Name: İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Süspansiyonda Böbrek Organoidlerinin Üretilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Öğrenin, süspansiyon kültüründe iPS hücrelerinden böbrek organoidleri üretme yöntemini. Başlangıç hücre yoğunluğu ve WNT agonist konsantrasyonu organoid gelişimini etkiler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Geçmişteki ve günümüzdeki tüm Mao ve Hu Lab üyelerine, ilginç tartışmalar ve projeye büyük katkıları için son derece minnettarız. Ulusal Çocuk Sağlığı Klinik Araştırma Merkezi'ne büyük desteği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Jianhua Mao'ya U20A20351, Lidan Hu'ya 82200784), Çin'in Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (No. LQ22C070004 Lidan Hu'ya) ve Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. BK20210150 Gang Wang'a).

Bu çalışma için kullanılan iPSC'ler ticari bir kaynaktan elde edilmiştir. Hücreler, ticari olarak temin edilebilen bazal membran matris kaplı plakalar üzerinde mTeSR ortamı ile muhafaza edildi (bkz. Malzeme Tablosu). Tablo 1 , çalışmada kullanılan tüm ortam bileşimlerini içermektedir.
1. Farklılaşma ve posterior ilkel çizgiyi (PS) indüklemek için iPSC'lerin kaplanması
<ol><li>Membran matris kaplı 6 oyuklu plaka üzerindeki iPSC'leri 2 mL DPBS ile yıkayın. DPBS'yi bir pipet kullanarak aspire edin.</li>
	<li>iPSC'leri ayırmak için piyasada bulunan hücre ayırma solüsyonundan 1 mL ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 37 °C'de 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>iPSC'lere 1 mL mTeSR ekleyin ve hücrelerin plastik yüzeyden kalktığından emin olun.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 3 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Hücre peletini yeniden süspanse edin ve bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın.</li>
	<li>Membran matrisi ile kaplanmış 24 oyuklu veya 6 oyuklu bir plakaya bir dizi hücre yoğunluğu tohumlayın ve 10 μM Rho kinaz inhibitörü (Y-27632) ile takviye edilmiş mTeSR ile kültür edin (bkz. Onları gece boyunca 37 ° C'lik bir CO2 inkübatörde kültürleyin. NOT: PS'yi indüklemek için, optimal CHIR99021 konsantrasyonu ve uygun hücre yoğunlukları farklı iPSC hatlarından farklılık gösterir. Bir dizi yoğunluk (örneğin, santimetre kare başına 0.6, 0.9, 1.2, 1.5, 1.8, 2.4 * 103 tek hücre) ve 7 μM-12 μM arasında CHIR99021 bir konsantrasyon aralığı tohumlayın. Her yoğunluğun ve her CHIR'nin farklılaşmasını aynı gün başlatın. 24 oyuklu bir plakada optimum CHIR99021 konsantrasyonunu ve uygun hücre yoğunluklarını bulun ve ardından kültürü 6 oyuklu plakalarda genişletin. Burada 6 oyuklu bir plakaya dayalı bir protokol sunuyoruz.</li>
	<li>Ertesi gün, mTeSR'yi aspire edin ve hücreleri 2 mL DPBS ile yıkayın.</li>
	<li>2 mL evre I ortamı (8-12 μM CHIR99021 içeren kök hücre farklılaşma ortamı) ekleyin (Tablo 1), Gün 0 olarak bakın.</li>
