Name: Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonun Tespiti için Sanger Dizilimi ile Birleştirilmiş Vahşi Tip Bloke Edici PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Öğrenin, anjiyoimmünoblastik lenfomada düşük frekanslı somatik mutasyon tespiti için Sanger dizilimi ile vahşi tip bloke edici PCR yöntemini. Bu hassas ve düşük maliyetli teknik, kanser araştırmalarında genetik varyasyonları belirlemek için uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Vahşi Tip Engelleme PCR ile Düşük Frekanslı Mutasyon Tespitini Optimize Etme

<ol><li>Penn Medicine. Testing for measurable/minimal residual disease (MRD). , Oncolink Team. 
 <a target="_blank" href="https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd">https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd</a> (2019).</li>
<li>Xie, Y., Elaine, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+I+diagnose+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">How I diagnose angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Am J Clin Pathol. 156, 1-14 (2021).</li>
<li>Mariko, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Cancer Treat Res. 176, 99-126 (2019).</li>
<li>Daniel, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute+lukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute lukemia.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li>
<li>Rita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5th+edition+of+the+World+Health+Organization+Classification+of+Haematolymphoid+Tumours+%3A+Lymphoid+Neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The 5th edition of the World Health Organization Classification of Haematolymphoid Tumours : Lymphoid Neoplasms.</a> Leukemia. 36 (7), 1720-1748 (2022).</li>
<li>Hae, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recurrent+inactivating+mutation+in+RHOA+GTPase+in+angioimmunoblastic+T+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A recurrent inactivating mutation in RHOA GTPase in angioimmunoblastic T cell lymphoma.</a> Nat Genet. 46 (4), 371-375 (2014).</li>
<li>Lee, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RHOA+G17V+mutation+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%3AA+potential+biomarker+for+cytological+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">RHOA G17V mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma:A potential biomarker for cytological assessment.</a> Exp Mol Pathol. 110, 104294(2019).</li>
<li>Mamiko, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+RHOA+mutation+in+angioimmunoblastic+T+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Somatic RHOA mutation in angioimmunoblastic T cell lymphoma.</a> Nat Genet. 46 (2), 171-175 (2014).</li>
<li>Palomero, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+mutations+in+epigenetic+regulators%2C+RHOA+and+FYN+kinase+in+peripheral+T+cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent mutations in epigenetic regulators, RHOA and FYN kinase in peripheral T cell lymphomas.</a> Nat Genet. 46 (2), 166-170 (2014).</li>
<li>Fujisawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+RHOA-VAV1+signaling+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Activation of RHOA-VAV1 signaling in angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Leukemia. 32 (3), 694-702 (2018).</li>
<li>Voena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RHO+family+GTPases+in+the+biology+of+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">RHO family GTPases in the biology of lymphoma.</a> Cells. 8 (7), 646(2019).</li>
<li>Shendure, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+an+40%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing an 40: past, present and future.</a> Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).</li>
<li>Athanasios, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Sanger+sequencing%2C+pyrosequencing%2C+and+melting+curve+analysis+for+the+detection+of+KRAS+mutations%3A+diagnostic+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications.</a> J Mol Diagn. 12 (4), 425-432 (2010).</li>
<li>Wu, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+enrichment+of+rare+DNA+variants+via+sequence-selective+and+temperature-robust+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Multiplexed enrichment of rare DNA variants via sequence-selective and temperature-robust amplification.</a> Nat Biomed Eng. 1, 714-723 (2017).</li>
<li>John, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thermodynamics+of+DNA+structural+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">The thermodynamics of DNA structural motifs.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 415-440 (2004).</li>
<li>Coren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+methods+for+the+enrichment+of+minority+alleles+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations.</a> Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).</li>
<li>Eliza, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+in+B-cell+lymphoma%3A+technical+advances%2C+clinical+applications%2C+and+perspectives+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA in B-cell lymphoma: technical advances, clinical applications, and perspectives for translational research.</a> Leukemia. 36 (9), 2151-2164 (2022).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot-spot-specific+probe+%28HSSP%29+for+rapid+and+accurate+detection+of+KRAS+mutations+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Hot-spot-specific probe (HSSP) for rapid and accurate detection of KRAS mutations in colorectal cancer.</a> Biosensors. 12 (8), 597(2022).</li>
<li>Matsubara, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+the+G17V+RHOA+mutation+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma+and+related+lymphomas+using+quantitative+allele-specific+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of the G17V RHOA mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma and related lymphomas using quantitative allele-specific PCR.</a> PLoS One. 9 (10), e109714(2014).</li>
<li>Dieffenbach, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).</li>
<li>Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%223730%2F3730xl+DNA+Analyzer%22">3730/3730xl DNA Analyzer</a>. , (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Otomatik DNA çıkarıcı</td><td>9001301</td><td>Qiagen</td><td></td></tr><tr><td>DNA nükleik asit dedektörü</td><td>Q32854</td><td>Thermo fisher</td><td></td></tr><tr><td>PCR amplifikasyon kiti</td><td>P4600</td><td>merck</td><td></td></tr><tr><td>PCR cihazı</td><td>C1000 Touch</td><td>Biorad</td><td></td></tr><tr><td>proteinaz K çözeltisi</td><td>D3001-2-A</td><td>zymo araştırma</td><td></td></tr><tr><td>proteinaz K depolama tamponu</td><td>D3001-2-C</td><td>zymo araştırma</td><td></td></tr><tr><td>Sıralama amplifikasyon enzim kiti</td><td>P7670-FIN</td><td>Qiagen</td><td></td></tr></tbody></table>

