Name: Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanarak Bir Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutantında Mitokondriyal Fonksiyonun Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T12:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Keşfedin yüksek çözünürlüklü respirometri yöntemiyle Drosophila melanogaster PINK1 B9-null mutantında mitokondriyal fonksiyon analizini. Parkinson hastalığı ve biyoenerejik araştırmalar için değerli bir protokoldür.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Brezilya ajansı Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior'u (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020) kabul etmektedir. P.M. (#88887.512821/2020-00) ve T.D. (#88887.512883/2020-00) araştırma bursu alıcılarıdır.

Bloomington Drosophila stok merkezinden w1118 (beyaz) ve w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (Pink1B9 olarak anılır) suşlarını kullandık (FlyBase ID: FBgn0029891) (Kimlik numarası: 34749). Bu çalışmada, erkek D. melanogaster PINK1B9-null mutantları, kontrol grubu (genetik arka plan) olarak kullanılan w1118 suşundan erkek D. melanogaster ile karşılaştırılmıştır. Sineklerin doğru genotipe (Pink1B9/Y) sahip olduğundan emin olmak için diğer parametreler respirometri deneyleriyle birlikte analiz edilmelidir, örneğin toraks deformiteleri ve hareket problemleri gibi pembe1B9 mutant sinekler 24,25,26.
1. Hayvanlar ve barınak
<ol><li>Sinekleri 10 mL standart diyet (%1,73 maya, %0,9 soya unu, %7,3 mısır unu, %0,5 agar, %7,6 mısır şurubu ve %0,48 propiyonik asit) içeren cam şişelerde sabit sıcaklık ve nemde (sırasıyla 25 °C ve %60) 12 saat:12 saat aydınlık/karanlık döngüsünde saklayın.</li>
	<li>Her deney için, eklosiyondan 1-3 gün sonra iki sinek kullanın. NOT: PINK1B9-null mutant bakire dişi sinekleri, Pink1B9/Y genotipine sahip F1 erkeklerini elde etmek için w1118 erkekle çaprazlandı.</li>
</ol>2. Numune hazırlama
<ol><li>MiR05 arabelleğini Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın.</li>
	<li>Sinekleri buz üzerinde uyuşturun ve mikrosantrifüj tüplerine aktarın (tüp başına iki sinek).</li>
	<li>Her tüpe 200 μL soğutulmuş MiR05 tamponu ekleyin ve sinekleri homojenize edin. Mitokondrinin parçalanmasını önlemek için hafif bir basınç uygulayarak (havaneli yaklaşık 4-6 vuruş) manuel olarak homojenize edin.</li>
</ol>3. Polarografik oksijen sensörlerinin yüksek çözünürlüklü respirometri kalibrasyonu
NOT: OROBOROS odalarının toplam hacmi yaklaşık 2 mL'dir. Testi başlatmak için oksijen akısının 0 pmol'e yakın olduğundan emin olmak için kalibrasyon gereklidir.
<ol><li>Kalibrasyonu başlatarak, hazneye 2 mL MiR05 ekleyin. Hazneyi tıpa ile örtün, hava kabarcığı bırakmayın; Ardından, tek bir hava kabarcığı oluşturmak için durdurucuyu dikkatlice çekin.</li>
	<li>OROBOROS Dat.Lab yazılımını açın. Blok sıcaklığı alanına 25 °C'lik bir sıcaklık girin ve Oxygraph-2k'ye Bağlan'a tıklayın (Şekil 1A).</li>
	<li>Kalibrasyonun kaydedileceği klasörü tıklayıp seçin ve Kaydet'e tıklayın.</li>
