Name: Fare Periaortik Yağ Dokusundan Stromal Vasküler Fraksiyon Kaynaklı Preadipositlerin İzolasyonu, Kültürü ve Adipojenik İndüksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Öğrenin fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyon kaynaklı preadipositlerin izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu yöntemini. Bu protokol damar hücreleri ile adipositler arasındaki etkileşimleri in vitro çalışmalarla araştırmaya olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82130012 ve 81830010) ve Şanghay Göğüs Hastanesi'nin temel araştırmaları için Yetiştirme projeleri (Hibe Numarası: 2022YNJCQ03) tarafından desteklenmiştir.

Hayvan protokolleri, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi'ne bağlı Şanghay Göğüs Hastanesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (onay numarası: KS23010) ve ilgili etik düzenlemelere uygundu. Bu deney için 4-8 haftalık erkek ve dişi C57BL/6 fareler tercih edilmelidir.
1. Cerrahi aletlerin, tamponların ve kültür ortamlarının hazırlanması
<ol><li>Cerrahi aletler (örn. cerrahi makas ve standart forseps) 121 °C'de 30 dakika boyunca otoklavlayın. Mikrocerrahi aletleri% 75 alkol ile dezenfekte edin.</li>
	<li>% 1 v / v penisilin-streptomisin ve% 10 v / v penisilin-streptomisin ile desteklenmiş 10 mL PBS ile desteklenmiş steril fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın. NOT: Aşağıdaki bölümlerde, özellikle belirtilmemişse, PBS, normal steril PBS'yi ifade eder.</li>
	<li>Krebs Ringer HEPES BSA tamponunu hazırlayın:% 1 sığır serum albümini (BSA), Krebs Ringer çözeltisinde çözülmüş 20 mM HEPES.</li>
	<li>Taze sindirim çözeltisi hazırlayın: tip 1 kollajenaz (1 mg / mL) ve dispas II (4 mg / mL) Krebs Ringer HEPES BSA tamponunda çözülür. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edin.</li>
	<li>Kollajen kaplı 12 oyuklu bir plaka hazırlayın.<ol><li>Kollajen çözeltisini (1 mg/mL) steril deiyonize su ile 40 μg/mL konsantrasyonuna seyreltin. 6-10 μg/cm2'lik bir konsantrasyon elde etmek için her bir oyuğun yüzeyine 1 mL seyreltilmiş kollajen çözeltisi ekleyin. Kaplamayı oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>Kalan çözeltiyi çıkarın ve her bir kuyuyu 2 kez 1 mL PBS ile durulayın. Plakayı hemen kullanın veya plakayı sınıf II laminer akış başlığında havayla kurutun ve kaplanmış plakayı 2-8 °C'de saklayın. Saklarken, kaplanmış plakaları parafilm ile kapatın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kültür ortamı hazırlayın: yüksek glikozlu Dulbecco's-Modifiye Eagles Medium (DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 v / v penisilin-streptomisin. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.</li>
	<li>Lipitojenik indüksiyon ortamı hazırlayın: yüksek glikozlu DMEM, %10 FBS, %1 v/v penisilin-streptomisin, 1 nM triiyodotironin, 1 μM rosiglitazon, 1 μM insülin, 0.5 mM 3-izobütil-1-metilksantin (IBMX) ve 1 μM deksametazon. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.</li>
	<li>Bakım ortamı hazırlayın: yüksek glikozlu DMEM, %10 FBS, %1 v/v penisilin-streptomisin, 1 nM triiyodotironin, 1 μM rosiglitazon ve 1 μM insülin. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.</li>
</ol>2. Perivasküler yağ dokusunun diseksiyonu ve izolasyonu (PVAT)
<ol><li>Fareyi% 2 izofluran anestezisi altında servikal çıkık veya aşırı dozda karbondioksit ile ötenazi yapın. Cilt dezenfeksiyonu için% 75 alkol püskürtün.</li>
	<li>Fareyi sırtüstü pozisyonda (yukarı bakacak şekilde) yerleştirin.</li>
	<li>Cildi kaldırın, küçük bir kesi yapın ve ventral orta hat boyunca pelvisten boyuna kadar cerrahi makasla cildi ve karın kaslarını künt bir şekilde ayırın. Orta hattın her iki tarafındaki diyaframı ve kaburgaları keserek kalbi ve akciğerleri ortaya çıkarın.</li>
	<li>Karaciğeri, dalak, bağırsakları ve böbreği dikkatlice çıkarın. Bağırsak duvarını kesmekten kaçının.</li>
	<li>Akciğerleri ve yemek borusunu çıkarın.</li>