düşük frekanslı somatik mutasyonun tespiti için sanger dizilimi ile birleştirilmiş vahşi tip bloke edici pcr

Wild-type Blocking PCR Combined with Sanger Sequencing for Detection of Low-frequency Somatic Mutation

Test numunesinin mutasyon durumunu elde etmek için test numunesinin dizisini referans dizisiyle karşılaştırın. BDA tabanlı WBT-PCR teknolojisi, yukarı ve aşağı akış primerlerinin amplifikasyon aralığındaki bilinen RHOA G17V mutasyonunu ve diğer düşük frekanslı mutasyonları tespit edebilir. Şekil 1'e bakın. IDH2 ve JAK1 olmak üzere iki ek gen de bu yöntem kullanılarak analiz edildi, sırasıyla Şekil 2 ve Şekil 3. Sonuçlar, bu yöntemin düşük frekanslı mutasyonları tespit etmede oldukça hassas olduğunu göstermektedir.
<img alt="DNA dizileme kromatogramı; RHOA mutasyon tespit karşılaştırmasını gösteren geleneksel PCR ve WBT-PCR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Şekil 1: RHOA için sıralama sonucu. Yukarıdan aşağıya, şekil, WBT-PCR ile amplifiye edilen RHOA G17 bölgesinin baz mutasyonunu ve vahşi tip RHOA G17'ye karşılık gelen geleneksel PCR amplifikasyonundan sonraki sıralama sonuçlarını göstermektedir. Ortadaki resim, algılama duyarlılığı% 0.5 olduğunda WBT-PCR primerleri ile amplifikasyondan sonra c.50G&gt;T mutasyonunun dizileme sonuçlarını göstermektedir. Alttaki resim, algılama duyarlılığı% 0.5 olduğunda WBT-PCR primerleri ile amplifikasyondan sonra c.49-50delinsTT mutasyonunun sıralama sonuçlarını göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="WBT-PCR ve geleneksel PCR kromatogram karşılaştırması, c.515G&gt;A mutasyon tespiti, IDH2 geni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Şekil 2: IDH2 için sıralama sonucu. Yukarıdan aşağıya, yukarıdaki şekil, WBT-PCR ile amplifiye edilen IDH2 R172 bölgesinin baz mutasyonunu ve vahşi tip IDH2 R172'ye karşılık gelen geleneksel PCR amplifikasyonundan sonraki sıralama sonuçlarını göstermektedir. Üstteki resim, algılama duyarlılığı %0,5 olduğunda WBT-PCR primerleri ile amplifikasyondan sonra c.515G&gt;A mutasyonunun dizileme sonuçlarını göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig02largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="DNA dizilimi karşılaştırması, WBT-PCR ve JAK1 mutasyon analizi tablosu için geleneksel PCR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Şekil 3: JAK1 için sıralama sonucu. Yukarıdan aşağıya, yukarıdaki şekil, WBT-PCR ile