	<li>Yeni bir pencere açıldığında, deneyi ve örnekleri adlandırın (kalibrasyon yapıyorsanız, kalibrasyon adını girmeniz yeterlidir) ve Kaydet'e tıklayın.</li>
	<li>Düzen menüsüne gidin ve ilk seçeneği seçin: 01 Kalibrasyon Exp. Gr.3 - Şekil 1B'de gösterildiği gibi Sıcaklık.</li>
	<li>Programın kalibrasyon düzenine yönlendirilmesini bekleyin, kırmızı çizgi 0 pmol civarında noktalara sahip standart bir düz çizgi gösterene kadar bekleyin. Ardından, kırmızı çizgi tam olarak sıfırda olduğunda, biri A odası ve diğeri B odası için (Şekil 1C) olmak üzere iki nokta seçin. NOT: Seçilen noktaların oksijen akısı (kırmızı çizgi) 0 civarında olmalıdır.<ol><li>Her iki bölmenin noktalarını işaretlemek için ekranın sağındaki O2 konsantrasyonunu seçin, işaretli noktayı seçin ve noktaya göre hem sıcaklık hem de barometrik basınç değerlerini kopyalayın. Bu değerleri aşağıdaki kutulara yapıştırın ve Şekil 2'de gösterildiği gibi ekranın sağ alt köşesindeki Kalibre Et ve Panoya Kopyala'ya tıklayın.</li>
		<li>Bu işlemi her iki oda (A ve B) için gerçekleştirin, ardından Dosya menüsüne gidin ve Kaydet ve Bağlantıyı Kes'i seçin. NOT: Kalibrasyon işleminden sonra program, kullanıcının HRR testini başlatmaya hazır olması için kullanıcıyı ana ekrana yönlendirecektir. Bu test için SUIT protokolünü kullanacağız.</li>
	</ol></li>
</ol>4. SUIT protokolü
<ol><li>Kalibrasyon tamamlandığında, tıpaları çıkarın ve hazneleri açın.</li>
	<li>Tıpaları (numuneye temas etmeyen ucu tutarak) ve hazneleri sırasıyla %100 etanol, %70 etanol ve damıtılmış su ile yıkayın. NOT: Her numune değişimi için işlemi tekrarlayın.</li>
	<li>Sinekleri 200 μL'lik tamponda homojenize edin, tüm numune içeriğini bir mikropipet kullanarak hazneye yerleştirin ve hava kabarcığı oluşturmamaya dikkat ederek tıpayı hazneye yerleştirin. NOT: Hava kabarcıkları oluşursa, durdurucuyu yavaşça çıkarın ve 100 μL MIR05 tamponu ekleyin.</li>
	<li>Düzen menüsüne tıklayın ve Şekil 05B'de gösterildiği gibi Düzeltilmiş Hacme Göre Akış seçeneğini seçin.</li>
	<li>Yeni bir pencereye yönlendirilmeyi bekleyin. Denemenin kaydedileceği klasörü seçmek için Kaydet'e tıklayın.</li>
	<li>Başka bir yeni pencerenin açılmasını bekleyin. Alandaki deneyi Deneysel Kod olarak adlandırın. Ardından, Sample (Örnek) alanında her bir numuneyi kendi odası A ve B olarak adlandırın ve Unit (Birim) alanını unit (birim) olarak ayarlayın. NOT: Diğer birimler de seçilebilir, örneğin, Milyonlarca hücre veya mg.</li>
	<li>Bu protokolün iki sinek (2 birim) kullandığını ve oda hacminin 2 mL olduğunu göz önünde bulundurarak, Konsantrasyon alanında mL başına 1 tanımlayın (Şekil 1D). NOT: Burada numune miktarı sinek sayısına göre normalleştirilmiştir; bununla birlikte, bu normalizasyon, numunenin protein içeriği, mitokondriyal DNA miktar tayini veya sitrat sentazın aktivitesi ile gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Oksijen akısı sinyali (kırmızı çizgi) pozitif değerde sabit olduğunda, substratların, inhibitörlerin ve ayrıştırıcıların titrasyonu ile HRR protokolünü başlatın (Şekil 3). Sonraki tüm reaktifler ve ekipman Tablo 1'de gösterilmektedir.<ol><li>Mitokondriyal zarı geçirgen hale getirmek için digitonin (5 μg/mL) ekleyin.</li>
