td><td></td><td></td><td>Mikroskop aşamasına Affiix kesici uç</td></tr><tr><td>Düz Başlı Vidalar x 4 (#6-32)</td><td>Nikon</td><td></td><td>Mikroskop aşamasına vida yerleştirme</td></tr><tr><td>Cam Alt Kültür Kabı</td><td>chemglass Yaşam Bilimleri</td><td>CLS-1811-002</td><td>Canlı ek parça ile uyumlu lamel diski olarak kullanılmak üzere çanağın duvarları çıkarılarak değiştirildi; 35 mm genişliğindeki disk, 20 mm genişliğinde cam lamel içerir; çanak duvarlar vardı makine atölyesi tarafından kaldırıldı</td></tr><tr><td>Isı plakası kontrolörü</td><td>Physitemp</td><td>TCAT-2LV</td><td>Hayvan Sıcaklık Kontrol Cihazı - Alçak Gerilim; Fare vücut ısısının izlenmesi için anal prob eki</td></tr><tr><td>Altıgen Anahtar (1,5 mm)</td><td></td><td></td><td>M3 ayar vidası ayarları için</td></tr><tr><td>Altıgen Anahtar (2,5 mm)</td><td></td><td></td><td>Metal kulak klipsindeki gerginliği ayarlayın</td></tr><tr><td>İntravital Görüntüleme Eki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Med-Vet International</td><td>HPA030782-100uL</td><td>Fare anestezisi</td></tr><tr><td>Etiketleme Bandı (veya Scotch Tape)</td><td>VWR</td><td>10127-458</td><td>Kulağı lamel için hareketsiz hale getirmek için metal kulak klipsine alternatif</td></tr><tr><td>Kulak klipsi olarak kullanılan</td><td>metal tutturucu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fare: C57BL/6-PDGFRAEM1(rtTA)Xsun/J</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>RRID: IMSR_JAX:034459</td><td>Fibrroblasta özgü promotör sürüş doksisiklin ile indüklenebilir rtTA ekspresyonu</td></tr><tr><td>Fare: K14-H2BPAmCherry</td><td>Yale Üniversitesi'nden Dr. Valentina Greco'nun izniyle</td><td>epidermal epitel hücre çekirdeklerini mCherry ile etiketler; metinde "K14-H2B-mCherry" olarak anılır</td> Fare: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J Jackson Laboratuvarı RRID: IMSR_JAX:005104 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>&nbsp; Pdgfra-rtTA ile birleştirildiğinde ve doksisiklin ile indüklendiğinde GFP'li fibroblast çekirdeklerini etiketler</td></tr><tr><td>Çok Amaçlı Sızdırmazlık Sargısı</td><td>Glad</td><td></td><td>Fare sıcaklığını artırın</td></tr><tr><td>Optixcare</td><td>VWR</td><td>MSPP-078932779</td><td>Göz yağlayıcı</td></tr><tr><td>Ayar vidaları x 3 (M3; 6 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>SS3M6</td><td>Isı plakası modülü için ek parça</td></tr><tr><td>Silikon Daldırma Yağı</td><td></td><td></td><td>40x silikona uygulanır objektif</td></tr><tr><td>Küçük Hayvan Isıtma Plakası</td><td>Physitemp</td><td>HP-4M</td><td>Hayvana ısı sağlar</td></tr><tr><td>Somnoflow Düşük Akışlı Elektronik Buharlaştırıcı</td><td>Kent Scientific</td><td>SF-01</td><td>Fare anestezisi</td></tr><tr><td>Vakum Gres</td><td>Flinn Scientific</td><td>AP1095</td><td>Veet</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> epilasyonu eklemek için lamel diski contalar<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Görüntüleme sonrası fare canlanması için</td> <td>su sirkülasyonlu ısı yastığı</td><td>Stryker Medical</td><td>TP700</td></tr></tbody></table>

epitel doku dinamiğinin İnverted konfokal mikroskopta uzun süreli İzlenmesi için kolaylaştırılmış İntravital görüntüleme yaklaşımı