amplifiye edilen JAK1 S703 bölgesinin baz mutasyonunu ve vahşi tip JAK1 S703'e karşılık gelen geleneksel PCR amplifikasyonundan sonraki dizileme sonuçlarını göstermektedir. Üstteki resim, algılama duyarlılığı% 0.5 olduğunda WBT-PCR primerleri ile amplifikasyondan sonra c.2108G&gt;T mutasyonunun sıralama sonuçlarını göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Astar</td>
			<td colspan="2">Astar dizisi</td>
		</tr><tr><td>RHOA-VF (İngilizce)</td>
			<td colspan="2">ATAACCTTTTGGTGCCAGGT</td>
		</tr><tr><td>RHOA-Sanal Gerçeklik</td>
			<td colspan="2">GCTGAAGACTATGAGCAAGCA</td>
		</tr><tr><td>RHOA-WTB</td>
			<td colspan="2">AGCAAGCATGTCTTTCCACAGGCAAAA</td>
		</tr><tr><td>Sıralama astarı</td>
			<td colspan="2">ATAACCTTTTGGTGCCAGGT</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: RHOA'nın nihai tasarlanmış astar listesi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>IDH2 R172 astar</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Astar</td>
			<td>Astar dizisi</td>
		</tr><tr><td>IDH2-VF</td>
			<td>CTGGTTGAAAGATGGCGGCT</td>
		</tr><tr><td>IDH2-VR</td>
			<td>TACCTGGTCGCCATGGGC</td>
		</tr><tr><td>IDH2-WTB</td>
			<td>GCCATGGGCGTGCCTGCCAAAAT</td>
		</tr><tr><td>Sıralama astarı</td>
			<td>CTGGTTGAAAGATGGCGGCT</td>
		</tr><tr><td>JAK1 gen astarı</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Astar</td>
			<td>Astar dizisi</td>
		</tr><tr><td>JAK1-VF</td>
			<td>ACTCTGAGGCCGAGTAGTGT</td>
		</tr><tr><td>JAK1-VR</td>
			<td>CCATTATGGACATCAGGACATTC</td>
		</tr><tr><td>JAK1-WTB</td>
			<td>GGACATTCTCACCAAGTAGCTCAGAAAA</td>
		</tr><tr><td>Sıralama astarı</td>
			<td>ACTCTGAGGCCGAGTAGTGT</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: IDH2 ve JAK1'in nihai tasarlanmış primer listesi.

Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonun Tespiti için Sanger Dizilimi ile Birleştirilmiş Vahşi Tip Bloke Edici PCR

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting ...

wild-type-blocking-pcr-combined-with-sanger-sequencing-for-detection

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Pooled DNA dizi büyük kohortlarında karmaşık fenotipleri ile ilişkili nadir türevlerini algılamak için hızlı ve maliyet-etkin bir stratejidir. Burada SPLINTER'da yazılım paketi kullanarak 32 kanser ilişkili genlerin havuzlu, yeni nesil dizileme sayısal analiz açıklanmaktadır. Bu yöntem, ölçeklenebilir ve menfaat fenotipi için geçerlidir.