	<li>Onları 4 gün boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörde kültürleyin, her iki günde bir I. aşama ortamını yenileyin.</li>
</ol>2. Nefrojenik ara mezodermin (IM) indüklenmesi
<ol><li>4. Günde, aşama I ortamını çıkarın ve 2 mL DPBS ile yıkayın.</li>
	<li>Hücrelere 2 mL evre II besiyeri ekleyin (200 ng/mL FGF9, 1 μg/mL Heparin ve 1 μM CHIR99021 içeren kök hücre farklılaşma ortamı) (Tablo 1).</li>
	<li>Bunları 37 °C'lik bir inkübatörde kültürleyin ve 7. güne kadar her 2 günde bir besiyerini yenileyin.</li>
</ol>3. Süspansiyon kültüründe böbrek organoidlerinin üretilmesi
NOT: 0. günden 7. güne kadar olan gözlem süresi boyunca hücrelerin durumu kritiktir. Hücreler başarılı bir genişleme sergiler ve önemli hücre kalıntıları olmadan yığılırsa, bir sonraki aşamaya geçmeye hazır olduğunu gösteren ara mezodermin (IM) başarılı bir şekilde türetildiğini gösterir. Bununla birlikte, hücreler ilk apoptoz belirtileri gösteriyorsa, ardından nekroz veya kırılma gösteriyorsa, uygun olmayan konsantrasyonlarda CHIR99021 veya hücre yoğunluğunun göstergesi olabilir.
<ol><li>7. Günde, evre II ortamını çıkarın ve hücreleri 2 mL DPBS ile yıkayın.</li>
	<li>Her oyuğa 1 mL hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve hücreler faz kontrastı altında kırılana kadar 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Hücrelere 1 mL aşama II ortamı pipetleyin, karıştırın ve hücrelerin yüzeyden kalktığından emin olun.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 2 mL aşama III ortamında (200 ng/mL FGF9, 1 μg/mL Heparin ve 1 μM CHIR99021 içeren kök hücre farklılaşma ortamı% 0.1 Metilselüloz (MC),% 0.1 Polivinilalkol (PVA)) içeren 10 μM Rho kinaz inhibitörü (Y-27632) ile desteklenmiştir (bkz. Yavaşça karıştırın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu ve tohumu 1:3 oranında 6 oyuklu düşük yapışma plakasına karıştırın. Plakayı 37 °C ve %5CO2'de bir inkübatörde bir orbital çalkalayıcıya (CO2 dirençli, 60 rpm'de dönen) koyun.</li>
	<li>24 saat sonra, Rho kinaz inhibitörünü (Y-27632) çıkarın ve aşama III ortamı ekleyin (200 ng / mL FGF9, 1 μg / mL Heparin, 1 μM CHIR99021,% 0.1 MC,% 0.1 PVA ile kök hücre farklılaşma ortamı takviyesi). 2 gün boyunca kültür. Aşağıdaki adımları izleyerek süspansiyon kültüründeki ortamı değiştirin:<ol><li>1 mL'lik pipetin ucunu aseptik makasla kesin.</li>
		<li>Organoidleri plakanın ortasına yerleştirmek için 6 oyuklu plakayı hafifçe sallayın.</li>
		<li>Organoidleri hazırlanan pipetlerle 15 mL'lik bir tüpe aspire edin ve 5 dakika bekletin.</li>
		<li>Süpernatanı aspire edin ve organoidleri tüpün dibinde bırakın.</li>
		<li>Organoidleri yeniden süspanse etmek için taze ortamı ekleyin ve 6 oyuklu düşük yapışma plakasına geri koyun.</li>
	</ol></li>
	<li>Düşük yapışma plakasını inkübatörde 60 rpm'de sallamaya devam edin. Aşama III ortamını 12. güne kadar her iki günde bir değiştirin.</li>