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Normal ve anormal in vivo hücre davranışlarını anlamak, hastalığın başlamasını ve ilerlemesini engellemek için klinik müdahaleler geliştirmek için gereklidir. Bu nedenle, doku yapısının ve bileşiminin bozulmadan kaldığı hücre dinamiklerinin yerinde gözlemlenmesini kolaylaştıran görüntüleme yaklaşımlarını optimize etmek çok önemlidir. Epidermis, vücudun en dış bariyeri ve aynı zamanda en yaygın insan kanserlerinin, yani kutanöz cilt karsinomlarının kaynağıdır. Cilt dokusunun erişilebilirliği, noninvaziv intravital mikroskopi kullanarak bozulmamış hayvanlarda epitelyal ve dermal hücre davranışlarını izlemek için eşsiz bir fırsat sunar. Bununla birlikte, bu sofistike görüntüleme yaklaşımı, öncelikle, çoğu araştırmacı için giriş için önemli bir engel teşkil eden dik çoklu foton mikroskopları kullanılarak elde edilmiştir. Bu çalışma, canlı transgenik farelerde kulak derisinin uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştıran, ters konfokal mikroskoplarla kullanıma uygun, özel olarak tasarlanmış, 3D baskılı bir mikroskop aşaması eki sunmaktadır. Ters mikroskop markasına ve tercih edilen modele uyacak şekilde özelleştirilebilen ve ek organ sistemlerini görüntülemek için uyarlanabilen bu çok yönlü buluşun, intravital mikroskopinin erişilebilirliğini önemli ölçüde artırarak daha büyük bilimsel araştırma topluluğu için paha biçilmez olacağına inanıyoruz. Bu teknolojik ilerleme, normal ve hastalık bağlamlarında canlı hücre dinamikleri hakkındaki anlayışımızı güçlendirmek için kritik öneme sahiptir.

Canlı görüntüleme ekinin ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop üzerine uygun şekilde monte edilmesi ve ek parçanın üzerine transgenik bir farenin uygun şekilde yönlendirilmesi, ≥1 saatlik bir süre boyunca floresan etiketli, canlı kulak dokusunun z-yığınlarının elde edilmesiyle doğrulanır ve x, y- ve z eksenlerinde minimum sapma kanıtı vardır. Görüntüler tutarlı aralıklarla yakalanmalıdır (aralık süresi biyolojik soruya, floresan sinyalinin gücüne vb. bağlı olacaktır), böylece hücre dinamikleri ve görüntü kayması zaman iç...

Protokol, ters konfokal mikroskopi kullanarak intravital görüntülemeyi basitleştirmek için yeni bir araç sunar.

Epitel Doku Dinamiğinin İnverted Konfokal Mikroskopta Uzun Süreli İzlenmesi için Kolaylaştırılmış İntravital Görüntüleme Yaklaşımı

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Ters konfokal mikroskop kullanarak canlı fareler üzerinde intravital görüntüleme yapmak için bir araç geliştirdik. Bu, homeostaz boyunca cilt hücresi dinamiklerini izlememizi ve hastalığın başlangıcı ve ilerlemesi sırasında hücre davranışlarını karşılaştırmamızı sağlar. Multifoton mikroskobu, intravital hücre takibini sağlamak için uygulanan birincil yaklaşımdır.Bununla birlikte, bu mikroskopların dezavantajları arasında sınırlı günlük görüntüleme çok yönlülüğü, yüksek maliyet ve teknik karmaşıklık yer alır. Yeni aracımız, in vivo intravital görüntüleme için çok yönlü ters konfokal mikroskopların kullanılmasını sağlar. Tasarım dosyasını değiştirerek, sahne ekleme boyutları, herhangi bir ters mikroskop markasına uyacak şekilde özelleştirilebilir.Objektif deliği, tercih edilen herhangi bir hayvan modeline ve dokusuna uyacak şekilde yeniden boyutlandırılabilir ve yeniden konumlandırılabilir.

streamlined-intravital-imaging-approach-for-long-term-monitoring

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Xenopus embriyonik epitel, epitel morfolojilerinden sırasında kutup geliştirme ve şekil değişikliği gibi hücre davranışlarını incelemek için ideal bir model sistem . Geleneksel sabit örnekleri histoloji giderek canlı hücre konfokal görüntüleme tarafından tamamlanmaktadır. Burada, kurbağa dokularda izole ve canlı hücre konfokal mikroskopi kullanılarak canlı epitel hücreleri ve hücre iskeletinin görselleştirmek için yöntemler göstermektedir.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Intraoküler nakli ve konfokal mikroskopi birleştirerek yeni bir yaklaşım aşılı dokuların içinde tek hücreli çözünürlüğe sahip uzunlamasına, non-invaziv, gerçek zamanlı görüntüleme...

Boyuna, Non-invaziv için Eye Ön Kamara içine Nakli<em&gt; In vivo</emGerçek zamanlı Tek hücreli Çözünürlük&gt; Görüntüleme

Hücre dışı matris yara iyileşmesi, iltihap ve kanser gelişimi sürecinde önemli bir yeniden şekil alır. Biz lifimsi dinamiklerinin yanı sıra Epifloresans veya iki-foton mikroskopi kullanılarak yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip örgü benzeri matris bileşenleri görselleştirmek için yeni bir Intravital immunofloresan mikroskopi yaklaşım sunmak.