	<li>Bir elinizde forseps ile kalbi nazikçe kaldırın ve diğer elinizde cerrahi makasla aort damarını omurgadan ayırın. Ardından, kalbi ve aortu %1 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS'li 60 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>Mikrocerrahi forsepsleri ve mikrocerrahi makasları alkolden çıkarın ve fazla alkolü çıkarmak için 25 mL PBS'de durulayın. Stereo mikroskop altında, timus ve diğer dokuları kalpten ve aorttan çıkarın, ardından kalbi çıkarın ve aortu PVAT'lerle bırakın.</li>
	<li>PVAT'lı aortu %1 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS'li 60 mm'lik temiz bir Petri kabına aktarın.</li>
	<li>PVAT'ları soymak için mikrocerrahi forseps kullanın, bir çift forseps aortu sabitler ve diğeri yağ dokusunu çeker. Perivasküler yağ dokusuna verilen zararı en aza indirirken damar dokusunu mümkün olduğunca çıkarın.</li>
	<li>Torasik aortu çevreleyen PVAT'ı, buz üzerine yerleştirilmiş %1 v/v penisilin-streptomisin ile desteklenmiş yüksek glikozlu DMEM içeren 2 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne toplayın.</li>
</ol>3. Stromal vasküler fraksiyonun (SVF) izolasyonu
<ol><li>Toplanan dokular %10 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS ve %1 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS ile sırayla durulayın. NOT: Bu adımdan itibaren, tüm deneyler steril koşullar altında sınıf II laminer akış başlığında gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>Dokuları steril 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın, 200 μL sindirim solüsyonu ekleyin ve steril makas kullanarak 1 mm3 parçaya kıyın.</li>
	<li>Karışımı plastik bir pipet ucu kullanarak 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, ucu steril bir makas kesimi ile genişletildi ve sindirim reaksiyonunu başlatmak için 6 mL sindirim solüsyonu ekleyin. NOT: Altı fareden PVAT depoları için bir sindirim reaksiyonu (3 mL sindirim solüsyonu) yeterlidir.</li>
	<li>Dokuları 37 °C'de orbital çalkalayıcı (etkili karıştırma için 150 rpm frekans) ile bir inkübatörde 30-45 dakika inkübe edin. Tüplerin yatay olarak sallanmasını sağlamak için tüpleri bir rafa düz bir şekilde bağlayın. Her 5-10 dakikada bir 10 saniye boyunca elle kuvvetlice yukarı ve aşağı sallayın. NOT: Doku parçası kalmayan homojen, sarımsı bir sindirim sıvısı görüldüğünde sindirim kesilebilir.</li>
	<li>Sindirilmiş dokuları 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün. Hücre verimini en üst düzeye çıkarmak ve sindirimi durdurmak için hücre süzgecini eşit hacimde kültür ortamı ile durulayın.</li>
	<li>Süzüntüyü yeni bir 15 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın ve 10 dakika boyunca 1.800 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atmak için tüpü ters çevirin ve peletleri 5 mL PBS'de yeniden süspanse edin. 1.800 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Tüpü ters çevirerek süpernatanı atın ve peletleri uygun bir hacimde kültür ortamında yeniden süspanse edin. NOT: Her altı fareden toplanan hücre peletleri, 1 mL kültür ortamında yeniden süspanse edilir ve 12 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna ekilir.</li>
	<li>Hücreleri kollajen kaplı 12 oyuklu bir plakaya tohumlayın ve gece boyunca %5CO2 içeren nemli bir atmosferde 37 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, kültür ortamını aspire edin, hücre kalıntılarını ve kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için hücreleri% 1 v / v penisilin-streptomisin içeren önceden ısıtılmış (37 ° C) PBS ile yıkayın ve her bir kuyucuğa 1 mL taze kültür ortamı ekleyin.</li>
</ol>4. Periaortik yağ dokusundan SVF kaynaklı preadipositlerin adipojenik indüksiyonu
<ol><li>Hücreler ~% 60-70 birleşmeye ulaşana kadar kültür ortamını her gün değiştirin. NOT: Hücrelerin %60-70 birleşmeye ulaşması genellikle 3-4 gün sürer.</li>
	<li>Hücreler% 60-70 birleşmeye ulaştığında, kültür ortamını aspire edin ve kahverengi adipojenik indüksiyon ortamı ile değiştirin. Adipojenik farklılaşmanın indüksiyon gününü farklılaşmanın 0. günü olarak düşünün.</li>
	<li>72 saat sonra (farklılaşmanın 3. günü), ortamı bakım ortamıyla yenileyin. Hücreler deneyler için kullanılana kadar bakım ortamını her 2 günde bir değiştirin.</li>
	<li>Adipojenik hücreleri, Yağ Kırmızısı O boyama14 ve batı lekeleme15 gibi uygun bir şekilde analiz edin.</li>
</ol>