		<li>Piruvat (5 mM), malat (2 mM) ve prolin (10 mM) substratları ekleyin ve oksijen akışı artıp stabilize olana kadar bekleyin. Her reaktif ilavesi için olayı işaretlemek için klavyedeki F4 tuşuna basın ve her reaktifin adını girin.</li>
		<li>Mitokondriyal solunum zincirini birleştirmek için ADP (5mM) ekleyin ve oksijen akışının artmasını ve stabilizasyonunu bekleyin.</li>
		<li>Süksinat (10 mM) ekleyin ve oksijen akısının artmasını ve stabilizasyonunu bekleyin.</li>
		<li>ATP sentazı inhibe etmek için Oligomisin (2.5 μM) ekleyin ve oksijen akışında bir azalma arayın.</li>
		<li>Kırmızı çizgi stabilize olana kadar bekleyin ve kırmızı çizginin yükselmesiyle gösterilen maksimum oksijen tüketimine ulaşılana kadar 0,25 μM titreli Karbonil-4- (triflorometoksi) fenilhidrazon siyanür (FCCP) kullanarak mitokondriyal elektron transferini ayırın. Oksijen akışının stabilizasyonundan sonra, her kompleksin inhibitörlerini birer birer eklemeye başlayın.</li>
		<li>Bir kompleks I inhibitörü olan Rotenon (0.5 μM) ekleyin. Bir sonraki inhibitörü eklemek için oksijen akısının azalmasını ve stabilizasyonunu bekleyin.</li>
		<li>Kompleks bir II inhibitörü olan Malonat (5 mM) ekleyin. Bir sonraki inhibitörü eklemek için oksijen akısının azalmasını ve stabilizasyonunu bekleyin.</li>
		<li>Son olarak, kompleks bir III inhibitörü olan Antimisin (2.5 μM) ekleyin. Düşüşü ve ardından oksijen akısının artmasını ve stabilizasyonunu bekleyin. NOT: Oksijen akısı, pozitif bir değerde, ancak mitokondriyal protein komplekslerinin son inhibisyonu değerinin altında stabilize olmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Analizin sonunda, bir mikropipet kullanarak odaların tüm içeriğini çıkarın. Gerektiğinde ileride analiz etmek için -20 °C'de saklayın.</li>
</ol>5. Veri analizi
<ol><li>Veri analizi için uygun bir istatistiksel yazılım paketi kullanır.</li>
	<li>İki grup arasındaki farklılıkları değerlendirmek için t-testleri yapın. Birden fazla tedaviyi içeren durumlar için, istatistiksel bir test olarak Varyans Analizi (ANOVA) kullanın 27.</li>
	<li>Yazılım tarafından oluşturulan grafiktenO2 akı değerlerini çıkarın. OXPHOS CI, ADP eklendikten sonraO2 akısının değerini ifade eder. OXPHOS CII, OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI'nin çıkarılmasıyla elde edilir. OXPHOS CI&CII, süksinat ilavesinden sonra ekstrakte edilenO2 akısının değeridir. ETS CI&CII, FCCP eklendikten sonrakiO2 akı değeridir. ETS CI = FCCP - Rotenon ve ETS CII = Rotenon - Malonat.</li>
	<li>ATP sentezini OXPHOS (P) ve LEAK (L) (P - L)28 arasındaki fark olarak hesaplayın.</li>
	<li>RCR = P/L.11 olmak üzere OXPHOS/LEAK oranını hesaplayarak Solunum Kontrol Oranını (RCR) belirleyin.</li>
</ol>

