Name: Rekombinant Protein Üretimi için Leishmania Tarentolae Türetilmiş Hücresiz Protein Ekspresyon Sistemi olan LTEnin Üretimi ve Optimizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T12:10:00.000+00:00
Duration: 3 min 59 s
Description: Öğrenin, rekombinant protein üretimi için Leishmania tarentolae kaynaklı hücresiz protein ekspresyon sistemi LTE'nin üretim ve optimizasyon yöntemlerini. Bu sistem oda sıcaklığında stabil kalır ve taşımayı kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu protokol, kültürlemeyi, santrifüjlemeyi, çok modlu bir plaka okuyucu kullanarak GFP floresansının ölçülmesini, OD600nm kültürünün ölçülmesini ve lizat Abs280nm'nin değerlendirilmesini içeren ayrıntılı ortam tariflerini ve adımlarını içerir. Ayrıca SDS-PAGE protein jellerinin kurulumunu ve görüntülenmesini de kapsar. Bu protokol için gerekli olan veya önerilen malzemeler, Malzemeler elektronik tablosunda listelenmiştir. Ortam bileşenleri, santrifüjler, tüpler, spektrofotometreler ve jel elektroforez kurulumları gibi tipik laboratuvar kaynaklarının, aksi belirtilmedikçe büyük olasılıkla birbirinin yerine kullanılabileceğini unutmamak önemlidir. Şekil 1 , LTE üretim sürecinin bir özetini sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65592/65592fig01.jpg"> Şekil 1: LTE üretim protokolüne genel bakış. Bu karikatür, LTE üretim protokolünün kısa bir özetini sunmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65592/65592fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
1. Leishmania tarentolae kültürlerinin büyümesi
<ol><li>En az 3 L TBGG büyüme ortamı hazırlayın (Baktotripton 12 g/L, Maya özütü 24 g/L, gliserol 8 mL/L, glikoz 1 g/L, KH2PO4 2,3 g/L, K2HPO4 2,5 g/L, bkz . Ortamı vakum veya benzer bir kurulum altında 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edin.</li>
	<li>Ortamı oda sıcaklığında (RT) saklayın, son ilaveler (Hemin, Antibiyotikler) L. tarentolae ile aşılamadan hemen önce eklenir. Hemin (% 50 trietanolamin içinde% 0.25 v / v),% 0.2 v / v, Penisilin (10.000 birim / mL) artı Streptomisin (10.000 μg / mL)% 0.5 v / v'de karıştırılır. NOT: Bu protokolün başlangıç noktası, bakımı yapılan 2 x 10 mL'lik yabani tip L. tarentolae kültürüdür. Bakım kültürleri 27 °C'de standart 50 mL'lik doku kültürü şişelerinde düşük çalkalama (75 rpm) ile büyütülür. Bu tür 10 mL kültürler, her 2-3 günde bir steril (TBGG + hemin, penisilin, streptomisin) içinde ~ 1/20 seyreltme ile süresiz olarak korunabilir. Bir PC2 laboratuvarında standart bir biyogüvenlik kabini tavsiye edilir; bununla birlikte, bakteriyel kontaminasyonlar eklenen antibiyotikler tarafından önlenme eğilimindeyken, mantar kontaminasyonları genellikle L. tarentolae tarafından büyütülür.</li>
	<li>İki gün boyunca, L. tarentolae bakım kültürlerini 200 mL'ye (1. gün) ve daha sonra her gün artan hacimde TBGG + hemin / antibiyotik ile 1: 10 dilüsyon yoluyla 2 L'ye (2. gün) genişletin. Her iki seyreltmeyi de otoklavla sterilize edilmiş şaşkın 5 L'lik cam şişelerde (maksimum 1 L'ye kadar doldurulmuş) gerçekleştirin. İkinci seyreltme, ertesi gün saat 8-11 arasında lizat üretimine başlamak amacıyla öğleden sonra 3-6 arasında yapılmalıdır. NOT: Bu protokol, LTE üretimi için minimum başlangıç hacmini kullanır (2 x 1 L kültür). Ek bir genişletme adımı dahil ederek LTE üretimi için kültürü 10 L'ye kadar genişletmek de mümkündür (örneğin, Gün 1: 100 mL; 2. Gün: 1 L; 3. Gün: 10 L). Bu protokol, L. tarentolae'yi büyütmek için şaşkın şişeler (Malzeme Tablosuna bakınız) kullansa da, isteğe bağlı olarak, karıştırma hızının 100 rpm'nin altında tutulması koşuluyla, Rushton çarkları ile bakteri üremesi için tasarlanmış geleneksel biyoreaktörler kullanılabilir. Biyoreaktörlerde iyileştirilmiş havalandırma ve pH kontrolü genellikle L. tarentolae kültürlerinin log fazı büyümesini uzatır ve adım 1.4'te kullanılmak üzere600 nm'lik daha yüksek bir hasat OD 10'a izin verir.</li>
	<li>Kültürün OD600nm'sini doğrudan spektrofotometre küvetinde TBGG'de 1:10 seyreltme yoluyla üç kopya halinde kaydedin. Lizat yapmak için uygun bir başlangıç aralığı OD600nm = 4.0-8.0'dır.</li>
	<li>OD600nm &lt; 4.0 ise ek inkübasyon süresi sağlayın. OD600nm &gt; 8'e sahip bir kültür kullanılabilir ve daha fazla hacimde hücresiz ekspresyon lizatı ile sonuçlanacaktır, ancak geç log büyüme fazının başlaması nedeniyle daha düşük kaliteye sahiptir. Kültür şişelerini buzun üzerine yerleştirin ve sonraki adımları bekleyin. NOT: Nihai kültür OD600nm'nin doğru ölçümü, bozulmadan önce konsantre hücreler için nihai hacmi hesaplamak için kullanıldığından kritik öneme sahiptir. Bu hesaplama, protokolü basitleştirmek için kesinti34'ten önce hücre konsantrasyonunu kalibre etmek için LTE üretiminin önceki sürümlerinde kullanılan bir pelet tartım yönteminin yerini alır. OD600nm ölçümü için TBGG'de seyrelttiğinizden emin olun, aksi takdirde ozmotik şok hücre şeklini değiştirerek ölçüm hatasına neden olur. Pipet, spektrofotometrik okumayı yapmadan saniyeler önce OD600nm ölçümü için (doğrudan küvette) 1:10 seyreltmeyi karıştırın, çünkü L. tarentolae hücreleri belirgin bir bulutlu görünümle hızla yerleşir. İfade kültürünün nihai hacminin yaklaşık olduğu kabul edilirse, daha iyi bir tahmini hacim elde etmek için (1 g = 1 mL'de) hasatta şişelerin (uygun boş şişe dara ile) tartılması da önerilir. Şaşkın şişelerde L. tarentolae büyümesinden mümkün olan maksimum OD600nm 15-20'dir, ancak bu, sabit faza ulaşması nedeniyle lizat üretimi için uygun değildir.</li>
</ol>2. L. tarentolae kültürlerinin konsantrasyonu