Murin Perivasküler Yağ Dokusundan İzole Edilen Preadipositlerin Kültürlenmesi

<ol><li>Akoumianakis, I., Antoniades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interplay+between+adipose+tissue+and+the+cardiovascular+system%3A+is+fat+always+bad%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad.</a> Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).</li>
<li>Huang, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thoracic+perivascular+adipose+tissue+inhibits+VSMC+apoptosis+and+aortic+aneurysm+formation+in+mice+via+the+secretome+of+browning+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).</li>
<li>Xia, N., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+perivascular+adipose+tissue+in+obesity-induced+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).</li>
<li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease%3A+a+review+of+current+research+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li>
<li>Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+consensus+view+of+mammalian+adipocyte+stem+and+progenitor+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity.</a> Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).</li>
<li>Angueira, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+lineage+of+thermogenic+perivascular+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue.</a> Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).</li>
<li>Boucher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab27a+regulates+human+perivascular+adipose+progenitor+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Drugs+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).</li>
<li>Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+sympathetic+nerves+and+inflammation+in+perivascular+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Drugs+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of sympathetic nerves and inflammation in perivascular adipose tissue.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 245-259 (2019).</li>
<li>Ferroni, L., De Francesco, F., Pinton, P., Gardin, C., Zavan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+isolate+adipose+tissue-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells.</a> Methods in Cell Biology. 171, 215-228 (2022).</li>
<li>Senesi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+enzymatic+procedures+to+isolate+the+stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue%3A+preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 88(2019).</li>
<li>Andia, I., Maffulli, N., Burgos-Alonso, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+vascular+fraction+technologies+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Stromal vascular fraction technologies and clinical applications.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (12), 1289-1305 (2019).</li>
<li>Suh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+cellular+and+cell-derived+regenerative+therapies+in+dermatology+and+aesthetic+rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived cellular and cell-derived regenerative therapies in dermatology and aesthetic rejuvenation.</a> Ageing Research Reviews. 54, 100933(2019).</li>
<li>Bellei, B., Migliano, E., Picardo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+adipose+tissue-derivatives+in+modern+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology.</a> Experimental Dermatology. 31 (12), 1837-1852 (2022).</li>
<li>Kraus, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+adipocyte+differentiation+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture.</a> Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).</li>
<li>Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cortés, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+imaging+of+brown+adipocytes+from+the+stromal+vascular+fraction+of+interscapular+adipose+tissue+from+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (192), (2023).</li>
<li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methotrexate+improves+perivascular+adipose+tissue%2Fendothelial+dysfunction+via+activation+of+AMPK%2FeNOS+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Methotrexate improves perivascular adipose tissue/endothelial dysfunction via activation of AMPK/eNOS pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 15 (4), 2353-2359 (2017).</li>
<li>Li, X., Ballantyne, L. L., Yu, Y., Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+adipose+tissue-derived+extracellular+vesicle+miR-221-3p+mediates+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling.</a> FASEB Journal. 33 (11), 12704-12722 (2019).</li>
<li>Ruan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+adipose+tissue-derived+complement+3+is+required+for+adventitial+fibroblast+functions+and+adventitial+remodeling+in+deoxycorticosterone+acetate-salt+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).</li>
<li>Adachi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beiging+of+perivascular+adipose+tissue+regulates+its+inflammation+and+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling.</a> Nature Communications. 13 (1), 5117(2022).</li>
<li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li>
<li>Stanek, A., Brożyna-Tkaczyk, K., Myśliński, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+obesity-induced+perivascular+adipose+tissue+%28PVAT%29+dysfunction+in+vascular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis.</a> Nutrients. 13 (11), 3843(2021).</li>
<li>Queiroz, M., Sena, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+adipose+tissue+in+age-related+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease.</a> Ageing Research Reviews. 59, 101040(2020).</li>
<li>Fitzgibbons, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarity+of+mouse+perivascular+and+brown+adipose+tissues+and+their+resistance+to+diet-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+perivascular+adipose+tissue+on+peroxisome+proliferator-activated+receptor-%CE%B3+deletion+in+smooth+muscle+cells+impairs+intravascular+thermoregulation+and+enhances+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-γ deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis.</a> Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).</li>
<li>Piacentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+profiling+unveils+autoimmune+response+signatures+in+the+perivascular+adipose+tissue+of+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+reveals+perivascular+adipose+tissue+plasticity+in+response+to+angiotensin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II.</a> Pharmacological Research. 178, 106183(2022).</li>
<li>Shi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascending+aortic+perivascular+adipose+tissue+inflammation+associates+with+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease.</a> Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).</li>
<li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+cells+differentiate+into+brown+adipocytes+and+contribute+to+periaortic+arch+adipose+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).</li>
<li>Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fernández-Alfonso, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+differences+in+perivascular+adipose+tissue+impacting+vascular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).</li>
<li>Bar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+magnetic+resonance+imaging-based+detection+of+heterogeneous+endothelial+response+in+thoracic+and+abdominal+aorta+to+short-term+high-fat+diet+ascribed+to+differences+in+perivascular+adipose+tissue+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929(2020).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri finansal veya başka türlü herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Fare periaortik yağ dokusundan SVF'den türetilen preadipositlerin izolasyonu ve adipojenik indüksiyonu için pratik ve uygulanabilir bir yaklaşım öneriyoruz. Bu protokolün avantajları basit ve ekonomik olmasıdır. Başarılı izolasyon için yeterli sayıda fare kritik öneme sahiptir, çünkü yetersiz doku düşük SVF yoğunluğuna ve zayıf büyüme durumuna neden olabilir ve sonuçta lipojenik verimliliği etkileyebilir. Ek olarak, SVF'nin adipojenik potansiyeli yaşla birlikte azaldığı için fare yaşı dikkate alınması gereken önemli bir ...

