Name: Doku Desenini ve Organogenezi İncelemek için Kuş Derisi Eksplantlarının Kullanılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Öğrenin, kuş embriyo deri eksplant kültürleriyle doku deseni ve organogenez süreçlerini incelemeyi. Bu yöntem, rejeneratif tıp ve gelişim biyolojisi araştırmalarında moleküler mekanizmaları anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH NIAMS hibesi R37 AR 060306, R01 AR 047364 ve RO1 AR078050 tarafından desteklenmektedir. Çalışma aynı zamanda USC ile Tayvan'daki Çin Tıp Üniversitesi arasında ortak bir araştırma sözleşmesi ile de destekleniyor. USC BISC 480 Gelişimsel Biyoloji 2023 sınıfına, bu kuş deri kültürü protokolünü çeşitli laboratuvar modülleri sırasında başarıyla test ettikleri için teşekkür ederiz.

1. Tavuk derisi eksplant kültürü (Şekil 1)
<ol><li>Döllenmiş tavuk yumurtalarını nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 38 °C'de kuluçkaya yatırın ve Hamburger ve Hamilton14'e göre hazırlayın.<ol><li>Aşama 28'de (~ E5.5), uzvun ikinci basamağı ve üçüncü parmağı diğerlerinden daha uzundur; Üç basamak ve dört ayak parmağı belirgindir.</li>
		<li>Aşama 29'da (~ E6), kanat dirsekten bükülür; İkinci basamak diğerlerinden belirgin şekilde daha uzundur.</li>
		<li>Evre 30'da (~ E6.5), omuriliğin her iki yanında iki dorsal tüy tomurcuğu sırası brakiyal seviyede ve bacak seviyesinde üç sıra görülür.</li>
		<li>Aşama 31'de (~ E7), jumbo-sakral seviyelerde ~ 7 sıra tüy vardır.</li>
		<li>32. aşamada, bacak seviyesinde on bir veya daha fazla sıra tüy tomurcuğu bulunur.</li>
	</ol></li>
	<li>Hanks'in tamponlu tuzlu su çözeltisi (HBSS) veya fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 60 mm'lik bir Petri kabına 28-32 evre bir tavuk embriyosu yerleştirin.<ol><li>Embriyo sırt derisini alt boyun ile kuyruk bölgesi arasında inceleyin. Kafayı boyundan çıkarmak için makas kullanın. Uzantılar dışa doğru yayılacak şekilde vücudun ventral tarafını aşağı doğru konumlandırmak için uzuv tomurcuklarını nazikçe çekin.</li>
		<li>Saatçinin forsepslerini veya keskin yaylı makası kullanarak embriyo gövdesinin iki yan tarafı boyunca deride önden arkaya bir kesi yapın. Uzuv tomurcuklarını uzunlamasına sıkıştırarak vücudu bir çift forseps ile stabilize ettiğinizden emin olun. Saatçinin forsepslerini kullanarak cildi boyundan kuyruk bölgesine veya kuyruktan boyuna kadar nazikçe soyun.</li>
	</ol></li>
	<li>Soyulmuş cilde bağlı kalan deri altı dokuları nazikçe çıkarın ve keskin yaylı makasla cildin kenarlarını düzeltin.</li>
	<li>% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve Penisilin / streptomisin çözeltisi (1:100 seyreltilmiş) ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's besiyerinden (DMEM) 2 mL / kuyucuğu 6 oyuklu bir tabakta bir kuyuya ekleyin. Besiyeri ve antibiyotikler eklendikten sonra, ortam kültür ekinin dışında olacak şekilde kuyucuğun içine steril bir doku kültürü eki yerleştirin.</li>
	<li>Cildi bir spatula ile epidermis yukarı bakacak ve mezenkim iç zarı aşağı bakacak şekilde kültür ekine aktarın. Cildin herhangi bir kırışıklık olmadan düz durmasını sağlamak için, cildi HBSS'deki spatulanın üzerine çekin. Cildin katlanmadan transferini kolaylaştırmak için cildi sıvı ile spatuladan kaydırın.</li>
	<li>200 μL'lik bir pipet ile kültür ekindeki fazla HBSS'yi çıkarın. Bir hava-sıvı arayüzü sağlamak için eksplantı yarı ıslak tutmak için kültür ekinin içinde ince bir HBSS tabakası bırakın.</li>
	<li>Deri eksplant kültürlerini %5 CO2 ve% 95 hava kullanarak 37 ° C'de inkübe edin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin. NOT: Bu prosedür yayınlanmıştır4. Bu kültür sistemi, bıldırcın veya ispinoz derisi eksplant kültürleri gibi diğer kuşların derileri ile de kullanılabilir.</li>
</ol>2. Tavuk derisi epitelyal-mezenkimal rekombinasyon (Şekil 2)
<ol><li>Döllenmiş tavuk yumurtalarını 38 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın ve embriyoları Hamburger ve Hamilton14'e göre evrelendirin (bölüm 1.1).</li>
