Name: Tek Çekirdekli Multiom Tahlilleri için Yüksek Kaliteli Beyin ve Kemik İliği Çekirdeği Hazırlığı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Öğrenin beyin ve kemik iliği dokularından yüksek saflıkta çekirdek izolasyonu için optimize edilmiş protokolü. Bu yöntem tek hücreli multiom analizlerinde güvenilir sekanslama verileri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ana Jeemin Choi, Pasteur - Paris Üniversitesi (PPU) Uluslararası Doktora Programı'ndan bir bursla desteklendi.

Multiome 10X Genomik Analizi için Yüksek Kaliteli Numune Hazırlama

<ol><li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781(2018).</li>
<li>Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics%3A+technologies+and+data+analysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods.</a> Experimental & Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).</li>
<li>Cerrizuela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scNMT+protocol+for+multiomics+profiling+of+single+cells+from+mouse+brain+and+pancreatic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-throughput scNMT protocol for multiomics profiling of single cells from mouse brain and pancreatic organoids.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101555(2022).</li>
<li>Dimitriu, M. A., Lazar-Contes, I., Roszkowski, M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics+techniques%3A+From+conception+to+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics techniques: From conception to applications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854317(2022).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+profiling+of+chromatin+accessibility+and+gene+expression+in+thousands+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Joint profiling of chromatin accessibility and gene expression in thousands of single cells.</a> Science (New York, N.Y.). 361 (6409), 1380-1385 (2018).</li>
<li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+Isolation+from+Fresh+Frozen+Brain+Tumors+for+Single-Nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61542(2020).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+transcriptomics+reveals+functional+compartmentalization+in+syncytial+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus transcriptomics reveals functional compartmentalization in syncytial skeletal muscle cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 6375(2020).</li>
<li>Santos, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+sequencing+of+single+nuclei+from+murine+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100694(2021).</li>
<li>Safabakhsh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+nuclei+from+frozen+human+heart+tissue+for+single-nucleus+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing.</a> Current Protocols. 2 (7), e480(2022).</li>
<li>Lau, S. -F., Cao, H., Fu, A. K. Y., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+transcriptome+analysis+reveals+dysregulation+of+angiogenic+endothelial+cells+and+neuroprotective+glia+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus transcriptome analysis reveals dysregulation of angiogenic endothelial cells and neuroprotective glia in Alzheimer's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (41), 25800-25809 (2020).</li>
<li>Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+brain+cell+transcriptomes+and+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes.</a> Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).</li>
<li>Morabito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+chromatin+accessibility+and+transcriptomic+characterization+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus chromatin accessibility and transcriptomic characterization of Alzheimer's disease.</a> Nature Genetics. 53 (8), 1143-1155 (2021).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+transcriptomics+reveals+genes+associated+with+the+vulnerability+of+middle+temporal+gyrus+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved transcriptomics reveals genes associated with the vulnerability of middle temporal gyrus in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 188(2022).</li>
<li>Paul, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+heterogeneity+and+lineage+commitment+in+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional heterogeneity and lineage commitment in myeloid progenitors.</a> Cell. 163 (7), 1663-1677 (2015).</li>
<li>Kaufmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCG+educates+hematopoietic+stem+cells+to+generate+protective+innate+immunity+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BCG educates hematopoietic stem cells to generate protective innate immunity against tuberculosis.</a> Cell. 172 (1-2), 176-190.e19 (2018).</li>
<li>Christ, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+diet+triggers+NLRP3-dependent+innate+immune+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Western diet triggers NLRP3-dependent innate immune reprogramming.</a> Cell. 172 (1-2), 162-175.e14 (2018).</li>