Olgun adipositler ve stromal vasküler fraksiyonun (SVF) karışımından oluşan perivasküler bir yapı olan perivasküler yağ dokusunun (PVAT), sekretomu aracılığıyla komşu damar duvarı ile parakrineal olarak etkileşime girdiğine inanılmaktadır1. Vasküler homeostazın kritik bir düzenleyicisi olarak, PVAT disfonksiyonu kardiyovasküler hastalıkların patogenezinde rol oynar 2,3,4. Adiposit dokusunun SVF'si, endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri, mezotelyum hücreleri, nöronal hücreler ve adipoz kök ve progenitör hücreler (ASPC'ler) dahil olmak üzere birkaç beklenen hücre popülasyonundan oluşur5,6. Yağ dokusunun SVF'sinde bulunan ASPC'lerin olgun adipositlere yol açabileceği iyi bilinmektedir5. SVF'nin PVAT'ta kritik bir olgun adiposit kaynağı olduğu sonucuna varılmıştır. Birkaç çalışma, PVAT-SVF'nin belirli indüksiyon koşulları altında olgun adipositlere farklılaşabileceğini göstermiştir 6,7,8.
Şu anda, SVF'yi yağ dokusundan izole etmek için biri enzimatik sindirim ve diğeri enzimatik olmayan olmak üzere iki izolasyon sistemi vardır9. Enzimatik yöntemler tipik olarak daha yüksek çekirdekli progenitör hücre verimi ile sonuçlanır10. Bugüne kadar, SVF'nin yara iyileşmesi, ürogenital ve kardiyovasküler hastalıklarda vasküler rejenerasyonu ve neovaskülarizasyonu desteklemedeki faydaları, özellikle dermatoloji ve plastik cerrahide12,13 yaygın olarak gösterilmiştir11. Bununla birlikte, PVAT'tan türetilen SVF'nin klinik uygulama beklentileri iyi araştırılmamıştır, bu da SVF'nin PVAT'tan izolasyonu için standart bir yöntemin olmamasına bağlanabilir. Bu protokolün amacı, torasik aortu çevreleyen fare PVAT'ından SVF'den türetilen preadipositlerin izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için standart bir yaklaşım oluşturmak ve PVAT fonksiyonunun daha fazla araştırılmasını sağlamaktır. Bu protokol, genç farelerden elde edilen periaortik adipositlerin kültürlenmesi için doku işleme ve hücre farklılaşma tekniklerini optimize eder.