	<li>12. Günde, ortamı aşama IV ortamına değiştirin (% 0.1 MC ve% 0.1 PVA içeren kök hücre farklılaşma ortamı).</li>
	<li>Ortamı 25. güne kadar iki günde bir değiştirin. Organoidler, 12-25. günler arasında yavaş yavaş olgun nefron yapılarına dönüşebilir.</li>
</ol>4. Böbrek organoidlerinin immünofloresan boyaması
<ol><li>Böbrek organoidlerini 15 mL'lik bir tüpe toplayın ve 2 mL PBS ile yıkayın.</li>
	<li>5-10 dakika bekledikten sonra, böbrek organoidlerini taze hazırlanmış% 2 PFA'da 20 ° C'de 4 dakika sabitleyin.</li>
	<li>PFA'yı çıkarın ve organoidleri %0,3 Triton X-100 (%0,3 PBST) içeren 1 mL PBS ile yıkayın, 8 dakika boyunca bir çalkalayıcı (60 rpm'yi geçmeyen bir dönüş hızıyla) üzerinde eşit şekilde çalkalayın, 5 dakika bekletin ve ardından süpernatanı çıkarın. Üç kez tekrarlayın. NOT: Organoidler, 2-4 hafta boyunca 4 ° C'de% 0.3 PBST'de saklanabilir.</li>
	<li>Sabit organoidleri PBST'de (bloke edici tampon) %10 eşek serumu ile (Malzeme Tablosuna bakınız) gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>Birincil antikorları ( Malzeme Tablosunda listelenmiştir) 1:300 oranında bir bloke edici tampon içinde seyreltin.</li>
	<li>Organoidleri gece boyunca 4 ° C'de ajitasyon ile birincil antikorlarla inkübe edin. NOT: Glomerüllerin ve tübüllerin bir organoid üzerinde aynı anda boyanabildiğinden emin olun.</li>
	<li>Organoidleri 1 mL% 0.3 PBST ile yıkayın, bir çalkalayıcı üzerinde (dönüş hızı 60 rpm'yi geçmeyen bir devir ile) 8 dakika boyunca eşit şekilde çalkalayın, 5 dakika bekletin ve ardından süpernatanı çıkarın. Üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>Organoidleri ikincil antikorlar ( Malzeme Tablosunda listelenmiştir) ve DAPI ile gece boyunca 4 ° C'de çalkalama ile inkübe edin. Ardından 4.7 adımını tekrarlayın. NOT: Hem ikincil antikor hem de DAPI, bloke edici çözelti, ikincil antikor (1:400) ve DAPI (1:1000) içinde seyreltilir.</li>
	<li>Boyamadan sonra, organoidleri metanol ile (her biri 5 dakika boyunca %25, %50, %75 ve %100) dehidre edin, ardından benzil alkol ve benzil benzoat (BABB, 1:2 oranı) ile süzün.</li>
	<li>Temizlenmiş organoidleri cam tabanlı bir tabak üzerine koyun (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları konfokal mikroskopi ile inceleyin. NOT: Görüntüleme yaparken, cam kabın altındaki Petri kabını seçin ve süzüntü verirken, kabın altını nemli tutmak için BABB'ı doğrudan Petri kabına koyun.</li>
</ol>5. İn vitro dekstran alım testi
<ol><li>25. Günde, organoidleri 100 μg / mL floresan etiketli dekstran ile inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız) 4 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de bir inkübatörde.</li>
	<li>4 saat sonra, yeni bir ortama geçin ve geniş alanlı bir floresan mikroskobu kullanarak canlı hücre kültürü görüntülerini yakalayın.</li>
</ol>