SPLINTER kullanarak Pooled Sıralama gelen Nadir Genomik Variantların Algılama

Bu videoda, somatik mutasyonları tespit eden vahşi tip bloke edici polimeraz zincir reaksiyonu veya WTB-PCR açıklanmaktadır. PCR bazlı teknik, kilitli bir nükleik asit veya LNA, tamamlayıcı vahşi tip aleline bağlanan ve uzamasını bloke eden bir oligonükleotid kullanır. Blokaj, seçici olarak, düşük seviyeli mutant alellerin, numunedeki vahşi tip varyantları üzerinde amplifikasyonuna izin verir.

Düşük frekanslı somatik mutasyonları tespit etmek için vahşi tip bloke edici PCR

Biz Barkodlanan DNA kütüphaneleri ve büyük ölçüde paralel "yeni nesil" dizisi ile klinik tümör numunelerinde önemli kanserle ilişkili mutasyonların saptanması için olan hibridizasyon-bazlı sonraki ekson yakalama hazırlanmasını tarif etmektedir. Hedefli ekson dizileme nedenle düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için yüksek duyarlılık verimli, yüksek verimlilik, düşük maliyet ve derin dizisi kapsama avantajlar sunmaktadır.

Ekson yakalama ve Devasa Paralel Dizilimine tarafından Tümör Örneklerinin somatik genetik değişiklikler tespit

Bu el yazması, iki yeni nesil dizileme paneli için klinik protokolleri açıklamaktadır. Bir panel hematolojik maligniteleri sorgularken, diğer panel solid tümörlerde sıklıkla mutasyona uğrayan genleri hedef alır. İnsan malignitelerindeki sürücü mutasyonlarının moleküler sınıflandırması, değerli prognostik ve öngörücü bilgiler sunar.

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

Onkoloji örneklerinin hedeflenen yeni nesil dizilimi için entegre bir sistem tanımlanmıştır. Bu çapraz platform sistemi, düşük kaliteli ve düşük miktarlı tümör biyopsileri için optimize edilmiştir, düşük DNA girdilerini barındırır, iyi karakterize edilmiş çok varyantlı kontroller içerir ve kantitatif pre-analitik kalite kontrol önlemleriyle bilgilendirilen yeni bir varyant arayan içerir.

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

Vahşi tip blokaj PCR ve ardından doğrudan dizileme, çeşitli numune türlerinde düşük frekanslı somatik mutasyonlar için oldukça hassas bir tespit yöntemi sunar.

Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme

Yeni nesil sıralama (NGS) platformu (~0.5–2.0%) yüksek hata oranı tarafından sınırlı genomik karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. NGS hata oranı önlemek ve mutasyonlar varyant alleli kesirler 0,0001 nadir, tespit etmemize izin bizim hata düzeltilmiş sıralama yöntemleri açıklanmaktadır.

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Burada, doğru bir şekilde birden fazla genetik değişiklikler hedef bölge teslim ddPCR ve hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak tek bir tepki olarak ölçmek için bir protokol mevcut.

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Bu makalede, belirli bir hastadan farklı örnekler arasında klonal ve subklonal değişiklikleri tanımlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan deneyler belirli bir tümör tipine odaklansa da, yaklaşım diğer solid tümörler için genel olarak uygulanabilir.

Hedefe Yönelik Sıralama Yaklaşımı ile Karşılaştırmalı Lezyonlar Analizi

Öğrenin, anjiyoimmünoblastik lenfomada düşük frekanslı somatik mutasyon tespiti için Sanger dizilimi ile vahşi tip bloke edici PCR yöntemini. Bu hassas ve düşük maliyetli teknik, kanser araştırmalarında genetik varyasyonları belirlemek için uygulanabilir.

Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonun Tespiti için Sanger Dizilimi ile Birleştirilmiş Vahşi Tip Bloke Edici PCR

Daha fazla video keşfet