<li>Moorlag, S. J. C. F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Glucan+Induces+protective+trained+immunity+against+mycobacterium+tuberculosis+infection%3A+A+key+role+for+IL-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">β-Glucan Induces protective trained immunity against mycobacterium tuberculosis infection: A key role for IL-1.</a> Cell Reports. 31 (7), 107634(2020).</li>
<li>de Laval, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBP%CE%B2-dependent+epigenetic+memory+induces+trained+immunity+in+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">C/EBPβ-dependent epigenetic memory induces trained immunity in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 26 (5), 657-674.e8 (2020).</li>
<li>Renthal, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+mosaic+Rett+syndrome+brain+tissue+by+single-nucleus+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of human mosaic Rett syndrome brain tissue by single-nucleus RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 21 (12), 1670-1679 (2018).</li>
<li>Yang, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+brain+vascular+atlas+reveals+diverse+mediators+of+Alzheimer%27s+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer's risk.</a> Nature. 603 (7903), 885-892 (2022).</li>
<li>Lee, D. R., Zhang, Y., Rhodes, C. T., Petros, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+single-cell+and+single-nuclei+suspensions+from+embryonic+and+adult+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of single-cell and single-nuclei suspensions from embryonic and adult mouse brains.</a> STAR Protocols. 4 (1), 101944(2022).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li>
<li>Ranzoni, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+single-cell+RNA-seq+and+ATAC-seq+analysis+of+human+developmental+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative single-cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of human developmental hematopoiesis.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 472-487.e7 (2021).</li>
<li>10X Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide, Document Number CG000338 Rev F. , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide</a> (2022).</li>
<li>Meyerhoff,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941(2021).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C). , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing</a> (2022).</li>
<li>Haag, S., Murthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+monocyte+and+macrophage+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Murine monocyte and macrophage culture.</a> Bio-Protocol. 11 (6), e3928(2021).</li>
<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lönnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
<li>Jiang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Quality control of single-cell RNA-seq.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 1935, 1-9 (2019).</li>
<li>Regan, C., Preall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for single-cell genomics.</a> Current Protocols. 2 (8), e498(2022).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell ATAC Sequencing (CG000169 - Rev E). , At 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-atac/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-atac-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-atac/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-atac-sequencing</a> (2022).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation from Complex Tissues for Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Sequencing. (CG000375 - Rev C). , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing</a> (2022).</li>
<li>10X Genomics 10X Genomics - Chromium Nuclei Isolation Kit (CG000505 - Rev A). , At
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/chromium-nuclei-isolation-kit-sample-prep-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/chromium-nuclei-isolation-kit-sample-prep-user-guide</a> (2022).</li>
<li>Shomroni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-cell+RNA-sequencing+approach+and+its+applicability+connecting+genotype+to+phenotype+in+ageing+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel single-cell RNA-sequencing approach and its applicability connecting genotype to phenotype in ageing disease.</a> Scientific Reports. 12 (1), 4091(2022).</li>
<li>Ocañas, S. R., Pham, K. D., Blankenship, H. E., Machalinski, A. H., Chucair-Elliott, A. J., Freeman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+ex+vivo+confounds+of+cell-isolation+techniques+on+transcriptomic+and+translatomic+profiles+of+purified+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia.</a> eNeuro. 9 (2), (2022).</li>