Böbrek organoid üretimi için indüklenmiş pluripotent kök hücre süspansiyonunun kullanılması

<ol><li>Tekguc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids%3A+a+pioneering+model+for+kidney+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases.</a> Translational Research. 250, 1-17 (2022).</li>
<li>Hill, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+chronic+kidney+disease+-+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis.</a> PLOS ONE. 11 (7), 0158765(2016).</li>
<li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+potential+in+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).</li>
<li>Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li>
<li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6 (1), 8715(2015).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osr1+expression+demarcates+a+multi-potent+population+of+intermediate+mesoderm+that+undergoes+progressive+restriction+to+an+Osr1-dependent+nephron+progenitor+compartment+within+the+mammalian+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney.</a> Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).</li>
<li>SaxOn, L., Sariola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+organogenesis+of+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Early organogenesis of the kidney.</a> Pediatric Nephrology. 1, 385-392 (1987).</li>
<li>Kobayashi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six2+defines+and+regulates+a+multipotent+self-renewing+nephron+progenitor+population+throughout+mammalian+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development.</a> Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).</li>
<li>Boyle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+using+Cited1-CreERT2+mice+demonstrates+that+the+cap+mesenchyme+contains+self-renewing+progenitor+cells+and+gives+rise+exclusively+to+nephronic+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia.</a> Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).</li>
<li>Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+kidney+organoids%3A+progress+and+remaining+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Human kidney organoids: progress and remaining challenges.</a> Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).</li>
<li>Kumar, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+micro-organoids+in+suspension+culture+as+a+scalable+source+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells.</a> Development. 146 (5), 172361(2019).</li>
<li>Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar potansiyel bir çıkar çatışması bildirmediler.

Bazal ortamda, başlangıç hücre yoğunluğunda ve CHIR99021 konsantrasyonunda küçük değişiklikler içeren iPSC'lerden böbrek organoidleri üretmek için ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır. Çeşitli deneylerde, başarılı böbrek organoid üretimi için kritik faktörlerin, 7. günde ara mezodermin (IM) ve hücre durumunun ilk farklılaşması olduğu bulunmuştur. Ayrıca, farklı iPSC hatları, hücre proliferasyonu ve farklılaşma potansiyelinde farklılıklar sergiledi, bu da değişen optimal hücre yoğunlukları ve CHIR99021 konsantrasyonları<...