<table><tbody><tr><td>0.2 ve mu; m şırınga filtreleri</td><td>PALL</td><td>4612</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu plaka&nbsp;</td><td>Labselect</td><td>11210</td><td></td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpü</td><td>Labserv</td><td>310109003</td><td></td></tr><tr><td>3,3 ',5-triiyodo-L-tironin (T3)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T-2877</td><td>1 nM</td></tr><tr><td>50 mL santrifüj tüpü</td><td>Labselect</td><td>CT-002-50A</td><td></td></tr><tr><td>anti-adiponektin</td><td>Abcam</td><td>ab22554</td><td>1: 1.000 çalışma konsantrasyonu</td></tr><tr><td>anti-COX IV</td><td>CST</td><td>4850</td><td>1: 1.000 çalışma konsantrasyonu</td></tr><tr><td>anti-FABP4</td><td>CST</td><td>2120</td><td>1: 1.000 çalışma konsantrasyonu</td></tr><tr><td>anti-PGC1 ve alfa;</td><td>Abcam</td><td>ab191838</td><td>1: 1.000 çalışma konsantrasyonu</td></tr><tr><td>anti-PPAR ve gama;</td><td>Invitrogen</td><td>MA5-14889</td><td>1: 1.000 çalışma konsantrasyonu</td></tr><tr><td>anti-UCP1</td><td>Abcam</td><td>ab10983</td><td>1: 1.000 çalışma konsantrasyonu</td></tr><tr><td>anti-&alfa;-Aktinin</td><td>CST</td><td>6487</td><td>1: 1.000 çalışma konsantrasyonu</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Beyotime</td><td>ST023-200g</td><td>%1</td></tr> <tr><td>C57BL / Her iki cinsiyetten 4-8 haftalık 6 fare</td><td>Shanghai Model Organisms Center, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci 70 & m, naylon</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Baldır derisinden kollajen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz, Tip 1</td><td>Worthington</td><td>LS004196</td><td>1 mg / mL</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td>1 & mu; M</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4693-1G</td><td>4 mg / mL</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>%10</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-25G</td><td>20 mM</td></tr><tr><td>Yüksek glikozlu DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>IBMX&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td> orbital çalkalayıcılı <td>0.5 mM</td></tr><tr><td>İnkübatör</td>, <td>Shanghai longyue Instrument Eruipment Co., Ltd.</td><td>LYZ-103B</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin (sığır)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11070-73-8</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>RWD</td><td>R510-22-10</td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Ringer'ın Çözeltisi</td><td>Pricella&nbsp;</td><td>PB180347</td><td>Işıktan koruyun&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrocerrahi forseps</td><td>Beyotime</td><td>FS233</td><td></td></tr><tr><td>Mikrocerrahi makas</td><td>Beyotime</td><td>FS217</td><td></td></tr><tr><td>Yağ Kırmızı O&nbsp;</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd</td><td>A600395-0050</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Fosfat tamponlu salin)</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd</td><td>B548117-0500</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Peroksidaz AffiniPure Goat Anti-Fare IgG (H + L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>115-035-146</td><td>1: 5.000 çalışma konsantrasyonu</td></tr><tr><td>Peroksidaz AffiniSaf Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>111-035-144</td><td>1:5.000 çalışma konsantrasyonu</td></tr><tr><td>Rosiglitazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2408</td><td>1 & mu; M</td></tr><tr><td>Standart forseps</td><td>Beyotime</td><td>FS225</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi makas</td><td>Beyotime</td><td>FS001</td><td></td></tr></tbody></table>

fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyon kaynaklı preadipositlerin İzolasyonu, kültürü ve adipojenik İndüksiyonu