<ol><li>Leishmania hücreleri, bozulmadan yaklaşık 60 kat önce yıkanmalı ve konsantre edilmelidir. Son konsantre için OD600nm = 300'e dayalı hücre konsantrasyonu için hedef hacmi hesaplayın. Denklem V = hasat hacmi (mL) x (hasat OD600nm/300). Örneğin, hasat OD600 = 5 olan 2 L'lik bir kültür kullanıldığında, hedef hacim 33 mL'dir. NOT:300'lük OD 600nm hedefi değiştirilebilir; önceki LTE üretiminde 150-350 aralığında değerler kullanılmıştı. Bozulmaya giren daha yüksek hücre konsantrasyonları, daha yüksek protein verimleri ile nihai hücresiz ekspresyon reaksiyonları verme eğiliminde olacaktır, ancak savunmasız proteinlerin toplanma eğilimi artacaktır. OD600nm = 300, LTE üretimi için uygun bir varsayılan hedefi temsil eder.</li>
	<li>Hasat edilen kültürleri uygun santrifüj şişelerine aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 2500 x g'da döndürün. Süpernatanı dikkatlice kültür atığına boşaltın. NOT: Bozulma yüklemesinin hesaplanmasını etkilediğinden, atılan süpernatanta hücre kaybını en aza indirmek önemlidir. Önceki LTE üretim protokollerinde, bozulma için L. tarentolae hücrelerinin konsantrasyonu, hücre konsantresinin bir test mikrosantrifüj tüpünde döndürülmesi ve toplam ağırlığakarşı pelet ağırlığının ölçülmesiyle kalibre edildi 34. Bu basitleştirilmiş protokol bunun yerine, ölçülen hasat OD600nm'ye dayalı olarak konsantre için teorik bir OD600nm hedefi kullanır ve hücre konsantrasyonu ve yıkama sırasında düşük hücre kaybını varsayar.</li>
	<li>Hücre peletini SEB tamponunda (45 mM HEPES-KOH pH 7.6, 250 mM sükroz, 100 mM KOAc, 3 mM Mg(OAc)2, buz üzerinde tutulur) üç kez yıkayın, her seferinde 2500 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. İlk yıkama için, her 1 L peletlenmiş kültürü 100 mL SEB tamponunda yeniden süspanse edin, ardından bunları tek bir santrifüj şişesinde birleştirin. İkinci yıkama için, orijinal kültürün her 1 L'si için 100 mL SEB kullanın. NOT: Son pelet yeniden süspansiyonu için, nihai hedef yeniden süspansiyon hacminin P'sine SEB tamponu ekleyin (adım 2.1). Bu, havuzlanan konsantrenin adım 2.4'teki tam olarak nihai hedef hacme kadar dikkatli bir şekilde doldurulmasını sağlar. L. tarentolae'nin erken parçalanmasını önlemek için her bir yeniden süspansiyon mümkün olduğunca yumuşak olmalıdır, örneğin, eklenen SEB'yi boşaltılan peletin etrafında hafifçe döndürerek veya SEB'yi santrifüj tüpü duvarına yapışan pelet üzerine pipetleyerek. Son adım için süpernatantları daha küçük santrifüj tüplerine aktarmak daha uygun olabilir.</li>
	<li>Yeniden süspanse edilmiş konsantreyi uygun bir yıkanmış cam hacimsel silindire dökün, ardından ilave soğuk SEB kullanarak hacmi hedef hacme (adım 2.1) doldurun ve hafifçe karıştırın.</li>
</ol>3. L. tarentolae konsantresinin parçalanması
<ol><li>Hücre konsantresini önceden 4 °C'ye soğutulmuş nitrojen kavitasyon cihazına aktarın (Malzeme Tablosuna bakınız), 70 bar nitrojene basınçlandırın ve buz üzerinde 45 dakika inkübe edin. NOT: Nitrojen kavitasyon bozucular yaygın laboratuvar öğeleri olmasa da, LTE üretimi için önerilir. Hücresel donma-çözülme ve French-press tipi bozucular gibi alternatif yöntemler denenmiş; Bununla birlikte, protein ekspresyon aktivitesi, nitrojen kavitasyon yönteminin kullanılmasına kıyasla% &lt;50 idi. Nitrojen kavitasyon cihazı, bu adımdan itibaren hücre lizatı ile temas eden tüm yeniden kullanılan kaplara (alıcı şişesi gibi) benzer şekilde, kullanımdan önce ve çalışmalar arasında iyice temizlenmelidir. Uygun bir temizleme rejimi, laboratuvar deterjanları ile yıkamayı ve ardından deiyonize su ile iyice durulamayı içerir.</li>
	<li>Nitrojen kavitasyon cihazındaki havalandırma deliğini açın ve elde edilen lizatı buz üzerinde bir vakum alıcı şişesi gibi uygun şekilde sağlam bir kaba boşaltın. Elde edilen tüm lizatın çökeldiğinden ve yeni bir santrifüj tüpüne veya benzer bir kaba pipetlenebildiğinden emin olmak için alıcı şişesini eğin. DİKKAT: Nitrojen kavitasyon bozucular, hücre konsantresinin 70 bar nitrojenden ortam basıncına ani geçişine dayanır, bu da cihazın çıkış valfinden güçlü bir önce sıvı ve ardından nitrojen akışıyla elde edilir. Havalandırma, kimyasal güvenlik başlığında uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) ile yapılmalıdır. Hedef kabın kırılma ve lizatı kaybetme riski vardır, bu nedenle jenerik bir şişe yerine sağlam bir vakum alıcısı kullanıyoruz. Cihazın çıkış valfi bir tüp ise, havalandırma noktasında aşırı basınç oluşmasını önlemek için tüpü doğrudan alıcının içine yerleştirmekten kaçının.</li>
</ol>4. Hücre lizatının santrifüjlenmesi
<ol><li>Lizatı uygun g kuvvetine dayanıklı santrifüj tüplerine aktarın ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı taze, benzer santrifüj tüplerine çıkarın.</li>
	<li>Lizatı 4 ° C'de 15 dakika boyunca 30.000 x g'da santrifüjleyin ve ardından son süpernatanı taze bir santrifüj tüpüne veya buz üzerine yerleştirilmiş benzer bir kaba çıkarın. Toplam hacmi tahmin edin.</li>
</ol>5. Hücre lizatının jel filtrasyonu
NOT: Jel filtrasyonu, SEB tamponunda bulunan sakarozun çıkarılması için kullanılır. Sükroz, hücre bozulması sırasında hücresel mekanizmanın stabilize edilmesine yardımcı olurken, protein ekspresyon reaksiyonlarında tutulursa verimi düşürür.