Böbrek, fonksiyonel birimine bağlı olarak fizyolojik homeostazın korunmasında kritik bir rol oynar. Atık ürünleri salgılayan nefronlar, vücut sıvılarının bileşimini düzenleyebilir. Kalıtsal mutasyonların veya diğer yüksek risk faktörlerinin neden olduğu kronik böbrek hastalığı (KBH), sonunda son dönem böbrek hastalığına (SDBH) ilerleyecektir1,2. ESKD, görünüşe göre nefronların sınırlı rejenerasyon kapasitesinden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, renal replasman tedavisi gereklidir. İnsan iPSC'lerinin yönlendirilmiş farklılaşması, böbrek gelişimini incelemek, hastaya özgü hastalıkları modellemek ve nefrotoksik ilaç taraması yapmak için kullanılabilen hastaya özgü 3D böbrek organoidlerinin in vitro olarak üretilmesini sağlar 3,4.
Embriyonik gelişim sırasında böbrekler, ilkel çizgiden (PS) farklılaşan ara mezodermden (IM) kaynaklanır. Klasik WNT sinyal yolu, FGF (FGF9, FGF20) ve BMP'nin (JNK aracılığıyla Bmp7 sinyali) koordineli katılımı ile IM'nin ek farklılaşmasına neden olabilir5,6,7. Nefrik progenitör hücrelerin (NPC) iki önemli hücre popülasyonunu üretirler: üreter tomurcuğu (UB) ve metanefrik mezenşim (MM), sırasıyla toplama kanallarını ve nefronu oluşturur 8,9. Her nefron, proksimal ve distal tübüller gibi glomerüler ve tübüler segmentlerden ve Henle10,11 döngüsünden oluşur. Yukarıda bahsedilen teoriye göre, şu anda yayınlanmış protokoller, böbrek organoidlerini indüklemek için sinyal kaskadlarını ve büyüme faktörü stimülasyonunu taklit eder 5,12.
Son birkaç yılda, insan iPSC'lerini böbrek organoidlerineayırmak için birçok protokol geliştirilmiştir 5,6,7,12. Takasato ve ark.7, FGF9 ile değiştirilmeden önce CHIR (WNT agonisti) tedavisinin süresini optimize etti. Protokollerine göre, 4 gün boyunca CHIR maruziyeti, ardından 3 gün boyunca FGF9, iPSC'lerden IM'yi indüklemenin en etkili yoludur. Transwell filtreleri, prosedürlerinde kültür formatı olarak kullanıldı; Ancak, bu yöntem yeni başlayanlar için zordur. Bu nedenle, Kumar ve ark.13 kültür formatını değiştirmeye çalıştı ve kültürü askıya almayı seçti. Yapışık hücreleri, nefron benzeri yapılar içeren embriyoid cisimlere (EB'ler) bir araya gelmelerine yardımcı olmak için düşük yapışkan plakalarda tohumlama için 7. günde ayırdılar. Bununla birlikte, bu yöntemlerin toplu etkisi, özellikle farklı iPSC'lerde belirgindi. Ek olarak, farklı literatürde CHIR konsantrasyonunun 7 μM ile 12 μM arasında değiştiği bildirilmiştir 5,13,14.
Hücre yoğunluğu ve CHIR konsantrasyonunun farklı iPSC'lerde organoid oluşumunu etkileyebileceğini tahmin ettik ve bu, deneylerimizde defalarca doğrulandı. Mevcut protokol, Kumar ve ark.13'ün çalışma yöntemini biraz değiştirmiş ve kullanıcılara adım adım bir prosedür sağlamıştır. Yaklaşımın programı ve şeması Şekil 1'de gösterilmektedir.