	<li>% 0.25 etilendiamintetraasetik asit (EDTA) tamponu ile 2 adet kalsiyum-magnezyum içermeyen (CMF) salin hazırlayın.<ol><li>10x CMF tamponu yapın (NaCl (1.37 M) 80 g, KCl (0.04 M) 3 g, NaH2PO4 (0.004 M) 0.5 g, KH2PO4 (2 M) 0.25 g, NaHCO3 (0.12 M) 10 g, glikoz (0.1 M) 20 g 1.000 mL damıtılmış suda. PH'ı 7.3'e ayarlayın. % 0.25 EDTA tamponu ile 100 mL 2x CMF yapmak için, EDTA önce 80 mL damıtılmış su içinde çözülmeli, daha sonra% 0.25 EDTA çalışma çözeltisi ile 2x CMF yapmak için 20 mL 10x CMF tamponu eklenmelidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Evre 30-32 tavuk embriyo dorsal derilerini yukarıda tarif edildiği gibi HBSS'de diseke edin (bölüm 1.2) ve bunları buz üzerinde% 0.25 EDTA ile 2x CMF salin içinde 15-20 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Saatçinin forsepslerini kullanarak epitel ve mezenkimi dikkatlice ayırın. Ayrılan epitel ve mezenşimi HBSS içeren temiz bir kaba aktarın.</li>
	<li>Önce mezenşimi HBSS içeren bir Petri kabına yerleştirerek epiteli mezenşim ile yeniden birleştirin, ardından epiteli mezenşimin üzerine yerleştirin. Epiteli mezenşim ile aynı ön-arka eksen boyunca yerleştirin veya hangi bileşenin cilt morfogenezinin farklı yönlerini düzenlediğini belirlemek için epiteli mezenşimin ön-arka ekseninden 90o çevirin.</li>
	<li>Yeniden birleştirilmiş derileri, büyüme için 6 oyuklu kültür kaplarındaki kültür eklerine aktarın ve yeniden birleştirilmiş derinin etrafındaki fazla HBSS'yi çıkarın.</li>
	<li>Ek parçanın dışındaki kuyucuğa% 10 FBS ile 2 mL DMEM kültür ortamı yerleştirin. Bir hava-sıvı arayüzü sağlamak üzere eksplantı yarı ıslak tutmak için ekleme haznesinin içine ince bir DMEM tabakası yerleştirin.</li>
	<li>Cilt rekombinantlarını 37 ° C'de% 5 CO2 ve% 95 hava karışımı içinde inkübe edin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin. Diseksiyon mikroskobuna monte edilmiş bir kamera ile hızlandırılmış fotoğrafçılık kullanarak cilt gelişiminin ilk cilt aşamalarındaki fenotipik değişiklikleri belgeleyin. NOT: Bu prosedür yayınlanmıştır11.</li>
</ol>3. Tavuk derisinin sulandırılması (Şekil 3)
<ol><li>Döllenmiş tavuk yumurtalarını 38 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın ve embriyoları Hamburger ve Hamilton14'e göre evrelendirin (bölüm 1.1).</li>
	<li>HBSS'de evre 30-33 tavuk embriyo dorsal derilerini inceleyin. Derileri, yukarıda açıklandığı gibi buz üzerinde 15-20 dakika boyunca% 0.25 EDTA ile 2x CMF salin içinde inkübe edin (bölüm 2.3).</li>
	<li>Saatçinin forsepslerini kullanarak epitel ve mezenkimi dikkatlice ayırın. Ayrılan epitel ve mezenkimi buz üzerinde HBSS'ye aktarın. NOT: Epiteli mezenşimden ayırırken epitelin bazal tabakasına zarar vermemeye dikkat edin.</li>
	<li>Ayrılan mezenşimi 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın ve PBS'de yapılan %0.1 kollajenaz / tripsin çözeltisi ile 37 ° C'lik bir su banyosunda 10-15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Tek hücreli bir süspansiyon yapmak için cilt mezenşimini bir Pasteur pipeti ile ayırın. Sindirimi durdurmak için% 10 FBS ile DMEM ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri 5 dakika boyunca 233 × g'da pelet ve santrifüjleyin. Hücreleri 2 × 107 hücre / mL konsantrasyonda kültür ortamı ile yeniden süspanse etti. NOT: Bu adımda, mezenkimal hücreler, gen transdüksiyonu için buz üzerinde 2-3 saat boyunca virüs içeren ortamda yeniden süspanse edilebilir.</li>
	<li>6 oyuklu bir tabağın bir oyuğuna bir hücre kültürü eki yerleştirin. Doku kültürü ekine 10 μL 2 × 107 hücre / mL mezenkimal hücre bırakın. Ekin dışındaki kuyucuğa% 10 FBS içeren 2 ml DMEM kültür ortamı yerleştirin. Kaplanmış mezenkimal hücreleri, hücrelerin insert membranına yerleşmesine izin vermek için% 5 CO2 ve% 95 hava inkübatörü kullanarak 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Sağlam epiteli, 1 mL'lik bir pipet kullanarak epitel bazal hücre tabakası mezenkimal hücrelere bakacak şekilde kaplanmış mezenkimal damlacığın üzerine aktarın. NOT: Epitel mezenkimal damlacığa aktarılırken, mezenkimal hücreler rahatsız edilmemelidir.</li>
	<li>Sulandırılmış cildin eksplant yapmasını sağlamak için sağlam epiteli mezenşim üzerinde düzleştirin. Hava-sıvı bir arayüz sağlamak için sulandırılmış cilt eksplantını yarı ıslak tutmak için ek parça üzerinde ince bir ortam tabakası bırakın. Sulandırılmış deri eksplantını 37 °C'de %5 CO2 ve %95 hava inkübatörde inkübe edin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin. NOT: Bu prosedür yayınlanmıştır13.</li>
</ol>

