Name: İnsan İskelet Kasının Lif Tipi Tanımlaması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Öğrenin, insan iskelet kasında MyDoBID tekniğiyle tek lif izolasyonu ve miyozin ağır zincir izoformlarına göre lif tipi sınıflandırması yapmayı. Bu yöntem, hücresel düzeyde protein farklılıklarını analiz ederek kas biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada kullanılan MHC I (A4.840) ve MHCIIa'ya (A4.74) karşı antikorlar Dr. HM Blau tarafından geliştirilmiştir ve MHCIIx'e (6H1) karşı antikor Dr. CA Lucas tarafından geliştirilmiştir ve Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü'nün himayesinde ve Iowa Üniversitesi tarafından sürdürülen Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası'ndan (DSHB) elde edilmiştir. Biyolojik Bilimler Bölümü (Iowa City, IA). Bu çalışma için insan kas örneklerini sağladığı için Victoria L. Wyckelsma'ya teşekkür ederiz. Şekil 1'deki görüntülerin çoğu BioRender.com'dan alınmıştır.
Finansman: Bu çalışma hiçbir dış fon almadı.

MyDoBID- Kas Lifi Tiplerini Verimli Bir Şekilde Tanımlamak İçin Yeni Bir Teknik

<ol><li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), e35273(2012).</li>
<li>Wyckelsma, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+specific+differences+in+the+protein+abundances+of+GAPDH+and+Na%28%2B%29%2CK%28%2B%29-ATPase+in+skeletal+muscle+from+aged+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals.</a> Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).</li>
<li>Morales-Scholz, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+type-specific+autophagy+responses+following+an+overnight+fast+and+mixed+meal+ingestion+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).</li>
<li>Tripp, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+fibre+type-dependent+nature+of+calcium-handling+protein+responses+to+sprint+interval+exercise+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle.</a> The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).</li>
<li>Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+cell-specific+differences+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256(2022).</li>
<li>Murphy, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+skeletal+muscle+calpain-3+by+eccentric+exercise+in+humans+does+not+result+in+its+translocation+to+the+nucleus+or+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol.</a> Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).</li>
<li>Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+technique+to+measure+proteins+in+single+segments+of+human+skeletal+muscle+fibers%3A+fiber-type+dependence+of+AMPK-alpha1+and+-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1.</a> Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).</li>
<li>Christiansen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+reliable+and+sample-sparing+method+to+identify+fibre+types+of+single+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6473(2019).</li>
<li>Skelly, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+fiber+type-specific+responses+to+sprint+interval+and+moderate-intensity+continuous+exercise%3A+acute+and+training-induced+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes.</a> Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).</li>
<li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+electrolytes+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Muscle electrolytes in man.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. (SUPPL. 68), 1-110 (1962).</li>
<li>Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suction+applied+to+a+muscle+biopsy+maximizes+sample+size%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%26+Science+in+Sports+%26+Exercise%22%5BJournal%5D)">Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size.</a> Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).</li>
<li>Wyckelsma, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+skeletal+muscle+mitochondrial+content+in+older+adults%3A+relationship+between+mitochondria%2C+fibre+type+and+high-intensity+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training.</a> The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).</li>
<li>Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+type+populations+and+Ca2%2B-activation+properties+of+single+fibers+in+soleus+muscles+from+SHR+and+WKY+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).</li>
<li>Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+considerations+for+protein+analyses+using+antibody+based+techniques%3A+down-sizing+Western+blotting+up-sizes+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes.</a> The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Lif toplama Birkaç yıllık deneyime dayanarak, çoğu araştırmacı bu teknikte ustalaşabilir; Bununla birlikte, uygulama, sonraki analizler için daha hızlı ve daha verimli lif toplamaya yol açar. Havuzlama kalitesinde 30 tek elyaf segmentini izole edebilmek için, numune başına 50 elyaf segmentinin toplanması önerilir. Makul bir standarda ulaşmak için lif toplama videosunu dikkatlice incelemek ve iki uygulama seansı (seans başına ~ 50 lif) gerçekleştirdikten sonra önerilir. Toplanan tüm lifler, tekniğin ne...