<li>Gérard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+activity-based+screening+and+sequencing+of+antibodies+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell activity-based screening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics.</a> Nature Biotechnology. 38 (6), 715-721 (2020).</li>
<li>Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+applications+for+single-cell+and+spatial+multi-omics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics.</a> Nature Reviews. Genetics. 24, 494-515 (2023).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Yüksek kaliteli hücre veya çekirdek süspansiyonunun hazırlanması, tek hücreli veya tek çekirdekli RNA-Seq ve tek hücreli multi-omik analizlerin başarısı için çok önemlidir 29,30,31. Burada, beyin ve kemik iliği olmak üzere iki tip dokudan multiom tahlilleri için numune hazırlama ve çekirdek izolasyonu protokollerini tanımladık.
Bu yazıda açıklanan beyin protokolü, taze dondurulmuş beyin dokusundan yüksek kaliteli çekirdeklerin geri kazanılmasına izin verir. Aşağıdaki adımları içerir: donmuş doku bozulması, çekirdeklerin izolasyonu, çekirdeklerin saflaştırılması ve hazırlanan materyalin kalite kontrolü. Beyin dokusu birçok farklı hücre tipinden oluşur ve doku ayrışması ve çekirdek izolasyonu prosedürü, ilk dokuda bulunan hücre popülasyonlarının oranlarını korumalıdır. Burada, lizis tamponu bileşimi ve inkübasyon süresi, dokuyu oluşturan tüm hücre popülasyonlarının tam ve nazik bir şekilde parçalanmasını sağlamak için optimize edildi.
Kemik iliği HSPCs protokolü biraz farklıdır, çünkü deneyin başlangıcında ilgilenilen hücre popülasyonunu heterojen bir hücresel süspansiyondan izole etmek için ek bir adım gerektirir. Taze doku toplandıktan sonra, kırmızı kan hücreleri parçalanır ve numune, ilgilenilen hücre alt kümesi için zenginleştirilir. Hedeflenen hücreler parçalanır, çekirdekler izole edilir ve hazırlanan malzemenin kalitesi kontrol edilir.
10X Genomics, çok sayıda farklı dokuda çekirdek izolasyonu için doğrulanmış çeşitli protokoller sağlar32,33. Şirket ayrıca, çekirdekleri doğrulanmış dokulardan izole etmek için basit bir boru hattına sahip bir çekirdek izolasyon kitini ticarileştirmektedir34. Bununla birlikte, bu protokollerin belirli örneklerin özelliklerini uyarlamak için ek optimizasyona ihtiyacı vardır. Bir örnek, düşük hücre girdisi ile çalışmayı gerektiren örneklerdir. Bu numuneler için en zorlu adımlar, numuneyi temizlemek için yeterince katı ve hücre/çekirdek kaybını önlemek için yeterince yumuşak olması gereken santrifüjlerdir. Burada açıklanan protokolle, bu iki gereksinim arasında ince bir denge bulmak için 10X Genomik Gösterilmiş Protokolü - Tek Hücreli Çoklu ATAC + GEX Dizileme (CG000365 - Rev C)27 için Çekirdek İzolasyonu'nu uyarladık. Sıralanmış HSPC'lerden çekirdeklerin hazırlanması örneğinde gösterildiği gibi, numunenin kalitesi üzerinde hiçbir etkisi olmadan çekirdek geri kazanımını iyileştirdik.
Ek bir zorluk, çekirdek izolasyonu için saflaştırılmış hücrelerin parçalanması adımıdır. Daha sert lizis koşulları ve daha uzun inkübasyon süreleri çekirdeklere zarar verebilir ve böylece dizileme verilerinin kalitesini etkileyebilir. Şekil 5 , lizis tamponu ile farklı inkübasyon süreleri üzerine kemik iliği örneklerinden temsili çekirdek görüntülemeyi gösterir ve hücre lizizine bağlı olarak çekirdeklerin durumunun ne kadar farklı olabileceğini gösterir. HSPC'ler örneğinde, sağlıklı görünümlü, sağlam çekirdeklerin en yüksek oranı ve hasarlı çekirdeklerin en düşük oranı ile sonuçlanan durum olarak 3 dakikalık lizizi belirledik. Lizis inkübasyon süreleri, her yeni numune türü için optimize edilmelidir.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig05.jpg"> Şekil 5: Mikroskopi ile çekirdek kalite kontrolü. Fare kemik iliğinden izole edilmiş çekirdeklerin (A) sağlam ve (B) hasarlı çekirdeklere sahip temsili parlak alan görüntüleri gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 5 μm. Görüntüler, 40x ELWD NA 0.60 objektif ve 1.5x dijital zoom kullanılarak ters mikroskopla çekildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Uzun yıllar boyunca, tek hücreli teknikler biyolojik süreçlerin analizi için altın standart olmuştur. Başlangıçta mikroskopi, akış sitometrisi ve benzeri tahliller yoluyla tek hücreli fenotipleme ile sınırlıydılar. Tek hücreli analizde bir atılım, tek hücreli moleküler profilleme, özellikle tek tek hücrelerin tüm transkriptomunun karakterize edilmesini sağlayan tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-Seq) yaklaşımlarının geliştirilmesiyle geldi. Son derece güçlü olan scRNA-Seq, belirli bir koşul ve zaman noktasındaki bir hücrenin transkripsiyonel durumu hakkında bilgi üretir. Bununla birlikte, transkripsiyonu yönlendiren gen regülasyonu veya zaman içinde meydana gelen moleküler modifikasyonlar hakkında görünürlük sağlamaz. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, aynı hücreden birden fazla faktörün ve işleminanalizini sağlayan tek hücreli multi-omik tahlillerin geliştirilmesine birçok çaba harcanmıştır 1,2,3,4. Tek hücreler içindeki iki modalitenin ilk başarılı ölçümü, CITE-Seq yaklaşımında5 tek tek hücrelerin tam transkriptomu ile multipleks yüzey protein ekspresyon modellerinin bağlanmasıyla geldi. Daha yeni evrimler, gen ekspresyonunu kromatin erişilebilirliği ile birleştirir (Dizileme kullanarak Transpozaz Erişilebilir Kromatin Testi, ATAC-Seq), böylece aynı hücrelerde (örneğin, sci-CAR) aynı anda transkriptomik ve epigenomik modaliteleri yakalar6. Transkriptomiklerin hücre fenotipi veya aynı hücrenin epigenetik değişiklikleri ile ilişkilendirilmesine izin veren ilk ticari çözümler 10X Genomics'ten geldi.
