3 Boyutlu Beyin Organoidlerinde Çoklu Mitokondriyal Parametrelerin Ölçümü için Flow Sitometrik Analizin Uygulanması

Sharika Marjan; Tsering Yangzom; Cecilie Katrin Kristiansen; Anbin Chen; Laurence A. Bindoff; Kristina Xiao Liang

doi:10.3791/65621

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

3 Boyutlu Beyin Organoidlerinde Çoklu Mitokondriyal Parametrelerin Ölçümü için Flow Sitometrik Analizin Uygulanması

1.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65621

⸱

4 Ağustos 2023

Sharika Marjan¹^,² , Tsering Yangzom¹^,² , Cecilie Katrin Kristiansen¹^,³ , Anbin Chen⁴ , Laurence A. Bindoff¹^,⁵^,⁶ , Kristina Xiao Liang¹^,³

¹Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, ²Centre for International Health, Department of Global Public Health and Primary Care, University of Bergen, ³Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, ⁴Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, ⁵Department of Neurology, Haukeland University Hospital, ⁶National Advisory Unit for Congenital Metabolic Diseases, Oslo University Hospital

Bu makalede

Özet

Bu protokol, mitokondriyal hacimdeki değişiklikler, mitokondriyal solunum zinciri (MRC) kompleks alt birimlerinin miktarları ve mitokondriyal DNA (mtDNA) replikasyonu dahil olmak üzere çoklu mitokondriyal fonksiyonel parametrelerin eşzamanlı değerlendirmesi için bir akış sitometresi ve çoklu antikorların kullanılması için benzersiz bir yöntem bildirir.

Özet

Mitokondriyal disfonksiyon, birçok nörodejenerasyon tipine ortak bir birincil veya ikincil katkıda bulunur ve mitokondriyal kütle, mitokondriyal solunum zinciri (MRC) kompleksleri ve mitokondriyal DNA (mtDNA) kopya sayısındaki değişiklikler sıklıkla bu süreçlerde yer alır. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) türetilen insan beyni organoidleri, beynin üç boyutlu (3D) sitomimari düzenlemesini özetler ve karmaşık bir insan sisteminde hastalık mekanizmalarını inceleme ve yeni terapötikleri tarama imkanı sunar. Burada, iPSC'den türetilmiş kortikal organoidlerde çoklu mitokondriyal parametreleri ölçmek için benzersiz bir akış sitometrisi tabanlı yaklaşım bildiriyoruz. Bu rapor, iPSC'lerden kortikal beyin organoidleri üretmek, üretilen organoidlerin tek hücreli ayrışması, fiksasyon, boyama ve çoklu mitokondriyal parametreleri değerlendirmek için müteakip akış sitometrik analizi için bir protokolü detaylandırır. MRC kompleksi alt birimi NADH'ye karşı antikorlarla çift boyama: Ubikinon Oksidoredüktaz Alt Birimi B10 (NDUFB10) veya mitokondriyal transkripsiyon faktörü A (TFAM), voltaja bağlı anyon seçici kanal 1 (VDAC 1) ile birlikte mitokondri başına bu proteinlerin miktarının değerlendirilmesine izin verir. TFAM miktarı mtDNA miktarına karşılık geldiğinden, mitokondriyal içerik başına mtDNA kopyalarının sayısının dolaylı bir tahminini sağlar. Tüm bu prosedür 2-3 saat içinde tamamlanabilir. En önemlisi, mitokondriyal kütleye göre hem toplam hem de spesifik seviyeler dahil olmak üzere çoklu mitokondriyal parametrelerin eşzamanlı olarak ölçülmesine izin verir.

Giriş

Mitokondri, temel hücresel organellerdir ve adenozin trifosfat (ATP) üretiminin ana bölgesidir. Mitokondri, hücreler için enerji sağlamanın yanı sıra, hücre bilgi iletimi, hücre farklılaşması ve apoptoz dahil olmak üzere çoklu hücresel süreçlere katılır ve hücre büyümesini ve hücre döngüsünü düzenleme yeteneğine sahiptir. Parkinson hastalığı (PD)^1,2, Alzheimer hastalığı (AD)³ ve amyotrofik lateral skleroz (ALS)⁴ dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda mitokondriyal fonksiyondaki değişiklikler tanımlanmıştır. Mitok....