Avian Embryonic Skin Explant Kültür Protokollerinin Kapsamlı Bir Derlemesi

<ol><li>Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLucas%2C+AM+%22Agriculture+Handbook%22">Agriculture Handbook</a>. 362, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C.. (1972).</li>
<li>Sengel, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSengel%2C+P+%22In+Morphogenesis+of+Skin%2C+l-277%22">In Morphogenesis of Skin, l-277</a>. , Cambridge Univ. Press. New York. (1976).</li>
<li>Dhouailly, D., Wilehm Roux, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+cutaneous+appendages+in+dermo-epidermal+recombinations+between+reptiles%2C+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals.</a> Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).</li>
<li>Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+feather+morphogenesis%3A+I.+Analyses+with+antibodies+to+Adhesion+Molecules+Tenascin%2C+N-CAM+and+Integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin.</a> Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+organs+by+a+Wnt+%2F+Notch+%2F+non-muscle+myosin+module+which+orients+feather+bud+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oscillations+coordinate+feather+mesenchymal+cell+movement+by+SHH+dependent+modulation+of+gap+junction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks.</a> Nature Communications. 9 (1), 5377(2018).</li>
<li>Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+delivery+of+TGF+beta2+can+restore+epithelium+dependent+organization+of+mesenchymal+condensation+during+skin+appendage+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis.</a> Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).</li>
<li>Widelitz, R. B., Jiang, T. -X., Noveen, A., Chen, C. -W. J., Chuong, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+induces+new+feather+buds+from+developing+avian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigation+Dermatology%22%5BJournal%5D)">FGF induces new feather buds from developing avian skin.</a> Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).</li>
<li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+interactions+in+scale+and+feather+development+as+studies+in+dermal-epidermal+recombinations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).</li>
<li>McAleese, S. R., Sawyer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+the+phenotype+of+the+epidermis+from+chick+embryos+homozygous+for+the+gene+scaleless+%28sc%2Fsc%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc).</a> Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).</li>
<li>Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+during+avian+skin+appendage+regeneration%3A+dependence+on+epithelial-mesenchymal+interaction+and+order+of+molecular+reappearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance.</a> J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).</li>
<li>Jiang, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+feather+orientations+changed+by+electric+current%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Global feather orientations changed by electric current.</a> iScience. 24 (6), 102671(2021).</li>
<li>Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+periodic+patterns+by+dissociated+feather+mesenchymal+cells+and+the+regulation+of+size%2C+number+and+spacing+of+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia.</a> Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).</li>
<li>Chen, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+early+odontogenic+signaling+pathway+in+Aves%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).</li>
<li>Chuong, C. -M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Skin+Morphogenesis%3A+II.+Retinoic+acid+gradient+modulates+axis+orientation+and+phenotypes+of+skin+appendages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages.</a> Development. 115 (3), 839-852 (1992).</li>
<li>Noveen, A., Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+A+and+protein+kinase+C+modulators+have+reciprocal+effects+on+mesenchymal+condensation+during+skin+appendage+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis.</a> Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).</li>
<li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+biological+networks+via+adaptive+patterning+revealed+by+avian+intradermal+muscle+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).</li>
</ol>