Tek hücreli moleküler profilleme deneyleri aşağıdaki adımları içerir: (1) doku ayrışması veya tek hücreli süspansiyonların hazırlanması; (2) hücre saflaştırma ve/veya çekirdek izolasyonu; (3) bölümleme ve barkodlama; (4) kütüphane inşaatı ve kalite kontrolü; (5) yeni nesil dizileme; (6) veri analizi. Adımlar (3)-(6) kullanılan teknolojiye bağlı olarak önemli ölçüde değişebilse de, ilk adımlar genellikle hepsi için ortaktır. Hazırlanan hücre/çekirdek süspansiyonunun kalitesi, deneyin genel sonucunu belirleyecektir. Doku tipine bağlı olarak, yüksek kaliteli tek hücreli/çekirdek süspansiyonları elde etmek zor olabilir. Kalp, kas, beyin, akciğer, bağırsak ve diğerleri gibi bazı dokuların özellikleri, moleküler analiz için yüksek kaliteli çekirdeklerin üretimini garanti etmek için her bir numune tipine uyarlanmış doku bozulması ve çekirdek izolasyonu için yöntemler gerektirir 7,8,9,10. Doku parçalama yöntemleri ve ayrışma protokolleri mekanik, enzimatik (örneğin, kollajenaz ve DNaz karışımı) veya ikisinin bir kombinasyonu olabilir ve manuel olarak veya aletlerle (örneğin, Qiagen DSC-400, gentleMACS) gerçekleştirilebilir.
Tek hücreli teknikler, biyomedikal araştırmalar için tercih edilen bir araç haline gelmiştir. Nörobiyolojide, beyindeki hücre çeşitliliği ve işlevlerinin karmaşıklığı, nadir hücre popülasyonlarının görselleştirilmesi ve heterojenliklerinin değerlendirilmesi için yüksek çözünürlüklü ve yüksek verimli analiz gerektirir 11,12,13,14. Bireysel hücrelerin hücresel kimliğini ve gen düzenleyici mekanizmalarını birbirine bağlamak, beyin gelişimi ve fizyolojisi hakkında fikir verir. Başka bir örnek, güçlü bir şekilde tek hücreli analizlere dayanan enfeksiyöz, otoimmün veya kanser hastalıkları bağlamında bağışıklık tepkisi çalışmalarıdır. İmmün hücre alt kümelerinin heterojenliği ve aktivitelerinin karmaşıklığı ve diğer hücre tipleri ile etkileşimleri, immün yanıtın altında yatan mekanizmaların deşifre edilmesinde tek hücreli çözünürlük gerektirir. Bağışıklık hücreleri, hematopoietik progenitörlerin, kemik iliğinden periferdeki eve çıkmadan önce aşamalı bir süreç boyunca hücre yüzey belirteçlerini alan ve kaybeden kademeli olarak farklılaşan hücrelerden oluştuğu kemik iliğinden kaynaklanır. Tek hücreli analiz, hücresel gelişim aşamalarının dakika karakterizasyonuna izin verir. Geleneksel olarak çok parametreli akış sitometrisi ile gerçekleştirilen tek hücreli fenotipleme yoluyla elde edilebilir. Bununla birlikte, tek hücreli transkriptomik imzaların, progenitör hücre alt tiplerinin daha kesin bir şekilde tanımlanmasını ortaya çıkardığı gösterilmiştir, çünkü bu hücreler birbirine düşen kümeler halinde dağılmıştır ve bu nedenle kaba bir hücre yüzeyi işaretleyici yaklaşımı kullanıldığında yanlış tanımlanabilir15. Artan sayıda çalışma, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin (HSPC'ler) çeşitli ajanlara maruz kalmaktan elde edebileceği epigenetik modifikasyonları ortaya çıkarmakta ve bu da bağışıklık sisteminin uzun vadeli duyarlılığı üzerinde önemli bir etkiye yol açmaktadır 16,17,18,19. Yeni multi-omik teknolojileri, bu süreçlerin tek hücreli çözünürlükle incelenmesini sağlar.
Beyin 11,20,21,22 ve kemik iliği örnekleri23,24 için hücre ve çekirdek izolasyonu için birçok protokol tanımlanmıştır. Deneysel değişkenlikten kaynaklanan yanlılığı en aza indirmek için, ortak tek hücreli transkriptomik ve epigenomik dizileme için optimize edilmiş tek çekirdekli hazırlama protokollerini doğrulamak ve böylece tek hücreli multiomik testlerin tekrarlanabilirliğini sağlamak gerekir.