İskelet kası, hücrenin (lif) yavaş seğirme (tip I) veya hızlı seğirme (tip II) olmasına bağlı olarak farklı hücresel, metabolik ve kasılma özelliklerine sahip heterojen bir dokudur. Lif tipi, kasılma süresi, kısalma hızı ve yorulma direnci1 dahil olmak üzere çeşitli şekillerde birbirinden farklı olan miyozin ağır zincir (MHC) izoformları incelenerek tanımlanabilir. Başlıca MHC izoformları arasında tip I, tip IIa, tip IIb ve tip IIx bulunur ve metabolik profilleri oksidatif (tip I ve IIa) veya glikolitiktir (IIx, IIb)1. Bu lif tiplerinin oranı kas tipine göre ve türler arasında farklılık gösterir. Tip IIb, kemirgen kasında yaygın olarak bulunur. İnsan kasları herhangi bir tip IIb lifi içermez ve ağırlıklı olarak MHC izoformları tip I ve IIa liflerinden oluşur ve az miktarda IIx lifleri2 bulunur. Protein ekspresyon profilleri farklı lif türleri arasında değişir ve yaşlanma 3, egzersiz 4,5 ve hastalık6 ile değiştirilebilir.
Farklı iskelet kası lifi tiplerinde hücresel yanıtların ölçülmesi, kas homojenatlarının (tüm lif tiplerinin bir karışımı) incelenmesi nedeniyle genellikle göz ardı edilir veya mümkün değildir. Tek lifli western blot, tek tek kas liflerinde birden fazla proteinin araştırılmasına izin verir7. Bu metodoloji daha önce homojenat preparatları kullanılarak elde edilmesi mümkün olmayan yeni ve bilgilendirici tek lifli özellikler üretmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, orijinal tek lifli western blot metodolojisinin, zaman alıcı doğası, numune kopyalarının üretilememesi ve pahalı, hassas gelişmiş kemilüminesans (ECL) reaktiflerinin kullanımı dahil olmak üzere bazı sınırlamaları vardır. Taze doku kullanılıyorsa, bu yöntem, sınırlı bir zaman dilimi içinde (yani 1-2 saat) tek tek lifleri izole etme ihtiyacının zaman kısıtlamaları nedeniyle daha da sınırlıdır. Neyse ki, bu kısıtlama, dondurularak kurutulmuş dokudan tek lifli segmentlerin izole edilmesiyle hafifletilir8. Bununla birlikte, dondurularak kurutulmuş örneklerden lif toplanması, biyopsi yapılan dokunun boyutu ve kalitesi ile sınırlıdır.
Nokta lekeleme yöntemi9 kullanılarak fiber tipi tanımlama, bu kapsamlı protokolde önemli ölçüde detaylandırılmış ve genişletilmiştir. Daha önce, dondurarak kurutma ve tek lifli MHC izoform protein analizi için ~ 2-10 mg kadar az ıslak ağırlık kas dokusunun yeterli olduğu gösterilmiştir9. Christensen ve ark.9, batı lekeleme ile doğrulanan nokta lekeleme ile mevcut MHC izoformunu tespit etmek için ~1 mm'lik bir lif segmentinin %30'unu kullandı. Bu çalışma, batı lekelemenin nokta lekeleme ile değiştirilmesiyle, toplam maliyetlerin ~ 40 kat azaldığını gösterdi (50 elyaf segmenti için). Lifler daha sonra tip I ve tip II numuneler halinde "toplandı", bu da deneysel replikasyonaizin verdi 9. Bununla birlikte, bir sınırlama, yalnızca iki lif tipine özgü numunenin elde edilmesiydi: tip I (MHCI pozitif) ve tip II (MHCII pozitif lifler), tip II numuneler ile MHCIIa ve MHCIIx 6,10 karışımı içerir. Özellikle, mevcut protokol, saf tip IIx fiberlerin nasıl tanımlanabileceğini gösterir ve yaygın protokol sorunları için sorun giderme stratejileri de dahil olmak üzere oldukça ayrıntılı bir iş akışı (Şekil 1'de özetlenmiştir) sağlar.