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Doku rekombinasyonu, epitel ve mezenşimin benzersiz katkılarını keşfetmek için bir test sağlar. Tavuklarda tüyler embriyonik gün 7'de (E7) gelişmeye başlarken, pullar E9'da başlar. E9 skalası mezenşimi, E7 skalası epiteli ile yeniden birleştirildiğinde, yeniden birleşen doku pulcukları oluşturur ve E7 tüy mezenşimi, E9 skalası epitel ile yeniden birleştirildiğinde, tüyler oluşur11. Bu çalışmalar, mezenkimin patern oluşumunu, aralığını ve organ kimliğini kontrol ettiğini göstermiştir. Tabii ki, epi...

Kuş embriyosu derisi gelişimi, farklı desenler ve mikrocerrahi ve manipülasyona erişilebilirlik nedeniyle morfogenez mekanizmalarını incelemek için mükemmel bir modeldir 1,2. Bununla birlikte, sağlam dokulardaki hücresel ve moleküler olayları değerlendirmek zor olabilir, çünkü yabancı dokuların varlığı mikroskobik gözlemleri zorlaştırabilir. Ayrıca, cilt morfogenezindeki rollerini test etmek için gen ekspresyonunu manipüle etme yeteneği her zaman basit bir iş değildir. Deri eksplant modellerini kullanarak daha yüksek bir başarı oranıyla retroviral transdüksiyon kullanarak gen fonksiyonlarını test edebileceğimizi bulduk. Burada, geliştirilmiş olan üç cilt eksplant modelinin avantajlarını tartışıyoruz.
Kuş embriyonik deri kültürü, deri tüy tomurcuğu gelişimi sırasında hücre davranışını, gen regülasyonunu ve işlevini değerlendirmek için güçlü bir sistemdir 3,4,5,6. Tüy tomurcuğu gelişiminin moleküler mekanizmalarının, kültür ortamına yerleştirilen büyüme faktörlerinin küresel olarak eklenmesi veya bunların büyüme faktörü kaplı boncuklardan yerel olarak salınması yoluyla değerlendirilmesine izin verir. Gelişimsel düzenleyici genler, spesifik morfogenetik olaylardaki rollerini değerlendiren fonksiyonel çalışmalar için bozulmamış veya baskın negatif formların viral gen iletimi kullanılarak da manipüle edilebilir 7,8.
Kuş epitelyal-mezenkimal rekombinasyon kültürü, araştırmacıların cilt morfogenezinin erken aşamalarında her bir cilt bileşeninin katkılarını belirlemelerini sağlar. Rawles'ın bu yaklaşımı kullanması, mezenşim ve epitel arasındaki etkileşimlerin cilt eklerinin oluşturulması için gerekli olduğunu ortaya koymuştur9. Mezenkim yoğuşmalar oluşturabilir ve mezenkimal yoğuşma oluşumlarını indüklemek ve sürdürmek için epitel gereklidir2. Daha sonra, bu yaklaşım Pulsuz tavukların neden tüy oluşturamadığını değerlendirmek için kullanıldı. Defektin mezenkim10'da olduğu keşfedildi. Dhouailly, farklı türlerden embriyolarda doku epitelyal-mezenkimal rekombinasyon çalışmaları yaptı. Bu çalışmalar, cilt morfogenezini destekleyen epitelyal-mezenkimal iletişime gelişimsel ve evrimsel içgörüler sağladı3.