Burada, (1) taze dondurulmuş beyin dokusundan ve (2) aşağı akış tek hücreli Multiom analizi için taze kemik iliği HSPC'lerinden çekirdek hazırlığı için iki sağlam protokol açıklanmaktadır (Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig01.jpg"> Şekil 1: Taze dondurulmuş beyin ve kemik iliği dokularından çekirdek izolasyonu için protokollerin şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>18 G x 1 ve frak12; (1,2 mm x 38 mm) Agani iğneleri</td><td>Terumo</td><td>AN*1838S1</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tüpler</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>5 mL yuvarlak tabanlı FACS tüpü, hücre süzgeç kapaklı 35 ve mikro; m</td><td>falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tüpler</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD pharmagen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing Tamponu</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-fare CD117 (c-Kit)</td><td>BioLegend</td><td>105812</td><td>Klon: 2B8</td></tr><tr><td>APC/Siyanin 7 anti-fare CD16/32 (Fc & gama; R)</td><td>BioLegend</td><td>101328</td><td>Klonu: 93</td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td>uygulanamaz</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Yazılımı v8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>uygulanamaz</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini&nbsp; stok solüsyonu %10</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Hücre boyama tamponu</td><td>Biolegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td>uygulanamaz</td></tr><tr><td>CMOS kamera Prime 95B 25 mm</td><td>Photometrix</td><td>uygulanamaz</td><td></td></tr><tr><td>Kontes II FL Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Kontes hücre sayma odası sürgüsü</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Camı 24 mm x 24 mm 0,13-0,17 mm</td><td>Marka</td><td>BR470819</td><td></td></tr><tr><td>Digitonine %5</td> <td>Canlandırıcı</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Neşterler&nbsp;</td><td>Swann-Morton&nbsp;</td><td>0508</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x)</td><td>Gibco</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Epifloresan ters mikroskop Nikon Ti2 -E</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td>uygulanamaz</td></tr><tr><td>Eppendorf Güvenli Kilit Tüpleri 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30123603</td><td></td></tr><tr><td>Etanol %70</td> <td>VWR</td><td>83801.290</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-fare CD34</td><td>Invitrogen</td><td>11-0341-85</td><td>Klon: RAM34</td></tr><tr><td>Diseksiyon için Forseps</td><td>FST</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Isı ile İnaktive Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>11533387</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Homojenizatör 2 mL</td><td>Bellco cam</td><td>1984-10002</td><td>Havaneli " A&rdquo; Büyük Boşluk: .0030-.0050 & Prime; ve Havaneli " B&rdquo; Küçük Boşluk: .0005-.0025 & Prime;</td></tr><tr><td>CANLI / ÖLÜ sabitlenebilir aqua ölü hücre leke kiti</td><td>Invitrogen</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür çözeltisi 1 M</td><td>Sigma aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj ve nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Montaj ortamı Fluoromount-G&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 ikame</td><td>Sigma aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>ThermoFischer</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Çekirdek tamponu 20x&nbsp;</td><td>10X Genomik</td><td>2000153/2000207</td><td></td></tr><tr><td>Çekirdek izolasyon kiti EZ hazırlığı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NUC-101</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads tazminat boncukları</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-41</td><td></td></tr><tr><td>Pasifik Mavisi anti-fare soy kokteyli (anti-fare CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119 dahil)</td><td>BioLegend</td><td>133310</td><td>Klonlar (listelenen antikorlarla aynı sırada): 17A2, RB6-8C5, M1/70, RA3-6B2, Ter-119</td></tr><tr><td>PCR Tüp Şeritleri 0.2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-fare Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>BioLegend</td><td>122507</td><td>Klon: E13-161.7</td></tr><tr><td>Petri kabı 100 mm x 20 mm OPTILUX</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Ply-L-lizin% 0.01 steril filtreli, hücre kültürü için uygun</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Baskılı mikroskop slaytları 8 kuyulu 6 mm numaralı</td><td>Epredia</td><td>ER-301B-CE24</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Tüpleri 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108116</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Rnaz inhibitörü 5000 U</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon için makas</td><td>FST</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür çözeltisi 5 M</td><td>Sigma aldrich</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtreleri, PES, 0.2 ve mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf oje&nbsp;</td><td>uygulanamayan</td><td></td><td></td>herhangi bir</tr><tr><td>Trizma Hidroklorür çözeltisi pH 7.4</td><td>Sigma aldrich</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi %0.4</td> <td>gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biorad&nbsp;</td><td></td><td></td>1662404</tr><tr><td>UltraPure Distilasyonlu Su Dnase/Rnase İçermeyen</td><td>İnvitrojen</td><td>10977-035</td><td></td></tr></tbody></table>