<table><tbody><tr><td>96 Kuyulu Hücre Kültürü Plakası, Düz Tabanlı</td><td>NEST</td><td>Cat #701003</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>Cat #07920</td><td></td></tr><tr><td>Antikorlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzil alkol</td><td>Sigma-Aldrich Cat</td><td>#100-51-6</td><td></td></tr><tr><td>Benzil benzoat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat #120-51-4</td><td></td></tr><tr><td>Biyolojik Güvenlik Kabini</td><td>Haier</td><td>Cat #HR40  <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/65698/65698eq01.jpg" style="margin: auto; ">  A2</td><td></td></tr><tr><td>Biotin anti-insan LTL (1:300)</td><td>Vector Laboratories</td><td>Cat #B-1325</td><td></td></tr><tr><td>Kan mononükleer hücreleri hiPS-B1 (iPSc, dişi)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Karbondioksit seviye çalkalayıcı</td><td>HAMANY</td><td>Cat #C0-06UC6</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasallar, peptitler ve rekombinant proteinler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021 (Wnt yolu aktivatörü)</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojiler</td><td>Kedi #72054</td><td></td></tr><tr><td>Costar Çoklu 6 Kuyulu Hücre Kültürü Plakası</td><td>Corning</td><td>Cat #3516</td><td></td></tr><tr><td>Costar Ultra Düşük Ataşman 6 Kuyulu Plaka</td><td>Corning</td><td>Cat #3471</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>Kedi #07930</td><td></td></tr><tr><td>DAPI leke Çözümü</td><td>Coolaber</td><td>Cat #SL7102</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, Alexa Fluor 647</td><td>Termo BİLİMSEL Kedi</td><td>#D22914</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 HEPES içermeyen</td><td>Servicebio</td><td>Kedi #G4610</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti-Koyun IgG H&amp; L (Alexa Fluor 647)</td><td>Abcam</td><td>Cat #ab150179</td><td></td></tr><tr><td>Eşek serumu stoste</td><td>Meilunbio</td><td>Cat #MB4516-1</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (kalsiyum, magnezyum, fenol kırmızısı olmadan)</td><td>Solarbio Life Science</td><td>Cat #D1040</td><td></td></tr><tr><td>Kuru Banyo Kuluçka Makinesi</td><td>Shanghai Jingxin</td><td>Cat #JX-10</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488-Keçi Anti-Fare IgG (1:400)</td><td>Earthox</td><td>Cat #E032210</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488-Keçi Anti-Tavşan IgG (1:400)</td><td>Earthox</td><td>Cat #E032220</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 549-Keçi Anti-Fare IgG (1:400)</td><td>Earthox</td><td>Cat #E032310</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 549-Keçi Anti-Tavşan IgG (1:400)</td><td>Earthox</td><td>Cat #E032320</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 649-Keçi Anti-Tavşan IgG (1:400)</td><td>Earthox</td><td>Cat #E032620</td><td></td></tr><tr><td>Deneysel modeller: Hücre Hatları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2 İnkübatör</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>Cat #370</td><td></td></tr><tr><td>Geltre LDEV-Free</td><td>Gibco</td><td>Cat #A1413202</td><td></td></tr><tr><td>Cam Tabanlı Kültür Yemekleri</td><td>NEST</td><td>Cat #801002</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-insan CUBN (1:300)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Cat #sc-20607</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Solüsyonu (Hücre kültürü takviyesi)</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>Cat #07980</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Rekombinant FGF-9</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>Cat #78161</td><td></td></tr><tr><td>Ters Mikroskop</td><td>OLYMPUS</td><td>Cat #CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Lazer Taramalı Konfokal Mikroskop</td><td>OLYMPUS</td><td>Cat #FV3000</td><td></td></tr><tr><td>Metil selüloz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat #M7027</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Santrifüj</td><td>HENGNUO</td><td>Cat #2-4B</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-insan CD31 (1:300)</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat #555444</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-insan ECAD (1:300)</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat #610182</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-insan Integrin beta 1 (1:300)</td><td>Abcam</td><td>Cat #ab30394</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-insan MEIS 1/2/3 (1:300)</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>Cat #39795</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88 ( Polivinilalkol 4-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat #81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 5X Supplement</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>Cat #85852</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 Bazal Orta</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>Cat #85851</td><td></td></tr><tr><td>Nunc CryoTube Şişeleri</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>Cat #377267</td><td></td></tr><tr><td>Diğerleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-insan GATA3 (1:300)</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>Kedi #5852S</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-insan LRP2 (1:300)</td><td>Sapphire Bioscience</td><td>Cat #NBP2-39033</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-insan Synaptopodin (1:300)</td><td>Abcam</td><td>Cat #ab224491</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-insan WT1 (1:300)</td><td>Abcam</td><td>Cat #ab89901</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300)</td><td>Abcam</td><td>Cat #ab32570</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan Serum Albümini (rHSA)</td><td>YEASEN</td><td>Kedi #20901ES03</td><td></td></tr><tr><td>Koyun anti-insan NPHS1 (1:300)</td><td>R&amp; D Sistemleri</td><td>Cat #AF4269</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2 Orta</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>Kedi #05275</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Cy3 (1:400)</td><td>Gene Tex Cat</td><td>#GTX85902</td><td></td></tr><tr><td>Versene (1X)</td><td>Gibco</td><td>Cat #15040066</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Dihidroklorür)</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>Kedi #72304</td><td></td></tr></tbody></table>