<table><tbody><tr><td>1x Denatüre etme tamponu</td><td>Tarife göre yapın</td><td>Bileşenler Sigma-Aldrich veya diğer kimyasal dağıtım şirketlerinden temin edilebilir</td><td>&nbsp; 1x denatüre edici tampon, 3x denatüre edici tamponun 1'de 3 V / v'de 1X Tris-HCl (pH 6.8) ile seyreltilmesiyle yapılır. -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>3x Denatüre etme tamponu</td><td>Tarife göre yapın</td><td>Bileşenler Sigma-Aldrich veya diğer kimyasal distribütörlerden temin edilebilir</td><td>3x denatüre edici tampon şunları içerir: 0.125M Tris-HCI, %10 gliserol, %4 SDS, 4 M üre, %10 2-merkaptoetanol ve %0.001 bromofenol mavisi, pH 6.8.&nbsp; -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>% 95 Etanol</td><td>Yok</td><td>% 100 etanol herhangi bir şirketten temin edilebilir</td><td>Ultra saf H 2O ile% 95'e kadar seyreltilir.</td></tr><tr><td>Aktin tavşan poliklonal antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; A2066</td><td>BSA tamponu ile 1.000'de 1 oranında seyreltin.</td></tr><tr><td>Analitik teraziler</td><td>Mettler Toledo</td><td>Model numarası: MSZ042101</td><td></td></tr><tr><td>Antikor arttırıcı</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>32110</td><td>Ürün adı Miser Antibody Extender Solution NC'dir.</td></tr><tr><td>Beher (100 mL)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tezgah üstü santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5452</td><td>Model adı: Mini Spin.</td></tr><tr><td>Engelleme tamponu: Yıkama tamponunda %5 yağsız süt.</td><td>Diploma Mağazası</td><td>satın alınan</td><td></td></tr><tr><td>BSA tamponu: 1 % BSA / PBST,% 0.02 NaN 3</td><td>BSA: Sigma-Aldrich&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; PBS: Bio-Rad Laboratuvarları. NaN3 : Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>BSA: A6003-25G&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10x PBS: 1610780&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; NaN 3 : S2002</td><td>Sığır serum albümini (BSA), Fosfat tamponlu salin (PBS) ve Sodyum azid (NaN 3 ). 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Kaset açma kolu&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>4560000</td><td>Prekast jel kasetlerini açmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Chemidoc MP Görüntüleyici&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>Model numarası: Üniversal başlık III</td><td>Lekesiz jel görüntüleme özelliklerine sahip herhangi bir görüntüleme sistemi.</td></tr><tr><td>Criterion kurutma kağıdı</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>1704070</td><td>Buz torbası, transfer tepsisi, rulo, 2 kaset tutucu, filtre kağıdı, köpük pedler ve kablolu kapak içerir.</td></tr><tr><td>Kriter Hücresi (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>1656001</td><td></td></tr><tr><td>ECL (gelişmiş kemilüminesans)</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>1705062</td><td>Ürün adı: Clarity Max Western ECL Substrat.</td></tr><tr><td>Elektroforez tamponu 1x Tris Glisin SDS (TGS)</td> <td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>1610772</td><td>10x TGS'yi 10'da 1 oranında ultra saf H2O ile seyreltin.</td></tr><tr><td>Filtre kağıdı, 0,34 mm kalınlığında</td><td>Whatmann</td><td>3030917</td><td>Toplu boyut 3 MM, 100 yapraklık paket, 315 x 335 mm.</td></tr><tr><td>İnce doku diseksiyon forseps</td><td>Dumont</td><td>F6521-1EA</td><td>Kuyumcu ' S Forseps No. 5.</td></tr><tr><td>Düz plastik tepsi / kapak&nbsp; &nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Zarı yerleştirmek için yeterince büyük. Yüzeyin tamamen düz olduğundan emin olun.</td></tr><tr><td>Dondurarak Kurutma Sistemi</td><td>Labconco</td><td>7750030</td><td>Freezone 4,5 L, cam hazneli numune tablalı.</td></tr><tr><td>Dondurucu -80 oC&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sabit sıcaklığı -80 °C olan herhangi bir dondurucu; C uygundur.</td></tr><tr><td>Jel ayırıcılar</td><td>1653320</td><td>Bio-Rad</td><td>Membranı toplamak veya hareket ettirmek için membranın altına kaydırın.</td></tr><tr><td>Gri kurşun kalem</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Görüntü laboratuvarı yazılımı&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>N/A</td><td>Şekiller yazılım sürümü 5.2.1'e atıfta bulunur, ancak diğer sürümler de kullanılabilir.