tek Çekirdekli multiom tahlilleri için yüksek kaliteli beyin ve kemik İliği Çekirdeği hazırlığı

High-Quality Brain and Bone Marrow Nuclei Preparation for Single Nuclei Multiome Assays

Tek hücreli analiz, tek hücreli çözünürlük ile tedaviye veya enfeksiyona bireysel hücresel yanıtların değişkenliğini değerlendirmeyi gerektiren biyolojik süreçlerin karmaşıklığını çözmek için tercih edilen yaklaşım haline gelmiştir. 
Son 10 yılda tek hücreli moleküler profilleme için birçok teknik geliştirildi ve birkaç özel teknoloji ticarileştirildi. 10X Genomik damlacık tabanlı tek hücreli profilleme, transkriptomik ve multi-omik tek hücreli profilleme için kullanıma hazır reaktifler sunan yaygın bir teknolojidir. Teknoloji, tek hücreli ve tek çekirdekli RNA dizilimi (sırasıyla scRNA-Seq ve snRNA-Seq), scATAC-Seq, tek hücreli bağışıklık profili oluşturma (BCR/TCR dizilimi) ve multiom için iş akışlarını içerir. İkincisi, aynı hücreden gelen transkripsiyonel (scRNA-Seq) ve epigenetik bilgiyi (scATAC-Seq) birleştirir. 
Dokulardan izole edilen ve bu yaklaşımlardan herhangi biri ile analiz edilen tek hücreli veya tek çekirdekli süspansiyonların kalitesi (canlılığı, bütünlüğü, saflığı), yüksek kaliteli veriler üretmek için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, numune hazırlama protokolleri her biyolojik dokunun özelliklerine uyarlanmalı ve yüksek kaliteli hücre ve çekirdek süspansiyonlarının üretilmesini sağlamalıdır.
Bu makalede, aşağı akış multiomlu 10X Genomik boru hattı için beyin ve kemik iliği örneklerinin hazırlanmasına yönelik iki protokol açıklanmaktadır. Protokoller aşamalı olarak gerçekleştirilir ve hücre bölümleme ve barkodlama, kütüphane hazırlama ve dizileme için başlangıç materyali olarak kullanılan doku ayrışmasını, hücre sıralamasını, çekirdek izolasyonunu ve hazırlanmış çekirdek süspansiyonunun kalite kontrolünü kapsar. Bu standartlaştırılmış protokoller, yüksek kaliteli çekirdek kitaplıkları ve sağlam ve güvenilir veriler üretir.