Bu çalışma, tüy büyümesini kontrol eden faktörleri daha iyi anlamak için kullanılmıştır. Yöntem ayrıca, ön-arka eksen boyunca tüy başlangıcı, gelişimi ve uzaması sırasında meydana gelen deri desenlemesinde yer alan hücresel ve moleküler olayların görselleştirilmesini de geliştirir. Epitel mezenşimden ayrıldığında ve iki bileşen daha sonra yeniden birleştirildiğinde, yeni etkileşimler cilt desenini yeniden oluşturur. Bu yaklaşım, epidermisin mezenkimal sinyallere yanıt vermesini sağlayan mezenkimal indükleyici sinyalleri ve epitelyal yeterlilik moleküllerinideğerlendirmemize izin verir 11. Tüy tomurcuğu gelişimi ve desen oluşumu için gerekli olan sonraki aşağı akış moleküler ifadesi de incelenebilir. Bu çalışmalar, tomurcukların konumunun mezenşim tarafından kontrol edildiğini ortaya koymuştur. Mezenşim ile rekombinasyondan önce epitelin 90o dönmesi, tüy tomurcuğu uzama yönünün epitel tarafından kontrol edildiğini gösterir. Bu yöntem, tüy tomurcuğu oryantasyonunu düzenleyen moleküler mekanizmayı incelememiz için gerekliydi12.
Deri mezenşiminin yüksek hücre yoğunluğunda kaplamadan önce tek hücrelere ayrıldığı ve sağlam epitel ile kaplandığı kuş derisi sulandırma kültürü, dermal hücreleri ilkel bir duruma sıfırlar. Eksplant daha sonra önceki ipuçlarından bağımsız olarak yeni bir periyodik model oluşturmak için kendi kendini organize eder13. Bu cilt sulandırma modeli, tüy periyodik desenlemenin ilk süreçlerini incelemek için kullanılabilir. Bu yaklaşımı, mezenkimal hücrelerin tek bir epitel parçasına oranının modüle edilmesinin tüy tomurcuklarının boyutunu veya sayısını nasıl etkileyebileceğini keşfetmek için kullandık. Mezenkimal hücrelerin oranı arttıkça tomurcuk sayısının arttığı, ancak tomurcukların boyutunun artmadığı bulundu. Bu yaklaşımın bir başka avantajı, mezenkimal hücre viral transdüksiyonunun diğer iki kültür koşuluna göre daha yüksek verimlilik göstermesi ve daha belirgin fenotipler üretebilmesidir.

<table><tbody><tr><td>6 kuyulu kültür tabağı&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>REF 353502</td><td>Hava-Sıvı Arayüz (ALI) Kültürleri &nbsp;</td></tr><tr><td>Hücre kültürü içi&nbsp;</td><td>Şahin</td><td>REF 353090.</td><td>0.4 ve mikro; m Şeffaf PET</td></tr><tr><td>Membran Kollajenaz Tip 1</td><td>Worthington Biyokimyasal</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' S Orta&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>4.5 g/L glikoz</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat (EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>ThermoFisher</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' s tamponlu tuzlu su çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>Kalsiyum yok, magnezyum yok</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin ve nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pogassium fosfat monobazik (KH2PO4)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat (NaHCO< alt > 3 )</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (Nacl)</td> <td>EMD ve nbsp;</td><td>CAS 7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik (NaH<alt>2PO4)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Gibco</td><td>27250-042</td><td></td></tr></tbody></table>

doku desenini ve organogenezi İncelemek için kuş derisi eksplantlarının kullanılması