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden süspansiyonda böbrek organoidlerinin Üretilmesi

Generating Kidney Organoids in Suspension from Induced Pluripotent Stem Cells

Böbrek organoidleri, çeşitli yaklaşımlarla indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) üretilebilir. Bu organoidler, hastalık modellemesi, ilaç taraması ve potansiyel terapötik uygulamalar için büyük umut vaat ediyor. Bu makale, posterior primitif çizgiden (PS) başlayarak orta mezoderme (IM) kadar iPSC'lerden böbrek organoidleri oluşturmak için adım adım bir prosedür sunmaktadır. Yaklaşım, tanımlanmış, hayvansal bileşen içermeyen bir ortam olan APEL 2 ortamına dayanır. 4 gün boyunca yüksek konsantrasyonda WNT agonisti (CHIR99021), ardından fibroblast büyüme faktörü 9 (FGF9) / heparin ve 3 gün boyunca düşük konsantrasyonda CHIR99021 ile desteklenir. Bu işlem sırasında, iPSC'lerin başlangıcında optimal hücre yoğunluğunun ve CHIR99021 konsantrasyonunun seçilmesine önem verilir, çünkü bu faktörler başarılı böbrek organoid üretimi için kritik öneme sahiptir. Bu protokolün önemli bir yönü, IM'nin yavaş yavaş glomerüler, proksimal tübüler ve distal tübüler yapıları kapsayan nefron yapılarına dönüşmesine izin veren düşük yapışık bir plakadaki süspansiyon kültürüdür ve tümü görsel olarak anlaşılabilir bir formatta sunulur. Genel olarak, bu ayrıntılı protokol, çeşitli iPSC'lerden böbrek organoidleri üretmek için verimli ve spesifik bir teknik sunarak başarılı ve tutarlı sonuçlar sağlar.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65698...

Bu protokol, süspansiyon kültürü koşulları kullanılarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) böbrek organoidleri üretmek için kapsamlı ve etkili bir yöntem sunar. Bu çalışmanın birincil vurgusu, başlangıç hücre yoğunluğunun ve WNT agonist konsantrasyonunun belirlenmesinde yatmaktadır, böylece böbrek organoid araştırmalarıyla ilgilenen araştırmacılara fayda sağlamaktadır.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Süspansiyonda Böbrek Organoidlerinin Üretilmesi

Kidney organoids can be generated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) through various approaches. These organoids hold great promise for disease ...

Araştırmamız, süspansiyon kültürü koşullarını kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden böbrek organoidleri üretmek için kapsamlı ve etkili bir yöntem sunmaktadır. Yeni organoid araştırmacıları eğitecek olan indükleme aşamasında başlangıç hücre yoğunluğunun ve WNT agonist konsantrasyonunun önemini vurguluyoruz. Şu anda, iPSC'ler için tek bir yüksek yoğunluklu hücre hattı elde etmek zordur.Toplu etki, özellikle çeşitli iPSC hatlarında fark edildi. Her partinin böbrek organoidleri, farklı bir form ve boyuta sahip olabilir. Bir iPSC hattı için en iyi başlangıç hücre yoğunluğunu ve CHIR konsantrasyonunu elde etmek için birkaç deneme gereklidir.Başarılı böbrek organoid oluşumu için ara yöntemin ilk farklılaşmasının önemli olduğunu belirledik. Protokolümüz, işlem sırasında optimal hücre yoğunluklarının ve CHIR konsantrasyonlarının nasıl seçileceğini ayrıntılı olarak açıklamaktadır, çünkü farklı iPSC hatları hücre proliferasyonu ve farklılaşma yeteneğinde farklılıklar göstermiştir. Araştırmacılar, iPSC'lerinden spesifik böbrek organoidlerini hızlı bir şekilde üretebilirler.Protokolümüze göre, hücre yoğunluğunu ve CHIR konsantrasyonunu ayarlayarak, tüm araştırmacılarımızın böbrek

generating-kidney-organoids-suspension-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, tanımlanmış kimyasal koşullar altında hücre farklılaşması yoluyla indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden insan böbrek podositlerini türetme protokolünü açıklıyoruz. Üretilen podositler, nefrotoksisite testi ve hastalık modellemesi için kullanılabilir.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Böbrek Podositlerinin Türetilmesi: Olgun Böbrek Podositlerinin Kök Hücrelerden Yönlendirilmiş Farklılaşması İçin Bir Prosedür

Bu video, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) serebral organoidler üretmek için bir testi göstermektedir. İnsan iPSC'leri embriyoid cisimler (EB'ler) oluşturmak için indüklenir. EB'ler, bir indüksiyon ortamı kullanılarak bir polimer iskele üzerinde kültürlenir ve nöral kök hücrelere, progenitör hücrelere ve olgunlaşmamış nöronlara farklılaşmayı teşvik eder. Son olarak, EB'ler bir matrise gömülür ve serebral organoid oluşumu için bir bakım ortamına aktarılır.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Serebral Organoidlerin Üretilmesi