Yukarıda açıklanan iki protokol, iki farklı doku türünden başlayarak çekirdeklerin izolasyonunu detaylandırır. İki protokol arasındaki farklılıklar ve benzerlikler Şekil 1'de şematik olarak gösterilmiştir.
Fare beyninden çekirdeklerin saflaştırılması Burada açıklanan protokolde, beyin örneklerinden çekirdek hazırlığı için nazik bir yöntem öneriyoruz. Beyin dokusunun bir lizis tamponunda mekanik olarak ayrışması ile başlar, ardından kalan dokuyu süspansiyondan çıkaran yıkama ve süzgeç filtreleme adımları ile devam eder. Enkazın, parçalanmamış hücrelerin ve küçük parçacıkların daha sonra uzaklaştırılması, aşağı akış Multiome protokolü için yalnızca saflaştırılmış çekirdeklerin yüklenmesini garanti etmek için FACS tarafından sağlanır. Şekil 2<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig02large.jpg" target="_blank"></a> <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig03v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig03largev2.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig04large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td rowspan="7"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"></td><td></td><td></td><td></td><td rowspan="4"></td><td rowspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/Moraes-Cabe%20et%20al_Supplementary%20Figure1.pdf" target="_blank"></a>

Tek hücreli/tek çekirdekli transkriptomiklerin ve multi-omiklerin başarısı büyük ölçüde hücrelerin/çekirdeklerin kalitesine bağlıdır. Bu nedenle, hücrelerin/çekirdeklerin dokudan izole edilmesi ve saflaştırılması yüksek düzeyde standartlaştırılmalıdır. Bu protokol, aşağı akış tek çekirdekli multiom testi için beyin ve kemik iliğinden çekirdeklerin hazırlanmasını açıklar.

Tek Çekirdekli Multiom Tahlilleri için Yüksek Kaliteli Beyin ve Kemik İliği Çekirdeği Hazırlığı

Single-cell analysis has become the approach of choice for unraveling the complexity of biological processes that require assessing the variability of ...

Sitometri ve Biyobelirteçler Teknoloji Birimi, hücre fenotiplemesi ve tek hücre çözünürlüğü ile moleküler profilleme için en son teknolojiler ve boru hatları aracılığıyla biyomedikal projeleri desteklemektedir. Bu bağlamda, sağlık ve hastalıkta gen ekspresyonu ve gen regülasyonu hakkında bilgi edinmek için tek hücreli multiomik analiz için farklı araçlar kullanıyoruz. Akış sitometrisi, benzersiz özelliklere dayalı olarak tek tek hücreleri tanımlar ve kaynak sağlar.Son gelişmeler, yüksek verimli, görüntü tabanlı spektral sıralayıcıları içerir ve bu teknolojiler panel tasarımında esneklik sunar, benzer boyaların aynı anda kullanılmasını ve otofloresan yönetimini sağlar. En yeni, tek hücreli teknolojileri kullanırken büyük bir deneysel zorluk, özellikle kırılgan veya nadir hücre popülasyonlarıyla çalışmaktır. Her doku veya hücre tipinin, yüksek kaliteli dizileme verilerine dönüşen yeterli sayıda yüksek canlılığa sahip hücre elde etmek için ince ayarlı protokol optimizasyonundan geçmesi gerekir.Modifiye edilmiş tek çekirdek hazırlama protokolümüz, çekirdeklerin geri kazanılmasını iyileştirir ve çekirdekler üzerindeki stresi en aza indirir. Beyin ve kemik iliği dokuları için özel olarak optimize edilmiştir ve numune ayrışmasından çekirdek saflaştırmasına kadar tüm adımları kapsar.

high-quality-brain-bone-marrow-nuclei-preparation-for-single-nuclei

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tümör içi heterojenlik gliomalar da dahil olmak üzere tümörlerin doğal bir özelliğidir. Tek çekirdek RNA ve ATAC dizileme çalışmaları için tek çekirdekleri taze donmuş glioma dokularından izole etmek için tamponlar ve gradyan santrifüjleme kombinasyonunu kullanan basit ve verimli bir protokol geliştirdik.