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

Embriyogenez sırasında gelişen kuş derisi, doku modellemesi hakkında değerli bilgiler sağlayabilen benzersiz bir modeldir. Burada, cilt gelişiminin farklı yönlerini incelemek için deri eksplant kültürlerinde üç varyasyon açıklanmaktadır. İlk olarak, ex vivo organ kültürleri ve manipülasyonları, araştırmacılara tüy tomurcuklarının gelişimini doğrudan gözlemleme ve inceleme fırsatları sunar. Deri eksplant kültürü 7 gün boyunca büyüyebilir ve bu büyüme periyodu boyunca aralıklarla hücresel davranışın doğrudan analizine ve 4D görüntülemeye olanak tanır. Bu aynı zamanda doku tepkisini görselleştirmek için kültür koşullarının fiziksel ve moleküler manipülasyonlarına da izin verir. Örneğin, büyüme faktörü kaplı boncuklar, sınırlı bir alanda tüy deseninde değişikliklere neden olmak için yerel olarak uygulanabilir. Alternatif olarak, viral transdüksiyon, gen ekspresyonunu yukarı veya aşağı regüle etmek için kültür ortamında küresel olarak verilebilir. İkincisi, cilt rekombinasyon protokolü, araştırmacıların farklı cilt bölgelerinden, farklı yaşam evrelerinden veya farklı türlerden türetilen epidermis ve mezenşim arasındaki doku etkileşimlerini araştırmalarına olanak tanır. Bu, epitelin sinyallere yanıt vermeye yetkin olduğu zaman penceresini ve farklı mezenkimal kaynaklardan gelen sinyallere yanıt olarak farklı cilt uzantıları oluşturma yeteneğini test etme fırsatı verir. Üçüncüsü, sağlam epitel ile kaplanmış ayrışmış dermal hücreler kullanılarak cildin sulandırılması, cilt gelişimini sıfırlar ve periyodik modellemenin ilk süreçlerinin incelenmesini sağlar. Bu yaklaşım aynı zamanda, yeniden yapılandırılmış deri eksplantını oluşturmadan önce ayrışmış hücreler arasındaki gen ekspresyonunu manipüle etme yeteneğimizi de geliştirir. Bu makale, faydalarını göstermek için üç kültür protokolünü ve örnek deneyleri sunmaktadır.

Deri eksplant kültürleri Ex vivo deri organ kültürlerinden tüy tomurcuğu gelişimi doğrudan mikroskop altında gözlemlenebilir. Tavuk evre 30 sırt derisinin deri eksplant kültürü modelini kullanarak, plakodlar orta hat boyunca görülebilir. Morfogenetik cephe daha sonra yeni tüy primordia oluşumu ile cilt çevresine doğru yavaş yavaş yanal olarak yayılır. Bu tüy primordiaları, kültürde 2 gün sonra kısa tüy tomurcuklarına ve kültürde 4 gün sonra uzun tüy tomurcuklarına dönüşecektir (<strong class=...

Burada, doku etkileşimlerini, 4D görüntüleme timelapse filmini (3D artı zaman), moleküler fonksiyonun küresel veya yerel bozulmasını ve sistem biyolojisi karakterizasyonunu incelemek için kullanılabilecek üç tip kuş embriyonik deri eksplant kültürü için protokolleri açıklıyoruz.

Doku Desenini ve Organogenezi İncelemek için Kuş Derisi Eksplantlarının Kullanılması

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

Araştırma ekibimin araştırma amacı, doku gelişimini ve rejenerasyonunu anlamaktır. Bu hedef, günümüzde kök hücre araştırmalarında özellikle önemlidir. Bir organın nasıl oluştuğunun ilkelerini anlamayı umuyoruz.Ve bu bilgi sadece doğayı anlamamıza yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda rejeneratif tıbba yardımcı olmak için de uygulanabilir. Karşılaştığımız zorluk, bu morfogenetik süreçlerde yer alan moleküler ve hücresel süreci anlamaktır. Bu nedenle, moleküler ve hücresel süreçleri dikkatli bir şekilde analiz etmek için bir eksplant kültür sistemine ihtiyacımız var çünkü bunu in vivo olarak yapmak mümkün değil.Bu bilgi boşluğunu doldurmak için, bilim adamları farklı organoid kültür yolları geliştirdiler. Organoid kültürde, hücrelerin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini görmek için kolektif hücre hareketini alabileceğiz. Ayrıca hücreleri, moleküllerin işlevini test etmek için farklı molekülleri ifade etmeleri için manipüle edebiliyoruz.Kullandığımız benzersiz yaklaşım, tavuk derisi eksplant kültürüdür. Tavuk derisi, yumurtadan kolayca erişilebildikleri ve doku desenleri için bir okuma olarak altıgen desende düzenlenmiş farklı tüy tomurcukları oluşturdukları için kullanılır. Göre

using-avian-skin-explants-to-study-tissue-patterning-and-organogenesis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu makalede, biz uzun vadeli sağlamak için basit bir yöntem...