</td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>1660521</td><td>37 dereceye ayarlanabilen herhangi bir inkübatör; C yeterli olacaktır.</td></tr><tr><td>Lamba</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pireli manyetik karıştırıcı</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Membran silindiri&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>1651279</td><td>Transfer paket paketinde satın alınabilir. Bununla birlikte, bu ürün mevcut değilse, zarın üzerinden geçecek kadar uzun herhangi bir pürüzsüz yüzeyli silindirik boru yeterli olacaktır.</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri&nbsp; (0,6 mL)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fare IgG HRP ikincil</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31430</td><td>Keçi anti-Fare IgG (H+L), RRID AB_228341. Engelleme tamponunda 20.000'de 1 oranında seyreltin.</td></tr><tr><td>Fare IgM HRP ikincil</td><td>Abcam</td><td>ab97230</td><td>Keçi Anti-Fare IgM mu zinciri. Fare IgG ile aynı seyreltmede kullanın.</td></tr><tr><td>Miyozin Ağır Zincir I (MHCI) primer antikoru</td><td>DSHB</td><td>A4.840&nbsp;</td><td>Seyreltme aralığı: BSA tamponunda 200'de 1 ila 500'de 1.</td></tr><tr><td>Miyozin Ağır Zincir IIa (MHCIIa) primer antikoru</td><td>DSHB</td><td>A4.74&nbsp;</td><td>Seyreltme aralığı: BSA tamponunda 200'de 1 ila 500'de 1.</td></tr><tr><td>Miyozin Ağır Zincir IIx (MHCIIx) birincil antikoru</td><td>DSHB</td><td>6H1</td><td>Seyreltme aralığı: BSA tamponunda 200'de 1 ila 500'de 1.</td></tr><tr><td>Nitroselüloz Membran 0.45 & mikro; m&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td></td><td>Batı lekeleme için 1620115.</td></tr><tr><td>Petri kabı kapağı</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plastik cımbız</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Güç Paketi&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>164-5050</td><td>Ürün adı: Temel güç kaynağı.</td></tr><tr><td>Protein merdiveni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td>PageRuler Önceden Boyanmış Protein Merdiveni, 10 ila 180 kDa.</td></tr><tr><td>PVDF Membran 0.2 ve mikro; m</td><td>Bio-Rad</td><td>Laboratuvarları 1620177</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan HRP ikincil</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31460</td><td>Keçi anti-Tavşan IgG (H + L), RRID AB_228341. Seyreltme, fare ikincil antikorları ile aynıdır.</td></tr><tr><td>Rocker</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cetvel</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>Sıyırma tamponu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21059</td><td>Ürün adı: Western Blot Sıyırma Tamponunu Geri Yükleyin.</td></tr><tr><td>Kağıt mendil (tüy bırakmayan)</td><td>Kimberly-Clark professional</td><td>34120</td><td>Ürün adı: Kimwipe.</td></tr><tr><td>Transfer tamponu (1x Tris Glisin tamponu (TG)%20 Metanol)</td><td>TG: Bio-Rad Laboratuvarları&nbsp; &nbsp; Metanol: Merck</td><td>TG tamponu: 1610771&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Metanol: 1.06018</td>, <td>ultra saf H2O ila 1x ile 10x TG tamponunu seyreltin. %20 Metanol nihai konsantrasyonuna %100 Metanol ekleyin. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Transfer tepsisi</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>1704089</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; UV aktivasyonlu prekast jel</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>5678085</td><td>Jel tipi: 4&ndash; %15 Criterion TGX Lekesiz Protein Jeli, 26 kuyucuk, 15 &mikro; L.</td></tr><tr><td>Vorteks</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Yıkama tamponu (1x TBST)</td><td>10x TBS: Astral Bilimsel&nbsp; Ara 20: Sigma</td><td>&nbsp; BIOA0027-4L</td><td>1x TBST tarifi: 10x Tris tamponlu salin (TBS), ultra saf H2O ile 1x'e kadar seyreltilir, Tween 20,% 0.1'lik bir nihai konsantrasyona eklenir. Tamponu 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Yıkama kapları</td><td>Sistema</td><td>Store satın aldı</td><td>Membranın yaklaşık boyutlarına uyan herhangi bir tupperware kabı yeterli olacaktır.</td></tr></tbody></table>