Meyve Sineklerinde Mitokondriyal Fizyoloji ve Biyoenerjetik Analizi

<ol><li>Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+mitochondrial+function+and+cellular+bioenergetics+in+ageing+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease.</a> Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).</li>
<li>Ramaccini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function+and+dysfunction+in+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 624216(2021).</li>
<li>Zhunina, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+dysfunction+in+vascular+disease%2C+tumorigenesis%2C+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes.</a> Front Mol Biosci. 8, 671908(2021).</li>
<li>Prasun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838(2020).</li>
<li>Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+metabolic+disorders+-+A+Step+towards+mitochondria+based+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A Step towards mitochondria based therapeutic strategies.</a> Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).</li>
<li>Perier, C., Vila, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+biology+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial biology and Parkinson's disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332(2012).</li>
<li>DeMaagd, G., Philip, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+its+management%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacy+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and its management.</a> Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).</li>
<li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-dependent+and+Parkin-independent+mitophagy+is+involved+in+reprogramming+of+glycometabolism+in+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).</li>
<li>Kopin, I. J., Markey, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPTP+toxicity%3A+implications+for+research+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MPTP toxicity: implications for research in Parkinson's disease.</a> Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).</li>
<li>Connolly, N. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+experimental+methods+to+assess+mitochondrial+dysfunction+in+cellular+models+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases.</a> Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435, 297-312 (2011).</li>
<li>Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+and+responding+to+mitochondrial+dysfunction%3A+The+UPRmt+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond.</a> Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).</li>
<li>Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+mouse+heart+tissues+using+oroboros+2k-oxygraph%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph.</a> Methods Mol Biol. 1966, Clifton, N.J. 237-246 (2019).</li>
<li>Scheiber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry+in+human+endomyocardial+biopsies+shows+reduced+ventricular+oxidative+capacity+related+to+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure.</a> Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).</li>
<li>Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+nine+-+use+of+safranin+for+the+assessment+of+mitochondrial+membrane+potential+by+high-resolution+respirometry+and+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter nine - use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry.</a> Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).</li>
<li>Demir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+use+of+Drosophila+as+an+in+vivo+model+organism+for+COVID-19-related+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Turk+J+Biol%22%5BJournal%5D)">The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review.</a> Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).</li>
<li>Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+on+the+fly%3A+a+primer+on+the+Drosophila+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li>
<li>McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+as+a+tool+to+identify+pharmacological+therapies+for+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Technol+Technologies%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome.</a> Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Bar, S., Prasad, M., Datta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+degeneration+and+locomotor+deficit+in+a+Drosophila+model+of+mucopolysaccharidosis+VII+is+attenuated+by+treatment+with+resveratrol%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol).</a> Dis Model Mech. 11 (11), (2018).</li>
<li>Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-Parkin+signaling+in+Parkinson%27s+disease%3A+Lessons+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">PINK1-Parkin signaling in Parkinson's disease: Lessons from Drosophila.</a> Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).</li>
<li>Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+PINK1+and+parkin+loss-of-function+mutants+display+a+range+of+non-motor+Parkinson%27s+disease+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson's disease phenotypes.</a> Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).</li>
<li>Biswas, S., Bagchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+structural+dynamics+of+the+mutations+in+the+kinase+domain+of+PINK1+protein+associated+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson's disease.</a> Gene. 857, 147183(2023).</li>
<li>Koh, H., Chung, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+and+Parkin+to+control+mitochondria+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling.</a> Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).</li>
<li>Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mask+loss-of-function+rescues+mitochondrial+impairment+and+muscle+degeneration+of+Drosophila+pink1+and+parkin+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants.</a> Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Drosophila+PINK1+mutants+is+complemented+by+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).</li>
<li>Dytham, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDytham%2C+C+%22Choosing+and+using+statistics%3A+a+biologist%27s+guide%22">Choosing and using statistics: a biologist's guide</a>. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. (2011).</li>
<li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+synthesis+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li>
<li>Gonçalves, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+improves+mitochondrial+function+in+PINK1B9-null+mutant+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster.</a> J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).</li>
<li>Gonçalves, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function+and+cellular+energy+maintenance+during+aging+in+a+Drosophila+melanogaster+model+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease.</a> Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).</li>
<li>Janowska, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+complex+I+dysfunction+induced+by+N-methyl+carbamate+ex+vivo+can+be+alleviated+with+a+cell-permeable+succinate+prodrug%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug.</a> Toxicol In Vitro. 65, 104794(2020).</li>
<li>Ngo, D. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+modifications+of+mitochondrial+complex+II+are+associated+with+insulin+resistance+of+visceral+fat+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity.</a> Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).</li>
<li>Stroud, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessory+subunits+are+integral+for+assembly+and+function+of+human+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I.</a> Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).</li>
<li>Senyilmaz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+morphology+and+function+by+stearoylation+of+TFR1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1.</a> Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).</li>
<li>Poddighe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucuna+pruriens+%28Velvet+bean%29+rescues+motor%2C+olfactory%2C+mitochondrial+and+synaptic+impairment+in+PINK1B9+Drosophila+melanogaster+genetic+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson's disease.</a> PloS One. 9 (10), e110802(2014).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Winer, L. S. P., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+glycolytic+and+oxidative+substrate+flux+of+cancer+cells+in+a+microplate%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate.</a> PloS One. 9 (10), e109916(2014).</li>
<li>Plitzko, B., Loesgen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxygen+consumption+rate+%28OCR%29+and+extracellular+acidification+rate+%28ECAR%29+in+culture+cells+for+assessment+of+the+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism.</a> Bio Protoc. 8 (10), e2850(2018).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+the+analysis%2C+standardization+and+interpretation+of+oxygen+consumption+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements.</a> Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).</li>
<li>Bingol, B., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitophagy%3A+PINK1%2C+Parkin%2C+USP30+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond.</a> Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.

HRR, D. melanogaster ve diğer organizmalarda mitokondriyal solunum ve enerji metabolizmasını incelemek için güçlü bir tekniktir. Mitokondriyal fonksiyonun ayrıntılı ve nicel bir değerlendirmesini sağlayarak araştırmacıların hücrelerin biyoenerjetik hakkında fikir edinmelerini sağlar. Burada sunulan protokol, mitokondriyal solunum zinciri fonksiyonunun ve spesifik mitokondriyal komplekslerin aktivitesinin değerlendirilmesini açıklar. SUIT protokolü, mitokondriyal solunumun farklı yönlerini incelemek için...