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue

Perivasküler yağ dokusu (PVAT), kan damarlarını çevreleyen ve beyaz, bej ve kahverengi adipositlerin fenotiplerini sergileyen bir yağ dokusu deposudur. Son keşifler, PVAT'ın vasküler homeostazın düzenlenmesinde ve kardiyovasküler hastalıkların patogenezine katılmadaki merkezi rolüne ışık tutmuştur. PVAT özelliklerinin ve regülasyonunun kapsamlı bir şekilde anlaşılması, gelecekteki tedavilerin geliştirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Periaortik adipositlerin primer kültürleri, PVAT fonksiyonunu ve periaortik adipositler ile vasküler hücreler arasındaki karışmayı incelemek için değerlidir. Bu makale, fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için ekonomik ve uygulanabilir bir protokol sunmaktadır ve bu, in vitro adipogenez veya lipogenezin modellenmesi için yararlı olabilir. Protokol, genç farelerden periaortik adipositlerin kültürlenmesi için doku işleme ve hücre farklılaşmasını ana hatlarıyla belirtir. Bu protokol, PVAT işlevinin araştırılması için tezgah tarafında teknolojik temel taşı sağlayacaktır.

Yukarıda açıklanan bu protokolü kullanarak, fare torasik aortlarını çevreleyen PVAT'leri dikkatlice izole ettik (Şekil 1A-D). PVAT'lar steril makas kullanılarak yıkandıktan ve küçük parçalara ayrıldıktan sonra (Şekil 1E,F), doku parçaları tip 1 kollajenaz (1 mg/mL) ve dispas II (4 mg/mL) içeren bir sindirim solüsyonunda sindirildi ve 37 °C'de bir çalkalayıcı üzerinde 30-45 dakika inkübe edildi (Şekil 1G).<strong...

Burada, perivasküler yağ dokusu fonksiyonunun ve vasküler hücrelerle ilişkisinin incelenmesine izin vererek, fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyonunu, kültürünü ve adipojenik indüksiyonunu açıklıyoruz.

Fare Periaortik Yağ Dokusundan Stromal Vasküler Fraksiyon Kaynaklı Preadipositlerin İzolasyonu, Kültürü ve Adipojenik İndüksiyonu

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown ...

Amacımız, kütle PVAT'ından stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyon kültürü ve adipojenik indüksiyonu için standart bir yaklaşım oluşturmaktır. Bu protokol, PVAT fonksiyonu ve periaortik adipositler ile vasküler hücreler arasındaki iletişim hakkında daha fazla araştırma yapmamızı sağlar in vitro. Şu anda deneylerimizde karşılaştığımız ana zorluklar arasında PVAT'ın mevcudiyetinin kısıtlanması ve ölümsüzleştirilmiş preadipositlerin kullanımına kıyasla ek insan ve malzeme kaynakları için gereksinimler yer alıyor.Protokolümüz, perivasküler yağ dokusu fonksiyonunun ve vasküler hücrelerle ilişkisinin incelenmesine izin verir. Ayrıca PVAT halkası ve genleri ile heterojenliği incelemek için bir temel sunuyoruz ve PVAT farklılaşmasının önemli düzenleyicisini ve in vitro adipogenezi keşfetmek için bir platform sağlıyoruz.

isolation-culture-adipogenic-induction-stromal-vascular-fraction

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, murin periaortik ark yağ dokusundan floresan etiketli nöral krestten türetilmiş adipoz türevli kök hücrelerin (ADSC'ler) izole edilmesi ve kültürlenmesi için bir teknik gösterilmektedir. İzolasyonu takiben, NCADSC'ler tespit edilir, floresanla aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak sıralanır ve daha sonra hücre proliferasyonunu teşvik ederek bir plaka üzerinde kültürlenir.