İnsan İskelet kasının lif tipi tanımlaması

Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle

Burada tarif edilen teknik, nokta lekeleme kullanılarak bireysel kas liflerinin segmentlerinde spesifik miyozin ağır zincir (MHC) izoformlarını tanımlamak için kullanılabilir, bundan sonra kas lifi tipinin (MyDoBID) IDgirişi için Dot Blotting tarafından osinağır zincir tespitim olarak anılacaktır. Bu protokol, insan iskelet kasının dondurularak kurutulması ve tek kas liflerinin segmentlerinin izole edilmesi sürecini açıklar. MyDoBID kullanılarak, tip I ve II fiberler sırasıyla MHCI ve IIa'ya özgü antikorlarla sınıflandırılır. Sınıflandırılmış lifler daha sonra her biyopsi için lif tipine özgü örneklerde birleştirilir.
Her numunedeki toplam protein, Sodyum Dodesil-Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ve UV ile aktive olan jel teknolojisi ile belirlenir. Numunelerin lif tipi, western blotlama kullanılarak doğrulanır. Birden fazla batı lekesinde hedef protein tespitini geliştirmek için protein yükleme normalizasyonu gerçekleştirmenin önemi de açıklanmaktadır. Sınıflandırılmış elyafları, tek lifli western blotlara kıyasla elyaf tipine özgü numuneler halinde birleştirmenin faydaları arasında numune çok yönlülüğü, artan numune verimi, daha kısa süreli yatırım ve maliyet tasarrufu önlemleri yer alırken, homojenize kas numuneleri kullanılarak sıklıkla gözden kaçan elyaf tipine özgü değerli bilgiler korunur. Protokolün amacı, dondurularak kurutulmuş insan iskelet kası örneklerinden izole edilen tip I ve tip II liflerin doğru ve verimli bir şekilde tanımlanmasını sağlamaktır.
Bu münferit lifler daha sonra tip I ve tip II lif tipine özgü numuneler oluşturmak için birleştirilir. Ayrıca, protokol, batı blotlama ile IIx lifleri olarak doğrulanan MHCI ve MHCIIa için negatif olan lifler için bir belirteç olarak Aktin kullanılarak tip IIx liflerin tanımlanmasını içerecek şekilde genişletilmiştir. Her lif tipine özgü numune daha sonra batı blotlama teknikleri kullanılarak çeşitli hedef proteinlerin ekspresyonunu ölçmek için kullanılır.