<ol><li>Yeterli sayıda PD-10 yerçekimi beslemeli jel filtrasyon kolonunu (Malzeme Tablosuna bakınız), bir toplama tepsisine veya altındaki benzer bir kaba damlamalarına izin veren bir raf biçiminde kurun ve tüm lizat hacmini sütun başına 2,5 mL'de filtreleyebilmelerini sağlayın. Kolonları önceden 10 mL 4 °C EB tamponu (45 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM KOAc, 3 mM Mg(OAc)2) geçirerek önceden dengeleyin. NOT: Bu noktadan itibaren tüm adımların 4 °C soğuk odada gerçekleştirilmesi avantajına sahiptir. Bununla birlikte, tüm lizatları ve reaktifleri bir tezgah üstü buz tepsisinde tutmak da uygundur. Bunun bir istisnası, yazarların yeniden tamponlama sırasında 4 °C'lik bir buzdolabının içine bir sütun rafı yerleştirdiği jel filtreleme adımıdır. Bu protokolün orijinal versiyonlarında, yeni jel filtrasyon kolonları, başlangıçta lizatı tamponlayarak ve ilk çıktıyı atarak 'bloke edildi'. Bu gerekli görülmese de, kolonlar EB tamponu ile yıkanmalı ve lizat partileri arasında 4 °C'de saklanmalıdır. İlk çıkış lizatı, yeni kolon üzerinde lizat bileşenlerinin bir miktar arka planda tutulması nedeniyle sonraki çıktılardan daha düşük protein ekspresyon aktivitesine sahip olabilir.</li>
	<li>Her sütuna 2,5 mL lizat ekleyin ve sütuna geçene kadar bekleyin. Elüatı atarken lizatı kolona çökeltmek için ek bir 0.5 mL EB ekleyin.</li>
	<li>Her sütuna ek 2,5 mL EB ekleyerek jel filtreli lizatı elute edin, çıktıyı sütunların altına taze, temiz bir tepsi veya başka bir kap yerleştirerek toplayın.</li>
</ol>6. Hücre lizatının takviyesi
<ol><li>Jel filtreli lizatın Abs280nm'sini ölçmek için nanodrop spektrofotometresini (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. 60'ı aşarsa, ek 4 °C EB tamponu kullanarak Abs280nm = 60'a ulaşacak şekilde seyreltin. NOT: OD600nm kullanılarak bozulmaya hücre yoğunluğu girişini kontrol ederken, lizat çıkış gücünü yaklaşık olarak belirlerken, lizat bozulması ve işlemeden sonra Abs280nm'yi normalleştirmek, lizat performansının toplu tutarlılığını daha da iyileştirir. Lysate Abs280nm , protein ekspresyonu verimi ve agregasyonu için sonuçlarla birlikte yukarı ve aşağı ayarlanabilir. Takviye edilmemiş lizat, bir Abs280nm &lt; 60'ı gösteriyorsa, bozulma adımına daha fazla Leishmania biyokütlesi dahil etmek, yani hücre bozucu yüklemesini adım2.1'de OD 600nm &gt; 300'e çıkarmak gerekebilir.</li>
	<li>5x Besleme Çözeltisi (5x FS, Tablo 1) lizata 2: 5 oranında ekleyin ve iyice karıştırın. Uygun kaplara (örneğin, 1,5 mL mikrofüj tüpleri) koyun ve sıvı nitrojen içinde dondurun. Aşağıdaki LTE ifade optimizasyonu için isteğe bağlı 7.1-7.3 adımları izleniyorsa, varsayılan 5x FS yerine Tablo 1'deki azaltılmış rNTP.Mg 5x FS'yi kullanın. Optimizasyon deneylerinde kullanılmak üzere dondurma için 5 x 100 μL'lik alikot ekleyin. NOT: 2:5 oranında varsayılan 5x FS ile dondurma, 7 μL/10 μL ekspresyonda kullanılan, ifadeye hazır takviyeli LTE oluşturur (bu nedenle, 5x FS, son reaksiyonda 1x FS olur). Bununla birlikte, yazarlar, 5x FS'de varsayılan rNTP ve magnezyum miktarının 0,6 katının sağlandığı diğer isteğe bağlı adımların izlenmesini önermektedir. Bunu, test reaksiyonlarını optimize edilmiş bir değere tamamlamak için ikisinin eşmolar bir karışımının (rNTP.Mg olarak adlandırılır) eklendiği bir optimizasyon adımı izler. Kısmi 5x FS ayrıca endojen mRNA ekspresyonunu kapatan bir oligonükleotid içerir (Giriş bölümüne bakınız). Oligonükleotidin dizisi CAATAAAGTACAGAAACTGATACTTATATAGCGTT'dir.</li>
</ol>7. Kalite kontrol ve son takviyeli LTE'nin optimizasyonu
NOT: İndirgenmiş rNTP ve magnezyum takviyeli lizata rNTP.Mg'in uygun 'tamamlama' ilavesini belirlemek için gerekli minimum adımlar, bir füzyon partneri olmadan eGFP veya benzer bir floroforun (örn., sfGFP) eksprese edilmesini içerir. İfade seviyesinin (çok modlu bir plaka okuyucu aracılığıyla eGFP RFU olarak ölçülür) optimize edildiği noktayı belirlemek için reaksiyonlara artan rNTP.Mg konsantrasyonları eklenir. Floresan olmayan eGFP'nin erken sonlandırılması, çok yüksek rNTP.Mg konsantrasyonlarında eGFP RFU'nun azalmasıyla belirginleşir. Bununla birlikte, LTE'nin kısa ürün arızaları, daha büyük eksprese edilen proteinlerde (&gt;50 kDa) daha sık görülür. Bu nedenle, bu optimizasyonu eGFP'den daha büyük bir şablon kullanarak gerçekleştirmek mümkündür, özellikle de uygun bir ifade vektöründe mevcutsa, belirli bir uygulama veya çalışma için LTE tarafından üretilmesi istenen bir florofor füzyonu sağlar (Temsili Sonuçlar bölümüne bakın).
<ol><li>100 μL'lik bir alikotu çözün ve her biri 6.2. adımdan 7 μL kısmen takviye edilmiş lizat, Tablo 2'ye göre 1 μL tamamlama çözeltisi ve 2 μL ultra saf sudan oluşan altı adet 10 μL ekspresyon reaksiyonu ayarlayın reaksiyonda 50 ng / μL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için yeterli DNA kontrol şablonu içerir.</li>
	<li>Reaksiyonları 25 ° C'de 2 saat inkübe edin ve çok modlu bir plaka okuyucu kullanarak GFP floresansındaki artışı izleyin. NOT: GFP için uygun konfigürasyon değerleri, 485 nm'de (bant genişliği 5 nm) uyarma, 516 nm'de emisyon (bant genişliği 5 nm) ve 2 saat boyunca 1 dakikalık bir okuma aralığıdır.</li>
	<li>En yüksek eGFP RFU'ya karşılık gelen rNTP.Mg konsantrasyonunu belirlemek için son ifade değerlerini sıralayın. Kinetik veriler mevcutsa, rNTP.Mg fazlalığı, 2 saatlik ekspresyon periyodu boyunca eGFP RFU'da iki fazlı bir artışla da gösterilecektir (Temsili Sonuçlar bölümüne bakınız).</li>
	<li>Optimize edilmiş tamamlama rNTP.Mg konsantrasyonu belirlendikten sonra, önceki adımlarda kısmen takviye edilen LTE partisini kullanarak bunu diğer tüm protein ifadelerine ekleyin. NOT: Adım 6.2'deki alıntılama sabit hacimlerle dikkatli bir şekilde yapılırsa, ekleme, örneğin alikotlar kuru buz üzerine yerleştirilerek, çözülmeden her bir alikot'a geriye dönük olarak eklenebilir. Bu alikotlar artık tamamen desteklenmektedir, çünkü doğru rNTP.Mg doldurma, çözüldüklerinde ve kullanım için karıştırıldıklarında her biri boyunca karıştırılacaktır.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Leishmania Translasyonel Ekstrakt (LTE) Üretimi için Kolaylaştırılmış Protokol