Bir Eski-ovo</emGörüntüleme ve Mikrocerrahi Uygulamaları için uygundur> Tavuk Embriyo Kültürü Sistemi

Bu makale, kraniyofasiyal gelişimi sırasında sinyalizasyon ve yüzey sefalik ektoderm desenlendirme özellikleri test etmek için tasarlanmış bir doku nakli tekniği açıklar.

Kraniofasial Geliştirme sırasında Ektodermal Epiteli Sinyal Özellikleri değerlendirilmesi

Bu makalede klasik bıldırcın-tavuk chimera sistemin roman vitro ve ovo içinde deneysel prosedürler birleştirerek organ oluşumu, çalışma Güncellenme Zamanı bir yaklaşım sağlar.

İlk - ve geç-aşamalarında Organ oluşumu kuş modelindeki keşfetmek için iki adımlı yaklaşım: timus ve paratiroid bezleri Organogenesis paradigma

Burada, embriyonik tavuk organları büyümeye Protokolü kültür bir organotypic mevcut tüp bebek. Bu yöntemi kullanarak, embriyonik tavuk doku gelişimi, kültür ortamı üzerinde kontrol yüksek derecede korunarak okudu.

Embriyonik tavuk doku gelişimi çalışmaya Organotypic kültür yöntemi

Bu makalede embriyonik dokulardan saf formu ex vivo chimeric organları için bir araya getirilebilen bıldırcın ve tavuk embriyolar izole etmek için bir yöntem sağlar.

Yalıtım embriyonik doku ve timus örnek kullanarak bıldırcın-tavuk Chimeric organ oluşumu

Bu makalede, kraniyofasiyal gelişim sırasında bazal ön beynin sinyal ve paternleme özelliklerini test etmek için tasarlanmış bir doku nakli tekniği anlatılmaktadır.

Yüz Gelişimini Değerlendirmek için Kuş Ön Beyin Kimeraları Oluşturmak

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Xenopus laevis embriyosu, büyük boyutu ve manipülasyon kolaylığı nedeniyle erken gelişim çalışmalarında son derece yararlı olmaya devam ediyor.   Bu model sistemde belirli organların tanımlanmasında kullanılabilecek tam montajlı in situ hibridizasyon protokolü için basitleştirilmiş bir protokol sağlanmıştır.

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez<em&gt; In Situ</emIçinde&gt; Hibridizasyon Protokolü<em&gt; Ksenopus</em

Balığı keratositler eksplantlardan hücre tabakaları hareket eder ve epitel yara iyileşmesi bağlamında toplu hücre göçü mekanizmaları üzerinde çalışılması için bir in vitro model sağlar. Bu protokoller detaylı toplu hücre göçü tahlillerde kullanılmak için primer eksplant kültürleri oluşturmak için etkili bir yoldur.

Zebra balığı Keratosit Eksplantlarındaki Deri Yara İyileşmesi Toplu Hücre Göç ve reepithelialization Eğitim için

Ex vivo dik damlacık kültürü, mevcut in vitro ve in vivo deneysel tekniklere bir alternatiftir. Bu protokolün uygulanması kolaydır ve daha az miktarda reaktif gerektirirken, fetal vaskülarizasyon, morfogenez ve organogenezi manipüle etme ve inceleme yeteneğine izin verir.

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm Fetal Organları Dik Damlacık Kültürleri Fare Organogenesis sırasında Gelişim Süreçleri Eğitim için

Öğrenin, kuş embriyo deri eksplant kültürleriyle doku deseni ve organogenez süreçlerini incelemeyi. Bu yöntem, rejeneratif tıp ve gelişim biyolojisi araştırmalarında moleküler mekanizmaları anlamak için kullanılır.

Doku Desenini ve Organogenezi İncelemek için Kuş Derisi Eksplantlarının Kullanılması

Daha fazla video keşfet