Epifluoresan ile Doku Matrix Bileşenler ve İki foton Mikroskopi uzun vadeli Intravital İmmünofloresan Görüntüleme

Eldeki gelişimsel süreçleri on gün içinde bir zamansal degrade üzerinde çalışacak, çünkü embriyonik memeli Kokleanın Canlı görüntüleme zordur. Burada beş gün boyunca bir floresan raportör fare alınan embriyonik koklear eksplant doku görüntüleme sonra kültürleme ve için bir yöntem mevcut.

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Bu protokol, tek bir hücre çözünürlükte in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak çok-etkileşimlerin uzatılmış zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için multiphoton mikroskobu kullanımını tarif eder.

Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme

Bu protokol, vakumla stabilize edilmiş bir görüntüleme penceresi kullanarak sağlam akciğerin gerçek zamanlı olarak uzun süreli yüksek çözünürlüklü, tek hücreli görüntülemesini gerçekleştirmek için çoklu foton mikroskobunun kullanımını açıklar.

Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi

Bu iletişim kuralı transgenik fareler hücre özgü floresan işaretleri ifade intravital görüntüleme açıklar. İntravital görüntüleme implante edilebilir windows üzerinden süreçlerin mikroskobik görselleştirme mümkündür kullanarak yaşayan hayvanlarda yüksek çözünürlüklü gözlemler için non-invaziv bir yöntem sağlar. Bu yöntem boyuna işlemleri incelemek özellikle kullanışlıdır.

Tümör ilişkili damarlara kullanmanın intravital mikroskobu gelişmiş Dorsal deri kıvrım pencere Chambers transgenik floresan fareler üzerinde

Biz GFP etiketli γδ IELS görselleştirmek için bir yöntem açıklamak, ters dönen disk konfoksel mikroskobu tarafından murine ince bağırsak intravital görüntüleme kullanarak. Bu teknik, 4 h 'ye kadar mukoza içindeki canlı hücrelerin takibini sağlar ve çeşitli bağırsak immün-epitelyal etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

İntravital mikroskopiden yararlanan burada sunulan yöntem, canlı hayvanlarda bağırsak epitel hücresi dökülmesinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesidir. Bu nedenle anestezili farelerin topikal lekeli bağırsak mukozası (acriflavine ve rhodamineB-dextran) konfokal mikroskopi kullanılarak tek hücreçözünürlüğe kadar görüntülenir.

İntravital Mikroskopi Tabanlı Bir Yaklaşım Bağırsak Geçirgenliği ve Epitel Hücre Dökülme Performansını Değerlendirmek için

Burada, doğrudan ilgilenilen dokuya/organa ve cilde yapıştırılabilen optik olarak net, silikon pencereler kullanılarak uzun süreli intravital görüntüleme için bir yaklaşım sunulmuştur. Bu pencereler şu anda sahada kullanılan diğerlerinden daha ucuz ve çok yönlüdür ve cerrahi yerleştirme hayvanlarda sınırlı iltihaplanma ve sıkıntıya neden olur.

Şeffaf Silikon Pencerelerle Uzunlamasına İntravital Görüntüleme

Lökosit ve trombositlerin işe alınması, arteriyogenez sırasında kollateral arterlerin etkili büyümesi için gerekli olan önemli bir bileşeni oluşturur. Multifoton mikroskopisi, arteriyogenez sırasında lökosit alımını ve ekstravazasyonunu incelemek için in vivo yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe ve daha az foto-toksisiteye sahip hücre dinamiklerini izlemek için etkili bir araçtır.

Bir Murin Arka Bacak Modelinde Arteriyogenez Sırasında Lökosit Alımını İzlemek için Multifoton İntravital Görüntüleme

Öğrenin, ters konfokal mikroskop kullanarak canlı farelerde intravital görüntüleme yöntemiyle cilt hücre dinamiklerini uzun süreli izlemeyi. Bu yaklaşım, hücre biyolojisi araştırmalarında ev içiostaz ve hastalık ilerlemesi sırasında davranışları incelemeyi kolaylaştırır.

Epitel Doku Dinamiğinin İnverted Konfokal Mikroskopta Uzun Süreli İzlenmesi için Kolaylaştırılmış İntravital Görüntüleme Yaklaşımı (Video) | JoVE Journal

Epitel Doku Dinamiğinin İnverted Konfokal Mikroskopta Uzun Süreli İzlenmesi için Kolaylaştırılmış İntravital Görüntüleme Yaklaşımı

Daha fazla video keşfet