<ol><li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The dependence of cell-free protein synthesis in E.coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 47 (10), 1588-1602 (1961).</li>
<li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+2.3+mg%2Fml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li>
<li>Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Bacillus+subtilis+cell-free+transcription-translation+system+for+prototyping+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements.</a> Metab Eng. 38, 370-381 (2016).</li>
<li>Ezure, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+system+prepared+from+insect+cells+by+freeze-thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis system prepared from insect cells by freeze-thawing.</a> Biotechnol Prog. 22 (6), 1570-1577 (2006).</li>
<li>Harbers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheat+germ+systems+for+cell-free+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Wheat germ systems for cell-free protein expression.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2762-2773 (2014).</li>
<li>Kobs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+the+cell-free+protein+expression+system+that+meets+your+experimental+goals%5BTitle%5D)+AND+%22Promega+Corporation%22%5BJournal%5D)">Selecting the cell-free protein expression system that meets your experimental goals.</a> Promega Corporation. 21, 6-9 (2008).</li>
<li>Kovtun, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+cell-free+protein+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Leishmania cell-free protein expression system.</a> Methods. 55 (1), 58-64 (2011).</li>
<li>Basile, G., Peticca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Leishmania+tarentolae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Leishmania tarentolae.</a> Mol Biotechnol. 43 (3), 273-278 (2009).</li>
<li>Mureev, S., Kovtun, O., Nguyen, U. T., Alexandrov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-independent+translational+leaders+facilitate+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Species-independent translational leaders facilitate cell-free expression.</a> Nat Biotechnol. 27 (8), 747-752 (2009).</li>
<li>Gambin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+reveals+the+oligomerization+and+folding+steps+driving+the+prion-like+behavior+of+ASC%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence reveals the oligomerization and folding steps driving the prion-like behavior of ASC.</a> J Mol Biol. 430 (4), 491-508 (2018).</li>
<li>Sierecki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+mapping+of+interactions+between+human+SNX-BAR+proteins+measured+in+vitro+by+AlphaScreen+and+single-molecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Rapid mapping of interactions between human SNX-BAR proteins measured in vitro by AlphaScreen and single-molecule spectroscopy.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2233-2245 (2014).</li>
<li>Sierecki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomolar+oligomerization+and+selective+co-aggregation+of+alpha-synuclein+pathogenic+mutants+revealed+by+single-molecule+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Nanomolar oligomerization and selective co-aggregation of alpha-synuclein pathogenic mutants revealed by single-molecule fluorescence.</a> Sci Rep. 6, 37630(2016).</li>
<li>Leitao, A., Bhumkar, A., Hunter, D. J. B., Gambin, Y., Sierecki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+a+selective+mechanism+for+the+inhibition+of+alpha-synuclein+aggregation+by+beta-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Unveiling a selective mechanism for the inhibition of alpha-synuclein aggregation by beta-synuclein.</a> Int J Mol Sci. 19 (2), 334(2018).</li>
<li>Gambin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+reveals+self+assembly+and+nanoscale+segregation+of+two+distinct+cavin+subcomplexes+on+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis reveals self assembly and nanoscale segregation of two distinct cavin subcomplexes on caveolae.</a> Elife. 3, e01434(2013).</li>
<li>Ve, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+TIR-domain-assembly+formation+in+MAL-+and+MyD88-dependent+TLR4+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis of TIR-domain-assembly formation in MAL- and MyD88-dependent TLR4 signaling.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (9), 743-751 (2017).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+organisation+of+in+vitro+reconstituted+HOPS+and+CORVET+multisubunit+membrane+tethering+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Subunit organisation of in vitro reconstituted HOPS and CORVET multisubunit membrane tethering complexes.</a> PLoS One. 8 (12), e81534(2013).</li>
<li>Ruehrer, S., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+Leishmania+tarentolae+cell-free+extracts+for+the+synthesis+of+human+solute+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploiting Leishmania tarentolae cell-free extracts for the synthesis of human solute carriers.</a> Mol Membr Biol. 30 (4), 288-302 (2013).</li>
<li>Varasteh Moradi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Interactions+among+cell-free+expressed+Zika+virus+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping Interactions among cell-free expressed Zika virus proteins.</a> J Proteome Res. 19 (4), 1522-1532 (2020).</li>
<li>Gagoski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+pipeline+for+discovery+of+thermotolerant+xylanases+and+endo-1%2C4-beta-glucanases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-free pipeline for discovery of thermotolerant xylanases and endo-1,4-beta-glucanases.</a> J Biotechnol. 259, 191-198 (2017).</li>
<li>Ergun Ayva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+performance+parameters+of+artificial+allosteric+protein+switches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring performance parameters of artificial allosteric protein switches.</a> J Mol Biol. 434 (17), 167678(2022).</li>
<li>Lau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+biosensor+for+real-time+interaction+dynamics+of+host+proteins+with+HIV-1+capsid+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Fluorescence biosensor for real-time interaction dynamics of host proteins with HIV-1 capsid tubes.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 11 (38), 34586-34594 (2019).</li>
<li>Ryan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+antiinflammatory+biologics+shaped+by+parasite-host+coevolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Novel antiinflammatory biologics shaped by parasite-host coevolution.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119 (36), e2202795119(2022).</li>