Bu çalışma, organ gelişimini incelemek için iki yöntem, kültürlü embriyonik organ ve organoidlerin vaskülarizasyonuna olanak sağlayan kuş embriyolarından koryoallantoik membran (CAM) üzerine geliştirilmiş bir ksinotransplantasyon kurulumu ve yeni bir sabit z-yönü yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı konfokal görüntüleme sağlayan modifiye deneysel koşulları ile organ kültürü yöntemi.

Vaskülarizasyon, Uzatılmış Gelişim ve Geliştirilmiş Mikroskopi Görüntüleme için Renal Organoid ve Organotipik Kültürün Optimizasyonu

İnsan böbrek tübuloid kültürleri, böbrek fizyolojisi ve hastalığını incelemek için değerli bir in vitro modeli temsil eder. Tübuloidler böbrek dokusundan (sağlıklı ve hastalıklı) ve idrardan da kurulabilir, ikincisi kolayca elde edilebilir ve daha az invaziv bir araştırma malzemesi kaynağını temsil eder.

Doku ve İdrardan İnsan Böbrek Tubuloidlerinin Üretimi

Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) böbrek organoidleri üretmek için bir protokol tarif ediyoruz. Bu protokol iki hafta içinde böbrek organoidleri üretir. Elde edilen böbrek organoidleri, paralel ilaç testi yaklaşımları için büyük ölçekli iplikçi şişelerinde veya çok kuyulu manyetik karıştırma plakalarında kültürlenebilir.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Böbrek Organoidleri Üretmek için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden farklılaşan genetik olarak eşleşen epitel ve vasküler endotel hücrelerini entegre ederek böbrek glomerüler filtrasyon bariyerinin yapısını ve işlevini özetleyen kişiselleştirilmiş bir çip üzerinde organ sistemi tasarlamak için bir protokol sunulmaktadır. Bu biyomühendislik sistemi, böbrek hassas tıbbını ve ilgili uygulamaları ilerletebilir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Üretilen İzojenik Böbrek Glomerulus Çipi

Burada, tavuk embriyolarının selomik boşluğunda böbrek organoidlerinin transplantasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, 8 gün içinde organoidlerin vaskülarizasyonunu ve gelişmiş olgunlaşmasını indükler ve bu süreçleri verimli bir şekilde incelemek için kullanılabilir.

Tavuk Embriyolarında İntralomik Transplantasyon Yoluyla Böbrek Organoidlerinin Etkin Vaskülarizasyonu

Burada, insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür hPSCs CD34 ayırt etmek için kullanılan iletişim kuralları, mevcut+ hematopoetik ataları. Bu yöntem kurallı WNT ya kesin veya ilkel hematopoetik program sadece hücrelere belirtmek sinyal manipülasyon sahne özgü kullanır.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

Embriyodik vücut (EB) oluşumu, fibroblastik hücrelerin genişlemesi ve kondrojenik indüksiyonu içeren entegrasyonsuz bir yöntem kullanarak, indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) yoluyla insan periferik kandan (PB) bir kondrojenik soy oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Periferal Kan Türevi İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrositlerin Farklılaşması

Burada, kordon kanı mononükleer hücre kaynaklı insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden kondrojenik farklılaşma için bir protokol önermekteyiz.

Kordon Kanından Oluşan İndüklü Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrojenik Pellet Oluşumu

Öğrenin, süspansiyon kültüründe iPS hücrelerinden böbrek organoidleri üretme yöntemini. Başlangıç hücre yoğunluğu ve WNT agonist konsantrasyonu organoid gelişimini etkiler.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Süspansiyonda Böbrek Organoidlerinin Üretilmesi

Daha fazla video keşfet