Nokta lekeleme kullanılarak bireysel MHCI, MHCIIa ve MHCIIx kas liflerinin tanımlanması MyDoBID'in bir özelliği, belirli bir fiberde değişen MHC ve Aktin sinyal yoğunluğu gücünün kategorize edilmesidir (Şekil 4A). Lif tipi, MHCI ve IIa izoformlarının varlığı veya yokluğu ile tanımlandı (Şekil 4B). Altı lif, MHC veya aktin tespiti göstermedi, bu da lif toplanmadığını gösterdi. Bu spesifik nokta lekesinin sonuçları, 22 tip II fiber, 7 tip I fib...

Bu protokol, dondurularak kurutulmuş insan iskelet kasından tek lif izolasyonunu ve nokta lekeleme tekniği kullanılarak Miyozin ağır zincir (MHC) izoformuna göre lif tipi sınıflandırmayı gösterir. Tanımlanan MHC I ve II lif örnekleri daha sonra western blotlama kullanılarak protein ekspresyonunda lif tipine özgü farklılıklar için daha fazla analiz edilebilir.

İnsan İskelet Kasının Lif Tipi Tanımlaması

The technique described here can be used to identify specific myosin heavy chain (MHC) isoforms in segments of individual muscle fibers using dot ...

Araştırmamız, yavaş veya hızlı kasılan lifler olarak karakterize edilen, ayırt edici metabolik ve kasılma özelliklerine sahip hücrelerden oluşan iskelet kası etrafında toplanmaktadır. Bu farklılıklara katkıda bulunan faktörleri araştırıyoruz ve bunların yaşlanma, egzersiz ve çeşitli hastalıklar bağlamındaki etkilerini araştırıyoruz. Farklı iskelet kası liflerindeki hücresel yanıtların ölçülmesi genellikle göz ardı edilir veya kas homojenatlarının incelenmesi nedeniyle mümkün değildir.MyDoBID tekniği, daha önce ölçülmesi imkansız olan lif tipi protein farklılıklarını tekrar tekrar analiz etmemizi sağlar. Bu protokol, dondurularak kurutulmuş insan iskelet kası örneklerinden tip bir ve tip iki kas liflerini doğru ve verimli bir şekilde tanımlar. Bu yeni revize edilmiş yöntem, araştırmacıların iskelet kasındaki protein farklılıklarını hücresel düzeyde araştırmaları için basit bir yaklaşım sunmaktadır.Özellikle, tip iki X liflerinin tanımlanmasını kolaylaştırır ve bunların tarihsel olarak ayırt edilmesi zor olmuştur. Teknik, araştırmacıların, zor tip iki X lifi de dahil olmak üzere tüm lif türlerine ışık tutmasını sağlar. MyDoBID tekniği ile artık çok sayıda soru cevaplanabiliyor.Örneği

fiber-type-identification-of-human-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, hücre altı glikojen dağılımını görselleştirmek ve ölçmek için insan iskelet kası dokusunun numune hazırlığını ve transmisyon elektron mikroskobu için boyanmasını gösteriyoruz.

İnsan İskelet Kaslarında Glikojen Dağılımını Ölçmek için Transmisyon Elektron Mikroskobu

Burada, geliştirilmiş boyama kalitesini ve böylece otomatik satın alma ve serbestçe yazılım ImageJ kullanılarak fiber popülasyonları ölçümü sağlar hızlı kas lifi analiz için bir protokol mevcut.

Miyosin Ağır Zincir İmünohistokimya kullanma Sıçan kas Çapraz Bölüm kas Elyaf Nüfus Analizi İçin Hızlı Otomatik Protokolü

İmmunohistokimyasal myosin ağır zincir izoformlarının boyama iskelet kas lif tipi state-of--art ayrıştırıcı çıkmıştır (Yani, tip ı, IIA yazın, yazın IIX, IIB yazın). Burada, bir boyama protokol hızlı fiber türü ve lif morfolojisi değerlendirilmesi kolaylaştırır bir roman yarı otomatik algoritması ile birlikte mevcut.

Fare kas iskelet morfoloji ve Fiber türü kompozisyon yarı otomatik analizi

Bu teknik rapor, lif hasarını sınırlayan musculus tibialis anterior biyopsisi için modifiye Bergström tekniğinin bir varyasyonu açıklanmaktadır.