Murin Periaortik Yağ Dokusundan Yağ Kaynaklı Kök Hücrelerin İzole Edilmesi

2001 yılında, UCLA araştırmacılar erişkin kök hücrelerin bir nüfus izolasyon, adipoz dokudan, Yağ elde edilen kök hücreler veya TSK adlandırılan nitelendirdi. Bu makale kolajenazı kullanarak manuel, enzimatik sindirim protokolü kullanılarak lipoaspirates gelen TSK izolasyonunu özetliyor.

İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon

Bu protokol, domuz adipoz kaynaklı kök hücrelerin (pADSC) deri altı yağ dokularından izolasyonunu ve çoklu potansiyelin incelenmesini tanımlar. Multipotent pADSC, adiposit farklılaşma süreçlerini tanımlamak ve rejeneratif çalışmalar için mezodermal mezenşimin çoklu hücre soylarına veya ektoderm ve endodermin diğer soylarına transdiferansiyonu incelemek için kullanılır.

Domuz Subkutan yağ dokularındaki İzolasyonu ve Yağ-Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşması

Burada Manyetik Aktif Hücre Ayırma (MCS) kullanarak Perivasküler Adipoz Doku (PVAT) Adiposit Progenitör Hücre (APC) popülasyonlarının izolasyonu için bir yöntem rapor. Bu yöntem, floresan-Aktive Hücre Ayırma (FACS) ile karşılaştırıldığında, yağ dokusunun gramı başına APC'nin artan bir izolasyonuna izin verir.

Manyetik Aktive Hücre Ayırma ile İzole Edilen Perivasküler Adipoz Doku&#39;ndan Adiposit Progenitörlerinin Genleşmesi ve Adipogenez İndüksiyonu

Wnt-1 Cre+/-periaortik yağ dokusundan elde edilen adipoz türetilmiş kök hücrelerin (NCADSCs) izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için bir protokol salıyoruz. Rosa26RFP/+ fareler. NCADSCs in vitro adipogenez veya lipogenez modelleme için ADSCs kolay erişilebilir bir kaynak olabilir.

Periaortik Yağ Dokusundan Nöral Adipoz-Türetilmiş Kök Hücrelerin İzolasyon, Kültür ve Adipojenik İndüksiyonu

Bu protokol, adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını murin karın içi beyaz yağ dokusu (WAT) depolarından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla izole etmek için teknik yaklaşımı açıklar.

Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Bu protokol, preadipositleri elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu sağlamak için stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan yarı otomatik izolasyonunu tanımlar. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanmak deneysel varyasyonu azaltır ve tekrarlanabilirliği arttırır.

Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu

Olgun adipositlerin büyüklüğü ve kırılganlığı, çalışmaları ve izolasyonları için mevcut teknik ve araçları sınırlamıştır. Burada, farklı yağ depoları ve fare diyetleri için kolayca uyarlanabilen olgun murin adipositlerinin izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır.

Yağsız ve Obez Farelerden Primer Murin Adipositlerinin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Burada, &gt;90% işlem süresi azalması, yüksek hücre canlılığı ve geniş uyumlulukla karakterize edilen yağ kaynaklı kök hücreleri ve adipositleri verimli şekilde izole etmek için standart bir yöntem sunuyoruz.

Domuz yağ dokusundan yağ kök hücrelerinin ve adipositlerin etkili izolasyonu

Farelerde beyaz adipoz dokulardan izole İlköğretim beyaz preadipositlerden bej / brite hücrelerine ayırt edilebilir. Burada sunulan beyaz yağ "esmerleşme" moleküler düzenlenmesi okumak için güvenilir hücresel modeli sistemidir.

Bej / Brite Hücreler Stromal Vasküler Hücre İzolasyonu ve Farklılaşma

Öğrenin fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyon kaynaklı preadipositlerin izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu yöntemini. Bu protokol damar hücreleri ile adipositler arasındaki etkileşimleri in vitro çalışmalarla araştırmaya olanak tanır.

Fare Periaortik Yağ Dokusundan Stromal Vasküler Fraksiyon Kaynaklı Preadipositlerin İzolasyonu, Kültürü ve Adipojenik İndüksiyonu (Video) | JoVE Journal

Fare Periaortik Yağ Dokusundan Stromal Vasküler Fraksiyon Kaynaklı Preadipositlerin İzolasyonu, Kültürü ve Adipojenik İndüksiyonu

Daha fazla video keşfet