<li>McMahon, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intracellular+cavin+target+proteins+reveals+cavin-PP1alpha+interactions+regulate+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of intracellular cavin target proteins reveals cavin-PP1alpha interactions regulate apoptosis.</a> Nat Commun. 10 (1), 3279(2019).</li>
<li>Sierecki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+approach+to+accelerate+the+study+of+protein-protein+interactions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">A cell-free approach to accelerate the study of protein-protein interactions in vitro.</a> Interface Focus. 3 (5), 20230018(2013).</li>
<li>Johnston, W. A., Moradi, S. V., Alexandrov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaption+of+the+Leishmania+cell-free+expression+system+to+high-throughput+analysis+of+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaption of the Leishmania cell-free expression system to high-throughput analysis of protein interactions.</a> Methods Mol Biol. 2025, 403-421 (2019).</li>
<li>Jung, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+formation+and+interactome+analysis+of+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-free formation and interactome analysis of caveolae.</a> J Cell Biol. 217 (6), 2141-2165 (2018).</li>
<li>Fontaine, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+domain+analysis+of+SOX18+transcription+factor+using+a+single-chain+variable+fragment-based+approach%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Functional domain analysis of SOX18 transcription factor using a single-chain variable fragment-based approach.</a> MAbs. 10 (4), 596-606 (2018).</li>
<li>Overman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+the+transcription+factor+SOX18+delays+breast+cancer+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of the transcription factor SOX18 delays breast cancer in mice.</a> Elife. 6, e21221(2017).</li>
<li>Kubala, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+farnesyltransferase+alpha+subunit+regulates+vacuolar+protein+sorting-associated+protein+4A+%28Vps4A%29--dependent+intracellular+trafficking+through+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Mammalian farnesyltransferase alpha subunit regulates vacuolar protein sorting-associated protein 4A (Vps4A)--dependent intracellular trafficking through recycling endosomes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 468 (4), 580-586 (2015).</li>
<li>Han, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+scaffolds+Arp2%2F3+and+WAVE2+at+the+epithelial+zonula+adherens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cortactin scaffolds Arp2/3 and WAVE2 at the epithelial zonula adherens.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7764-7775 (2014).</li>
<li>Das Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+IIa+histone+deacetylases+drive+toll-like+receptor-inducible+glycolysis+and+macrophage+inflammatory+responses+via+pyruvate+kinase+M2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Class IIa histone deacetylases drive toll-like receptor-inducible glycolysis and macrophage inflammatory responses via pyruvate kinase M2.</a> Cell Rep. 30 (8), 2712-2728.e8 (2020).</li>
<li>Leitão, A. D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectivity+of+protein+interactions+along+the+aggregation+pathway+of+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Selectivity of protein interactions along the aggregation pathway of α-synuclein.</a> BioRxiv. , (2021).</li>
<li>Gagoski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+benchmarking+of+four+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Performance benchmarking of four cell-free protein expression systems.</a> Biotechnol Bioeng. 113 (2), 292-300 (2016).</li>
<li>Johnston, W. A., Alexandrov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+eukaryotic+cell-free+lysate+from+Leishmania+tarentolae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of eukaryotic cell-free lysate from Leishmania tarentolae.</a> Methods Mol Biol. 1118, 1-15 (2014).</li>
<li>Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+instabilities+explain+batch-to-batch+variability+in+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems.</a> Biotechnol Bioeng. 115 (8), 1904-1914 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>PD-10 SuperDex 25 Sütun</td><td>Cytiva</td><td>17085101</td><td>Jel filtrasyon sütunları</td></tr><tr><td>Azot Kavitasyon hücre bozucu</td><td>Parr Industries</td><td>4635 veya 4639</td><td>Hücre Bozucu</td></tr><tr><td>Sığır türevi Hemin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5533</td><td>Kültür katkı maddesi</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin 10000U / ml</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140122</td><td>Antibiyotik karışımı</td></tr><tr><td>Optiplate 384</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6007290</td><td>10ul ekspresyonları için çok kuyulu plaka</td></tr><tr><td>Oligonükleotid</td><td>IDT sentezi</td><td></td><td>&nbsp; CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT dizili oligo</td></tr><tr><td>Kreatin Fosfokinaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-15-4</td><td>Enzim</td></tr><tr><td>Tecan Spark</td><td>Tecan</td><td></td><td>veya benzeri Çok Modlu Plaka Okuyucu</td></tr><tr><td>Chemidoc MP Görüntüleyici</td><td>Biorad</td><td></td><td>veya benzeri SDS-PAGE jel Görüntüleyici%</td></tr><tr><td>4-12 Bis-Tris Jeller</td><td>Invitrogen</td><td>NW04125</td><td>SDS-PAGE jeller</td></tr><tr><td>Biyofotometre</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>veya benzeri Cuvette Specrofotometre</td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>Nanodrop spektrofotometre</td></tr><tr><td>Avanti JXN-26 santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>veya benzeri santrifüj, 10K ve 50K dereceli rotorlar/tüpler ile</td></tr><tr><td>g 5424R mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>veya benzeri mikrosantrifüj, 1.5ml mikrosantrifüj tüplü</td></tr><tr><td>Şişe İnkübatörü Inova S44i</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>veya benzeri şişe inkübatör çalkalayıcı 5L Şişeler için uygun</td></tr><tr><td>5L cam kültür şişeleri</td><td></td><td></td><td>Kültür büyümesi için şaşkın cam şişeler</td></tr><tr><td>Bactotryptone</td><td>BD</td><td>211705</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Merck</td><td>VM930053</td><td>Büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td></td><td></td><td>Herhangi bir analitik sınıf</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td></td><td></td><td>Herhangi bir analitik sınıf</td></tr><tr><td>KH2PO 4</td><td></td><td></td> Herhangi <td>bir analitik sınıf</td></tr><tr><td>K 2 HPO 4 </td><td></td><td></td> <td>Herhangi bir analitik sınıf</td></tr><tr><td>UltraPure su</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>Veya herhangi bir MilliQ tipi su sebilinden çıktı</td></tr></tbody></table>