Mekanik Değerlendirme için İnsan Musculus Tibialis Anterior Üstün Bölmesi İskelet Kas Biyopsileri Toplama

Nöromüsküler kavşak bileşenlerini doğru bir şekilde tespit edebilme yeteneği, patolojik veya gelişimsel süreçler nedeniyle mimarisindeki değişikliklerin değerlendirilmesinde çok önemlidir. Burada, nicel ölçümler yapmak için kullanılabilecek tam montajlı nöromüsküler kavşakların yüksek kaliteli görüntülerini elde etmek için basit bir yöntemin tam bir açıklamasını sunuyoruz.

Tüm Mount Nöromüsküler Kavşakların İmmünofluoresan ve Morfometrik Analizleri için Tek İskelet Kas Liflerinin Diseksiyonu

Artan kanıtlar, iskelet kası içindeki lipitlerin aşırı infiltrasyonunun lipotoksisite ve diyabet ile sonuçlandığını göstermektedir. Burada, lipit damlacıklarının boyutunu, yoğunluğunu ve hücre altı dağılımını lif tipine özgü bir şekilde ölçmek için doku işleme, Bodipy ile boyama, görüntü elde etme ve analiz dahil olmak üzere eksiksiz bir protokol sunuyoruz.

İskelet Kasında Lipid Damlacık İçeriğinin Lif Tipi ve Subhücresel-Spesifik Analizi

Yetişkin farelerin altı kasından farklı uzunluk ve tiplerde enzimatik olarak ayrışmış lifler elde etmek için bir protokol tarif ediyoruz: bunlardan üçü daha önce tarif edildi (fleksör digitorum brevis, ekstansör digitorum longus, soleus) ve üçü ilk kez başarılı bir şekilde ayrıştı (ekstansör hallusis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Farelerin Altı Arka Bacak Kasının Enzimatik Ayrışmasıyla Elde Edilen Sağlam Kısa, Orta ve Uzun İskelet Kası Lifleri: Fleksör Digitorum Brevis'in Ötesinde

Bu protokol, oksidatif soleus'tan sağlam tek kas liflerinin izole edilmesini ve bu liflerden türetilen yüksek saf miyoblast kültürlerinin oluşturulmasını açıklar. Optimize edilmiş prosedür, fare başına yaklaşık 300–500 sağlam miyofiber elde ederek sonraki moleküler ve hücresel analizleri mümkün kılar.

Oksidatif Miyofiber Davranışının Değerlendirilmesi İçin Tek Lifli İzolasyon Testi

Aynı dizide karışık katyonik işlevselliğe sahip peptoidleri sentezlemek için bir protokol sunulmuştur (lizin ve arginin tipi monomerler). Bu bileşiklerin, kutanöz leishmaniasis'e neden olan protozoan parazitler olan Leishmania mexicana'ya karşı daha sonraki testleri de açıklanmaktadır.

Bunların Anti layişmanya Faaliyet karışık Lizin tipi / Arjinin-monomerleri ve Değerlendirilmesi peptoidler Sentezi için etkili bir yöntem

Yağ asitlerini saflaştırmaya gerek kalmadan tanımlamak için bir protokol öneriyoruz. Tutma süreleri hakkındaki bilgileri üç tip yağ asidi türevinin kütle spektrumları ile birleştirir: yağ asidi metil esterleri (FAME'ler), 4,4-dimetil oksazolin türevleri (DMOX) ve 3-piridilkarbinil esterler (pikolinil).

Yağ Asitlerinin Tanımlanması içinde<em&gt; Bacillus cereus</em

Öğrenin, insan iskelet kasında MyDoBID tekniğiyle tek lif izolasyonu ve miyozin ağır zincir izoformlarına göre lif tipi sınıflandırması yapmayı. Bu yöntem, hücresel düzeyde protein farklılıklarını analiz ederek kas biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

İnsan İskelet Kasının Lif Tipi Tanımlaması

Daha fazla video keşfet