Mitokondri, apoptotik regülasyon, kalsiyum homeostazı ve biyosentetik yollara katılım dahil olmak üzere önemli işlevleri kontrol eden hücresel organellerdir. Özerk genetik materyale sahip olarak, hücresel bakım ve onarım süreçlerine katkıda bulunabilirler. Yapıları, her ikisi de hücresel enerji 1,2,3 için çok önemli olan elektron taşıma zincirini ve oksidatif fosforilasyonu barındırır. Özellikle, oksidatif fosforilasyon (OXPHOS)2 yoluyla adenozin trifosfat (ATP) üretimi yoluyla enerji kontrolü sağlanır. Mitokondriyal fonksiyonların bozulması ile enerji metabolizmasının bozulması hem hücre sağkalımında hem de ölümde meydana gelir 4,5, sıklıkla kanser gibi çok çeşitli insan patolojileri ve Parkinson Hastalığı (PD) gibi nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilidir3,6.
PH kronik, ilerleyici ve nörolojik bir hastalıktır. Bu hastalığın birincil nedeni, özellikle 6,7,8 hareketini kontrol eden nörotransmitter dopaminin üretiminden sorumlu olan substantia nigra'da beyin hücrelerinin ölümüdür. Parkinsonizmi mitokondriyal disfonksiyona bağlayan en eski gözlem, 1988'de solunum zinciri Kompleksi I9'u inhibe eden toksinler kullanılarak deneysel modellerde yapıldı.
Şu anda, mitokondriyal disfonksiyonu değerlendirmek için birkaç yöntem vardır 10,11,12,1 3; bununla birlikte, geleneksel yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, yüksek çözünürlüklü respirometri (HRR) üstün duyarlılık ve avantajlar sunar 13,14. Örneğin, HRR protokolleri, tüm mitokondriyal solunum zinciri fonksiyonunun veya spesifik mitokondriyal komplekslerinaktivitesinin değerlendirilmesine izin verir 14,15. Mitokondriyal disfonksiyonlar sağlam hücrelerde, izole mitokondrilerde ve hatta ex vivo olarak değerlendirilebilir 10,11,13,14.
Mitokondriyal disfonksiyonlar birçok patolojik ve fizyolojik süreçle yakından ilişkilidir. Bu nedenle, genetik ve deneysel olarak izlenebilir model sistemleri kullanarak mitokondriyal fizyoloji ve biyoenerjetik çalışmak önemlidir. Bu bağlamda, meyve sineği olan Drosophila melanogaster üzerine yapılan araştırmaların çeşitli avantajları vardır. Bu model, DNA'nın genetik materyal olarak kullanımı, ortak organeller ve gelişim, bağışıklık ve hücre sinyalizasyonunda yer alan korunmuş moleküler yollar dahil olmak üzere insanlarla temel hücresel özellikleri ve süreçleri paylaşır. Ek olarak, meyve sinekleri hızlı bir yaşam döngüsüne, kolay bakıma, düşük maliyete, yüksek verime ve daha az etik kaygıya sahiptir, bu nedenle karmaşık hücresel süreçleri incelemek için paha biçilmez bir araç oluşturur 16,17,18,19,20.
Ayrıca, PTEN'in neden olduğu varsayılan kinaz 1 (pembe1) geninin bir homologu D. melanogaster'de eksprese edilir. Mitofaji süreci boyunca hasarlı mitokondrinin uzaklaştırılmasında çok önemli bir rol oynar8. İnsanlarda, bu gendeki mutasyonlar, bireyleri mitokondriyal disfonksiyon ile ilişkili otozomal resesif ailesel bir PD formuna yatkın hale getirir 8,21,22,23. Sonuç olarak, meyve sineği, PH'nin patofizyolojisi ve mitokondriyal disfonksiyon ve biyoenerjetiklere odaklanan ilaç adaylarının taranması üzerine çalışmalar için güçlü bir hayvan modelidir. Bu nedenle, bu çalışma, Substrat-Birleştirici-İnhibitör-Titrasyon (SUIT) protokolü ile OROBOROS'ta HRR tekniği kullanılarak D. melanogaster'den bir PD modelinde mitokondriyal fonksiyonun nasıl analiz edileceğini açıklamaktadır.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td>Adenozin 5&asal;-difosfat sodyum sal (CAS numarası 72696-48-1); &ge; 95%; Molekül ağırlığı = 501.31 g/mol.