rekombinant protein Üretimi için leishmania tarentolae türetilmiş hücresiz protein ekspresyon sistemi olan lte'nin Üretimi ve optimizasyonu

Production and Optimization of LTE, a Leishmania tarentolae Derived Cell-Free Protein Expression System for Recombinant Protein Production

Hücresiz protein ekspresyonunun amacı, çok çeşitli uygulamalar için uygun, katlanmış, aktif bir formda tam uzunlukta proteinler üretmektir. LTE (Leishmania tarentolae özütü) daha önce diğer prokaryotik ve ökaryotik hücresiz ekspresyon sistemleriyle karşılaştırılmış ve özellikle E. coli bazlı hücresiz ekspresyon33 ile karşılaştırıldığında, en iyi şekilde çalışırken kesilme ve agregasyonu önlemek için yüksek bir kapasite göstermiştir. Bununla birlikte, buna daha önce çıktı kalitesinde partiden partiye önemli farklılıklar eşlik ediyordu. Mevcut yöntem, esas olarak LTE'nin alikotlarda ilk dondurulmasından önce gerekli besleme çözeltisinin kısmen eklenmesi yoluyla tutarlı çıktı kalitesi sağlamak için daha fazla iyileştirme içermektedir. Bunu, sonraki her reaksiyona eklenebilen veya donmuş alikotları doğrudan tamamlamak için kullanılabilen bir tamamlama çözeltisinde rNTP.Mg transkripsiyonel girdinin optimizasyonu takip eder. Optimizasyon reaksiyonlarının, proteinleri pratik olarak eksprese etmek için LTE'nin tipik kullanımını temsil etmesi ve reaksiyonların 25 ° C'de 2 saat boyunca gerçekleştirilmesi dikkat çekicidir.
Hücresiz reaksiyonlarda rNTP.Mg konsantrasyonunun optimize edilmesinden elde edilen veriler, temsili bir veri seti sağlar. İfade seviyeleri tipik olarak transkripsiyonel girdi (rNTP.Mg) yükseldikçe artar ve bu da başarılı ifadeyi gösterir. Bununla birlikte, sistemin, özellikle daha büyük proteinler (&gt;50 kDa) söz konusu olduğunda, kesilmiş ürünlerin üretken olmayan ifadesine yöneldiği bir eşiğe ulaşılır. Bu suboptimal ekspresyon, özellikle polipeptitin translasyonunun floroforun kendisine ulaşmadığı C-terminal florofor füzyonlarında belirgin olan, artan rNTP.Mg ile floresan sinyali kaybına yol açar. N-terminal füzyonları için, genel RFU'da (Bağıl Floresan Birimleri) bir azalma, aşırı rNTP.Mg ile mutlaka meydana gelmese de, başarısız ekspresyon, SDS-PAGE jellerinde azalan boyutlarda çoklu floresan ürünler olarak gözle görülür şekilde belirgindir. Bu yaklaşım, numunelerin karıştırıldıktan sonra ısıtılmaması koşuluyla, geleneksel bir SDS-PAGE jeli üzerinde görselleştirildiğinde bile GFP'nin (Yeşil Floresan Protein) floresanı koruma yeteneğinden yararlanır. Bunun yerine, jel yükleme tamponu ile karıştırılır ve doğrudan jel üzerine yüklenir. SDS-PAGE jel malzemeleri ve ekipmanı genellikle birbirinin yerine kullanılabilirken, jel görüntüleyici GFP floresansını görselleştirebilmelidir. GFP görselleştirmesi için tipik bir konfigürasyon, 485 nm'de (bant genişliği 5 nm) uyarma, 516 nm'de emisyon (bant genişliği 5 nm) ve 2 saat boyunca 1 dakikalık bir okuma aralığı ile sağlanır.
Yalnızca eGFP ifadesini kullanarak sistemi optimize etmek mümkündür. Şekil 2A,B (ek), eGFP RFU'nun artan rNTP.Mg konsantrasyonları ile arttığı, maksimum RFU için +0.6x rNTP.Mg ve +0.3x rNTP.Mg'lik optimum bir seviyeye ulaştığı iki LTE partisi için optimizasyon reaksiyonlarının tipik ifade çıktılarını göstermektedir. Azaltılmış rNTP besleme çözümü, 0,6 kat rNTP.Mg içerir ve bu LTE partileri için varsayılan miktarın 1,2 katı ve 0,9 katı toplam rNTP.Mg seviyeleri ile sonuçlanır. Şekil 2C, Şekil 2B'deki LTE partisi için reaksiyon sırasında RFU artışının kinetiğini göstermektedir ve reaksiyon süresi boyunca iki ayrı faz ile iki fazlı bir bifazik reaksiyonu göstermektedir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65592/65592fig02.jpg"> Şekil 2: Azaltılmış rNTP 5x FS ile LTE'de rNTP.Mg tamamlama ilavesinin optimizasyonu. (A) Hücresiz ekspresyon reaksiyonunda değişen rNTP.Mg tamamlama seviyelerinde bir kontrol plazmitinden 140 dakikalık ekspresyondan sonra eGFP'nin ekspresyon seviyeleri (n = 3, Ortalama ± SD çizildi). (B) Belirli bir rNTP.Mg eşiğinin ötesinde azaltılmış ifade gösteren farklı bir LTE üretim partisinin optimizasyonu. (C) (B) ile aynı reaksiyonlarda, artan rNTP.Mg doldurma ile eGFP birikiminin kinetiği. Bu veriler aynı zamanda LTE toplu ifadesinde protein birikiminin tipik kinetiğini de temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65592/65592fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bununla birlikte, katlanması kolay küçük bir protein (27 kDa) olan eGFP'nin, kullanılan hücresiz ekspresyon sisteminden bağımsız olarak eksprese edilmesi, katlanması ve olgunlaşması muhtemel olduğu unutulmamalıdır. Sistemin arızalanması, ilgilenilen daha büyük proteinleri ifade ederken daha olasıdır ve kesilmiş ürünler 70 kDa'dan daha büyük girdi protein boyutlarında daha belirgin hale gelir33. Bu nedenle, sistemin gerçek kullanım için amaçlanan protein(ler) ile optimize edilmesi daha üstündür, eGFP hala miktar tayini için mevcuttur, ancak ilgilenilen protein ile bir N-terminal füzyonu olarak.
Şekil 3, kesilmiş ürünler (eGFP-Sox18) vermeye eğilimli daha büyük bir protein şablonu kullanıldığında rNTP.Mg tamamlama seviyesinin tipik bir optimizasyonunu temsil eder. Yarı doğal bir jel SDS-PAGE formatı kullanarak (yani, numuneleri ısıtmadan), ifadenin ilerleyici başarısızlığını görselleştirmek mümkündür. +0,1x'te optimum rNTP.Mg ilavesi (kısmi besleme çözeltisindeki 0,6x rNTP.Mg ile birleştiğinde, toplam 0,7x'tir), toplam floresan ekspresyon ürünlerinin bir parçası olarak tam uzunlukta protein bandının fraksiyonunu belirgin bir şekilde azaltır ve fazla rNTP.Mg ilavesi ile sistem arızasını gösterir.