Tek Çekirdekli RNA-seq ve ATAC-seq için Taze Donmuş Beyin Tümörlerinden Çekirdek İzolasyonu

Burada, tek çekirdekli RNA-seq, ATAC-seq ve eklem multiomikleri (RNA-seq ve ATAC-seq) için flaş dondurulmuş, arşivlenmiş karaciğer dokularından çekirdekleri izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Tek Hücreli Multiomikler için Flaş Dondurulmuş Karaciğer Dokusundan Çekirdeklerin İzolasyonu

Çalışma, aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş memeli dokularından yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için basit, hızlı ve kısmen otomatikleştirilmiş bir protokolü açıklamaktadır.

Tek Çekirdek Dizilimi için Donmuş Memeli Dokularından Tek Çekirdeklerin İzolasyonu için Basit, Hızlı ve Kısmen Otomatik Bir Protokol

Protokol, doku ayrışma koşulları, tek hücreli süspansiyonların dondurularak saklanması ve izole çekirdeklerin değerlendirilmesi dahil olmak üzere 10x Genomik platformunu kullanarak çoklu dizileme için katı tümör örneklerinden çekirdeklerin izolasyonuna güvenilir ve optimize edilmiş bir yaklaşım sağlar.

Çoklu Dizileme için Taze ve Dondurulmuş Katı Tümör Örneklerinden Optimize Edilmiş Çekirdek İzolasyonu

Beyin dokusunda hücresel heterojenite testlerin çoğu tek hücreli çözünürlük eksikliği nedeniyle kromatin epigenetik işaretlerin çalışma için önemli bir sınırlama teşkil etmektedir. Nöronlar genellikle glia ve diğer non-nöronal hücreler ile iç içe. Biz özü ve insan beyninin nöron çekirdekleri toplamak için bir protokol sağlar.

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Nöronal Çekirdekler İzolasyon

Bu prosedür, birincil fare kemik iliği hematopoetik hücre kültürleri kurmak ve transfeksiyon Gene Verici MXCell elektroporasyon sistemini kullanarak takip nasıl açıklamaktadır.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

Biz postmortem insan beyni superior temporal girus III. Tabakası homojen bir hücre popülasyonu, piramidal nöronlar, RNA izole etmek ve ayıklamak için lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanarak bir süreci tanımlar. Biz (T7 tabanlı) mRNA daha sonra doğrusal yükseltmek. Kullanmakta olduğunuz örnek Affymetrix insan X3P mikroarray melezleşme.

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Tek Hücre Popülasyonlar Yüksek Kalite RNA Alınması

Osteoklastlar vücutta ana kemik-rezorbe hücresi vardır. Çok sayıda osteoklastlar izole etmek için bir yeteneği osteoklast biyoloji anlama konusunda önemli ilerlemelere yol açmıştır. Bu protokol, yetiştirilmesi ve in vitro olarak osteoklast aktivitesi miktarının, izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Kas iskelet farklılaşma özellikle nükleer konumlandırma üzerinde dayanır son derece dinamik bir süreçtir. Burada, yanında canlı hücre düşsel myoblast farklılaşma ve myotube oluşumu sırasında çekirdeği hareketlerini takip ve otomatik izleme bilgileri ayıklanıyor tarafından çekirdek dynamics nicel bir karakterizasyonu gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Parça çekirdeği canlı görüntüleme sırasında Myoblast farklılaşma ve füzyon istismar

Tek çekirdek izolasyonu ayrışma ve hücre zarının deterjan bazlı permeabilizasyonuna, optimizasyona ihtiyaç duyan ve teknik eserlere yatkın adımlara dayanır. Tek çekirdekli RNA-seq (snRNA-Seq) veya ATAC-seq için uygun olan çekirdekleri doğrudan tüm dokudan hızlı bir şekilde izole etmek için deterjan ve enzimsiz bir protokol gösteriyoruz.

Deterjan ve Enzimsiz YöntemLe Tüm Dokudan Çekirdek İzolasyon

Öğrenin beyin ve kemik iliği dokularından yüksek saflıkta çekirdek izolasyonu için optimize edilmiş protokolü. Bu yöntem tek hücreli multiom analizlerinde güvenilir sekanslama verileri sağlar.

Tek Çekirdekli Multiom Tahlilleri için Yüksek Kaliteli Beyin ve Kemik İliği Çekirdeği Hazırlığı

Daha fazla video keşfet