</td></tr><tr><td>&Akut; gar</td><td>Kasv</td><td>K25-1800</td><td>Bakteriyolojik kullanım için</td></tr><tr><td>Antimisin-A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Streptomyces sp.'den Antimisin A (CAS numarası 1397-94-0); moleküler ağırlık&nbsp; 540 g/mol;</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Sığır Serum Albümini (CAS numarası 9048-46-8); pH 7,0 &; %98</td></tr> <tr><td>Datlab yazılımı</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Avusturya</td><td>20700</td><td>Veri toplama ve analizi için yazılım</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 5628</td><td>CAS numarası 11024-24-1</td></tr><tr><td>Damıtılmış su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster suşu w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3</td><td></td><td></td><td>Bloomington Drosophila stok merkezinden elde edilmiştir</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster suş&nbsp; w1118</td><td></td><td></td><td>Santa Maria Federal Üniversitesi'nden elde edilmiştir</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td>Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N', N'-tetraasetik asit (CAS numarası 13638-13-3); &ge; 97%; molekül ağırlığı =468,28 g/mol</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>Karbonil siyanür 4- (triflorometoksi)fenilhidrazon&nbsp; (CAS numarası 370-86-5); &ge; % 98 (TLC), toz&nbsp;</td></tr><tr><td>GraphPad Prism sürüm 8.0.1.</td><td></td><td></td><td>Veri toplama ve analizi için yazılım</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (CAS numarası 7365-45-9); &ge; %99,5 (titrasyon), hücre kültürü test edilmiş; Molekül ağırlığı = 238,30 g/mol</td></tr><tr><td>Yüksek çözünürlüklü respirometre Oxygraph O2K</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Avusturya</td><td>10022-02</td><td>Başlangıç O2K solunum ölçer kiti</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td>Monopotasyum fosfat (CAS numarası 7778-77-0); Reagente Plus, moleküler ağırlık = 136.09 g/mol</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>211473</td><td>Potasyum hidroksit (CAS numarası 1310-58-3); ACS reaktifi, > %85, peletler</td></tr><tr><td>Malat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td>Malonik asit (CAS numarası 141-82-2); %99, moleküler ağırlık = 104.06 g/mol). Bir çözeltinin pH'ı yaklaşık 7.0'a ayarlanır.</td></tr><tr><td>Malik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td> <td>(S) - (&eksi;)-2-Hidroksisüksinik asit (CAS numarası 97-67-6); &ge; 95% ; moleküler ağırlık = 134.09 g/mol</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>2- (N-Morfolino) etansülfonik asit (CAS numarası 4432-31-9); &ge; % 99 (titrasyon); molekül ağırlığı = 195.24 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Magnezyum klorür (CAS numarası 7786-30-3); susuz, &GE; %98, molekül ağırlığı = 95,21 g/mol</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O2K-Titrasyon Seti</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Avusturya</td><td>20820-03</td><td>Farklı hacimlerde Hamilton şırıngaları</td></tr><tr><td>Oligomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O 4876</td><td>Oligomisin&nbsp; Streptomyces diastatochromogenes (CAS numarası&nbsp; 1404-19-9); &ge; % 90 toplam oligomisin bazında (HPLC)</td></tr> <tr><td>Pistilden homojenizasyona</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td>L-Prolin (CAS numarası 147-85-3); toz; % 99; molekül ağırlığı = 115.13 g / mol</td></tr><tr><td>Pirüvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Sodyum piruvat (CAS numarası 113-24-6), &ge; 99%; moleküler ağırlık = 110.04 g/mol</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Roteton (CAS numarası 83-79-4); &ge; %95, molekül ağırlığı 394,42 g/mol</td></tr><tr><td>Süksinat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S 2378</td><td>Sodyum süksinat dibazik hekzahidrat (CAS numarası 6106-21-4); &ge; % 99</td></tr> <tr><td>Sükroz</td><td>Merck</td><td>107,651,000</td><td>Mikrobiyoloji kullanımı için sükroz (CAS numarası 57-50-1)</td></tr> <tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td>CAS numarası 107-35-7</td></tr></tbody></table>