Protokolde belirtildiği gibi, rNTP.Mg optimizasyon adımını atlamak ve adım 6.2'deki jel filtrasyonundan hemen sonra takviye sırasında tam rNTP.Mg miktarını doğrudan "varsayılan" besleme çözeltisine eklemek mümkündür. Bunu yaparak, protokol esasen LTE34 oluşturmak için yayınlanan orijinal yöntemlere geri döner. Bununla birlikte, yazarlar, Şekil 3'te (Lane D'den Lane E'ye) gösterildiği gibi, sistemin optimum performans için uyarlanmasının, ek protokol karmaşıklığından daha ağır bastığına ve bir protein ekspresyon aracı olarak LTE'nin değerini artırdığına inanmaktadır.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65592/65592fig03.jpg"> Şekil 3: Kısmen takviye edilmiş LTE'de artan rNTP.Mg yüklemenin eGFP-Sox18 ekspresyonu üzerindeki etkisi. Artan rNTP.Mg yüklemenin eGFP-Sox18 ekspresyonu üzerindeki etkisini gösteren yarı doğal SDS-PAGE jeli. A Şeridi: +0,1x (rNTP.Mg) yükleme, B Şeridi: +0,2x (rNTP.Mg), C Şeridi: +0,3x (rNTP.Mg), D Şeridi: +0,4x (rNTP.Mg). N-terminal eGFP füzyonu, jelin floresan taraması ile görselleştirilir. Şerit A'daki birincil bant, tam uzunlukta eGFP-Sox18'i temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65592/65592fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">Parça</td>
			<td rowspan="2">Stok konsantrasyonu</td>
			<td>5x Besleme Çözümü</td>
			<td>μL stok/mL 5x Besleme Çözeltisi</td>
		</tr><tr><td>Varsayılan (azaltılmış rNTP)</td>
			<td>Varsayılan (azaltılmış rNTP)</td>
		</tr><tr><td>Spermidin</td>
			<td>100 milyon</td>
			<td>1,25 milyon</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>DTT (DTT)</td>
			<td>500 milyon</td>
			<td>10 milyon</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>Kreatin Fosfat</td>
			<td>1000 mM</td>
			<td>200 milyon</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td>HEPES-KOH pH7.6</td>
			<td>2500 milyon</td>
			<td>100 milyon</td>
			<td>40</td>
		</tr><tr><td>PEG3000</td>
			<td>0,5 V/V</td>
			<td>0,05 V/V</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyli</td>
			<td>120 katı</td>
			<td>5 katı</td>
			<td>43</td>
		</tr><tr><td>Amino Asitler</td>
			<td>3,6 mM (adet)</td>
			<td>0,68 mM (adet)</td>
			<td>190</td>
		</tr><tr><td>ATP</td>
			<td>100 milyon</td>
			<td>8,5 (5,1) milyon</td>
			<td>85 (51)</td>
		</tr><tr><td>GTP (Küresel Ticari Ürün Numarası</td>
			<td>100 milyon</td>
			<td>3,2 (1,9) milyon</td>
			<td>32 (19)</td>
		</tr><tr><td>UTP</td>
			<td>100 milyon</td>
			<td>2,5 (1,5) mM</td>
			<td>25 (15)</td>
		</tr><tr><td>CTP (Otomotiv Teknolojileri T</td>
			<td>100 milyon</td>
			<td>2,5 (1,5) mM</td>
			<td>25 (15)</td>
		</tr><tr><td>Mg(OAc)2</td>
			<td>1 milyon</td>
			<td>16,7 (10) milyon</td>
			<td>16,7 (10)</td>
		</tr><tr><td>Ekleme önleyici lider oligo</td>
			<td>1 milyon</td>
			<td>0,05 mM</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>T7 RNA polimeraz</td>
			<td>5 mg / mL</td>
			<td>0.5 mg / mL</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>Kreatin Fosfokinaz</td>
			<td>5 birim/μL</td>
			<td>0,2 birim/μL</td>
			<td>42</td>
		</tr><tr><td>Ultra saf su</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>19 (93)</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: LTE için 5x besleme çözeltisinin (5x FS) bileşimi. Jel filtrasyonundan sonra her 2,5 mL takviye edilmemiş lizat için 1 mL 5x FS gereklidir. Varsayılan 5x FS ile takviye, 7 μL/10 μL oranında ekspresyon reaksiyonlarında kullanım için ifadeye hazır bir LTE oluşturur. Azaltılmış rNTP.Mg tarifi (italik olarak yazılan miktarlar) LTE ifade optimizasyonu için önerilir ve varsayılan rNTP ve magnezyum seviyelerinin 0,6 katını içerir. Bunlar, Tablo 2'de özetlenen eklemeler kullanılarak sonraki optimizasyon deneyinde değişken seviyelere (0,6 ila 1,1 kat) ayarlanabilir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>rNTP yüklemesi</td>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>GTP (100 mM)</td>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>MgOAc (1 M)</td>
			<td rowspan="2">Ultra saf su</td>
		</tr><tr><td>(1 μL/10 μL rxn)</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
		</tr><tr><td>+0x</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td>+0,1 kat</td>
			<td>3.4</td>
			<td>1.3</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.7</td>
			<td>193</td>
		</tr><tr><td>+0,2 kat</td>
			<td>6.8</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>1.3</td>
			<td>185</td>
		</tr><tr><td>+0,3 kat</td>
			<td>10.2</td>
			<td>3.8</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>178</td>
		</tr><tr><td>+0,4 kat</td>
			<td>13.6</td>
			<td>5.1</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>2.7</td>
			<td>171</td>
		</tr><tr><td>+0,5 kat</td>
			<td>17</td>
			<td>6.4</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>3.3</td>
			<td>163</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: LTE optimizasyonu için (rNTP.Mg) yükleme çözümlerinin bileşimi. Bu çözeltiler, 10 μL protein ekspresyon reaksiyonu başına 1 μL tamamlama çözeltisi ekleyerek LTE'yi optimize etmek için kullanılır. Optimizasyon deneyinde bir tamamlama seviyesi belirlendikten sonra, aynı LTE toplu alikotları kullanılarak sonraki tüm protein ekspresyon reaksiyonlarına tutarlı bir şekilde eklenebilir. Alternatif olarak, 7 μL'de 1 μL ilavesiyle (çözülmeden) doğrudan alikotlara eklenebilir. Çözüldükten ve karıştırıldıktan sonra, bu lizatlar 10 μL protein ekspresyonu başına 8 μL LTE'de kullanılır ve optimizasyon sırasında belirlenen rNTP.Mg tamamlama seviyesini korur.

Rekombinant Protein Üretimi için Leishmania Tarentolae Türetilmiş Hücresiz Protein Ekspresyon Sistemi olan LTE'nin Üretimi ve Optimizasyonu

This protocol outlines the production and optimization of a eukaryotic Cell-Free Protein Expression System (CFPS) derived from the unicellular flagellate ...

production-optimization-lte-leishmania-tarentolae-derived-cell-free

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Bu beş günlük protokolü bütün adımlar, ekipman, ve esaslı etkili endojen Escherichia coli sıfırdan TX-TL hücre serbest ifade sistemi oluşturmak ve çalıştırmak için gerekli ek yazılım özetliyor. Reaktif ile protokol 8 kurulumu için saat veya daha az bir tepki toplamak ve işlem verileri alır.

Bir uygulama için Protokoller Escherichia coli Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Memeli sistemleri tarafından rekombinant proteinlerin ekspresyonu, yapısal biyoloji için protein kompleksleri üretmek için çekici bir yöntem haline geliyor. Burada, yapısal çalışmalar için protein komplekslerini saflaştırmak için süspansiyonda yetiştirilen memeli hücrelerini kullanan basit ama oldukça verimli bir ekspresyon sistemi sunuyoruz.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

Hücre temelli sistemlerde sıtma proteinlerin sentezlenmesi zor kalır. Biz HeLa hücrelerinden sıtma rekombinant proteinleri ifade rhoptry için iki adım ve (in vitro çeviri) bir adım IVT hücresi serbest ifade sistemlerini göstermektedir. Biz rhoptry proteinleri saflaştırmak için bir Ni-afinite reçinesi bazlı saflaştırma sistemini kullanır.

İfadesi için HeLa Tabanlı Hücre Özgür İfade Sistemleri<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteinler

Bu, salgılanan, glikosile edilmiş memeli proteinlerinin üretimi ve ardından X-ışını kristalografisi ve diğer biyofiziksel çalışmalar için yeterli homojen protein verimi ile tek aşamalı saflaştırma için hızlı, uygun maliyetli bir protokoldür.

Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Bu protokol, RNA ve protein üreten sentetik hücrelerin aşağıdan yukarıya hazırlanması için yöntem, malzeme, ekipman ve adımları açıklamaktadır. Sentetik hücrelerin iç sulu bölmesi bir lipid bilayer içinde kapsüllenmiş S30 bakteriyel lizat içeriyordu (yani, istikrarlı lipozomlar), bir su-in-oil emülsiyon transferi yöntemi kullanarak.

Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama

Bu protokol, Escherichia coli'nin tasarlanmış bir suşunu kullanarak ve sadece standart laboratuvar ekipmanı gerektiren hücresiz gen ekspresyözü için bakteriyel lisat üretmek için hızlı ve basit bir yöntemi açıklar.

Bakteri hücresi içermeyen Lysate'in Hızlı, Uygun Fiyatlı ve Karmaşık Olmayan Üretimi

Burada, pLEXSY sistemini kullanarak eGFP genini stabil bir entegre transgen olarak eksprese eden L. panamensis ve L . donovani suşlarını oluşturmak için kullanılan metodolojiyi açıklıyoruz. Transfekte edilen parazitler, seyreltme sınırlandırılarak klonlandı ve her iki türde de en yüksek floresan yoğunluğuna sahip klonlar, ilaç tarama testlerinde daha fazla kullanılmak üzere seçildi.

eGFP'nin Yapısal Ekspresyonu ile Leishmania Tür Suşlarının Gelişimi

Bu protokol, sentetik hücrelerin yapımında kullanılan Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) sistemini tanımlar. Farklı mikro bölmelerde temsili sonuçlarla temel aşamaları ana hatlarıyla belirtir. Protokol, sentetik hücre topluluğundaki çeşitli laboratuvarlar için en iyi uygulamaları oluşturmayı ve sentetik hücre gelişiminde ilerlemeyi ilerletmeyi amaçlamaktadır.

Sentetik hücreler oluşturmak için hücresiz protein sentez sistemi

Protein ekspresyonunu kontrol etmek sadece yaşayan her organizma için gerekli değildir, aynı zamanda hücresel modellerde protein fonksiyonlarını araştırmak için de önemli bir stratejidir. Sunulan protokol, primer hipokampal nöronlar dahil olmak üzere memeli hücrelerinde antikor girişiminin uygulanmasını gösterir ve protein fonksiyonunun incelenmesinde üç boyutlu rekonstrüksiyonların kullanımını gösterir.

Incelenmesi Protein Fonksiyonu ve Antikor Girişim ve üç boyutlu Rekonstrüksiyonunda tarafından değiştirilmiş Protein Ekspresyonu Rolü

Öğrenin, rekombinant protein üretimi için Leishmania tarentolae kaynaklı hücresiz protein ekspresyon sistemi LTE'nin üretim ve optimizasyon yöntemlerini. Bu sistem oda sıcaklığında stabil kalır ve taşımayı kolaylaştırır.

Rekombinant Protein Üretimi için Leishmania Tarentolae Türetilmiş Hücresiz Protein Ekspresyon Sistemi olan LTEnin Üretimi ve Optimizasyonu (Video) | JoVE Journal

Rekombinant Protein Üretimi için Leishmania Tarentolae Türetilmiş Hücresiz Protein Ekspresyon Sistemi olan LTE'nin Üretimi ve Optimizasyonu

Daha fazla video keşfet