yüksek Çözünürlüklü respirometri kullanarak bir drosophila melanogaster pink1b9-null mutantında mitokondriyal fonksiyonun analizi

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Parkinson Hastalığı (PH) dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıklar ve kanser gibi hücresel bozukluklar, mitokondriyal fonksiyonların bozulmasıyla enerji metabolizmasını bozan bozukluklardan bazılarıdır. Mitokondri, hem enerji metabolizmasını hem de hücre sağkalımı ve ölümünde yer alan hücresel süreçleri kontrol eden organellerdir. Bu nedenle, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirme yaklaşımları, patolojik ve fizyolojik süreçlerdeki hücresel durumlar hakkında önemli bilgiler sunabilir. Bu bağlamda, yüksek çözünürlüklü respirometri (HRR) protokolleri, tüm mitokondriyal solunum zinciri fonksiyonunun veya spesifik mitokondriyal komplekslerin aktivitesinin değerlendirilmesine izin verir. Ayrıca, mitokondriyal fizyoloji ve biyoenerjetik çalışmak, Drosophila melanogaster gibi genetik ve deneysel olarak izlenebilir modeller gerektirir.
Bu model, insan fizyolojisine benzerliği, hızlı yaşam döngüsü, kolay bakımı, maliyet etkinliği, yüksek verim yetenekleri ve en aza indirilmiş sayıda etik kaygı gibi çeşitli avantajlar sunar. Bu özellikler toplu olarak onu karmaşık hücresel süreçleri incelemek için paha biçilmez bir araç olarak kurar. Bu çalışma, Drosophila melanogaster PINK1B9-null mutantı kullanılarak mitokondriyal fonksiyonun nasıl analiz edileceğini açıklamaktadır. Pink1 geni, işlevsiz mitokondrinin mitokondriyal ağdan çıkarılması için çok önemli olan mitofaji olarak tanınan bir süreç yoluyla PTEN'in neden olduğu varsayılan kinaz 1'i kodlamaktan sorumludur. Bu gendeki mutasyonlar, otozomal resesif erken başlangıçlı ailesel PH formu ile ilişkilendirilmiştir. Bu model, PH'nin patofizyolojisinde yer alan mitokondriyal disfonksiyonu incelemek için kullanılabilir.

Burada, OXPHOS CI (P = 0.0341) ve OXPHOS CI&amp;II (P = 0.0392) durumlarındakiO2 akısının, kontrol sineklerine göre PINK1B9 boş sineklerinde azaldığını düşünüyoruz (Şekil 4). Bu sonuçgrubumuzun önceki bulgularında da gözlenmiştir 29,30.
CI ve CII, elektronların NADH'den ubikinona transferinden CI'nin sorumlu olduğu, CII'nin elektronları süksinattan ubikinona ...

Burada, PINK1B9-null mutant meyve sineklerinde biyoenerjetik analiz etmek için yüksek çözünürlüklü bir respirometri protokolü sunuyoruz. Yöntem, Substrat-Bağlayıcı-İnhibitör-Titrasyon (SUIT) protokolünü kullanır.

Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanarak Bir Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutantında Mitokondriyal Fonksiyonun Analizi

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...

Araştırmamız, hastalık ve kimyasal toksisitede mitokondriyal fonksiyonu anlamak için deneysel bir model olarak Drosophila melanogaster'i kullanmaktadır. Cevaplamak istediğimiz bazı sorular, PINK-1 mutasyonunun mitokondriyal fonksiyonu nasıl etkilediği ve bunun Parkinson Hastalığı ile nasıl bağlantılı olduğudur. Bu mutasyonla ilişkili mitokondriyal işlev bozukluğunu nasıl tersine çevirebilir veya önleyebiliriz?Yüksek çözünürlüklü respirometri, hassas çalışma ve veri analizi için özel eğitim gerektirir. Ek olarak, kullandığımız sistem aynı anda birkaç örnekle çalışmaya izin vermiyor ve yüksek verimli analizler için eğitilmemiş. Aynı anda yalnızca iki örnek çalıştırmak mümkün olduğundan, deneysel tasarım iyi tanımlanmalıdır.Bulgularımız, OXPHOS CI bağlantısında ve ETS CI&CII bağlantısında azalma ve ATP üretiminde oksidatiften glikolitiğe metabolik bir kayma ile karakterize edilen PINK1-Null mutantlarında karşılaştığımız mitokondriyal fonksiyonun ilerleyici bozulmasını göstermektedir. Bu bulgular Parkinson Hastalığı patofizyolojisi ile yakından ilişkilidir. Yüksek çözünürlüklü respirometrinin kilit noktalarından biri, mitokondriyal fonksiyonun ve hücresel metabolizmanın ayrıntılı analizine olanak tanıyarak oksijen tüketiminin doğrudan ve doğru ölçümlerini sağlama yeteneğidir.Ayrıca, çok yönlüdür. İzole mitokondri dahil olmak üzere çok çeşitli numune türleri için kullanılabilir. Mitokondriyal disfonksiyonun Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların ortak bir özelliği olduğu göz önüne alındığında, gelecekte mitokondriyal fonksiyon ve enerji yükselmesinin nörodejeneratif hastalıklara yönelik tedaviler için nasıl önemli hedefler olabileceğini araştırmaya odaklanacağız.

analyzing-mitochondrial-function-drosophila-melanogaster-pink1b9-null

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Mitokondri, metabolizma ve homeostazın düzenlenmesinde merkezi rol oynar. Organizma fizyolojisini etkileyen mitokondriyal metabolizmadaki ince değişikliklerin tüm organizma metabolomik çalışmalarında tespit edilmesi zor olabilir. Burada, Drosophila melanogaster'deki ince metabolik değişimlerin tespitini geliştiren bir izolasyon yöntemini açıklıyoruz.

Metabolik Analiz Mitokondriyal Zenginleştirilmiş Kesirler Hazırlanması<em&gt; Drosophila</em

Mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisinin analizi, mitokondriyal işlevselliğin düzenleyici mekanizmalarının tam olarak anlaşılması için gereklidir. Canlı ve sabit Drosophila yumurtalıklarında mitokondriyal yapı ve fonksiyonu incelemek için özel yöntemler bu yazıda açıklanmış ve gösterilmiştir.

Mitokondriyal Yapısı ve İşlevi incelenmesi Drosophila Yumurtalıklar

Bu yazıda, oksijen tüketimi yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri Drosophila permeabilized thoraxes içinde kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu teknik doku klasik mitokondrial yalıtım tekniği için karşılaştırıldığında çok az bir miktar gerektirir ve elde edilen sonuçlar daha fizyolojik ilgilidir.

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

Biz oksijen tüketimi ve Drosophila melanogaster larva ve yetişkin Beynindeki hücre dışı asitleştirme ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bir metabolik analyzer adapte ve en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı ile kullanılmaktadır. Mikro-doku bağlar bu protokolü kritik bileşenidir ve tasarlanmış ve bunların kullanımı bu analizi için özel olarak yaratılmıştır.

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

Drosophila doku homojenlerinde bozulmamış mitokondriyal kütlenin nicelleştirilmesi için sitrat sintaz aktivitesinin kolorimetrik testi için bir protokol sönmesin.

Drosophila Melanogaster'de Sitrat Synthase Aktivitesinin Kolorimetrik Tsöplini

Kulometrik respirometri, küçük organizmaların metabolik hızını ölçmek için idealdir. Bu çalışmada Drosophila melanogaster için uyarlandığında, ölçülenO2 tüketimi, önceki çalışmalarda vahşi tip D. melanogaster için bildirilen aralık içindeydi. Daha küçük ve daha az aktif olan CASK mutantları tarafından sinek başınaO2 tüketimi, vahşi tipten önemli ölçüde daha düşüktü.

Kulometrik Mikrorespirometri Kullanılarak Drosophila melanogaster'de O2 Tüketiminin Ölçülmesi

Bu makale, lipid-proksimal bir ortamda çeşitli partner faktörlerle in vitro olarak integral membran proteinlerinin etkileşimlerini ve montajlarını değerlendirmek için bir yöntemi açıklamaktadır.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için İn Vitro

Bu makale SPHIRE yazılım paketini kullanarak cryo-EM görüntüleri işlemek için bir protokol sunmaktadır. Mevcut protokol, neredeyse atomik çözünürlüğü hedefleyen hemen hemen tüm tek parçacılı EM projeleri için uygulanabilir.

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

Bu protokol, fonksiyonel mitokondriyal elektron transport zincir komplekslerinin (Cx) IV ve bunların süper komplekslerinin yerli elektroforezi kullanarak, bunların montajı ve yapısı hakkında bilgi vermek üzere ayrılmasını açıklamaktadır. Nativ jel immünoblotlama, in-jel deneylerine tabi tutulabilir ve bireysel kompleksleri daha da karakterize etmek için elektroliz ile saflaştırılabilir.

Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi

Burada, iki protokol mitokondrial Ca2 + akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri ölçümü için mevcut. İzole mitokondri için biz bir plaka okuyucu tabanlı Ca2 + alma detaylı tahlil Ca2 + hassas kullanarak boya kalsiyum yeşil-5N. Kültürlü hücreler için Ca2 + boya Rhod-2/AM kullanarak bir confocal mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır.

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Keşfedin yüksek çözünürlüklü respirometri yöntemiyle Drosophila melanogaster PINK1 B9-null mutantında mitokondriyal fonksiyon analizini. Parkinson hastalığı ve biyoenerejik araştırmalar için değerli bir protokoldür.

Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanarak Bir Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutantında Mitokondriyal Fonksiyonun Analizi (Video) | JoVE Journal

Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanarak Bir Drosophila melanogaster PINK1^B9-Null Mutantında Mitokondriyal Fonksiyonun Analizi

Daha fazla video keşfet