Omurgalı Retinasında İç Nükleer Tabaka Nöronlarını İncelemek için Geliştirilmiş Bir Düz Montaj Preparatı Olarak Bölünmüş Retina
January 16th, 2024
Bu çalışma, fotoreseptör hücre gövdelerinin çıkarılmasının daha hızlı antikor difüzyonu ve immünohistokimya, in situ hibridizasyon ve elektrofizyoloji deneyleri için iç retinal nöronlara gelişmiş yama pipet erişimi sağladığı alternatif bir düz montajlı retina preparatı sunmaktadır.
Grubumuz, retinadaki görsel işlemenin altında yatan nöronal devre ve sinaptik mekanizmalarla ilgilenmektedir. Morgans Laboratuvarı, bipolar hücrelerde ışık adaptasyonunun moleküler mekanizmalarını araştırıyor ve Sivyer Laboratuvarı, iç retinal nöronların ganglion hücre fonksiyonuna nasıl katkıda bulunduğuyla ilgileniyor. Tüm retina dağındaki internükleer tabaka nöronlarına erişmek, hem anatomik hem de fizyolojik çalışmalar için bir zorluktur.
Çekirdekler arası katman nöronlarına dikey bölümlerde erişilebilir, ancak görüş alanında çok az sayıda nöron bulunur. Ayrıca, dilimleme, fizyolojik çalışmaları etkileyebilecek yanal süreçleri ve bağlantıları keser. Bölünmüş retina tekniğinde fotoreseptörlerin çıkarılması, iç retinaya antikor difüzyonunu önemli ölçüde iyileştirir, bu da iç retina hedeflerinin immüno-etiketlemesini geleneksel tüm retina mount retinaya kıyasla 20 kat daha hızlı hale getirir.
Bölünmüş retina ayrıca yama kelepçesi elektrofizyolojisi sırasında internükleer katman nöronlarına erişimi büyük ölçüde geliştirir. Bölünmüş retina tekniği yeni yaklaşımlara kapı açacak ve deneylerimizin hızını artıracaktır. Örneğin, bipolar hücrelerde channelrhodopsin eksprese ederek melanopsin ganglion hücrelerine bipolar hücre girdilerini incelemek için bu tekniği kullanmayı planlıyoruz.
Genel Bakış
Bu çalışma, antikor difüzyonunu artıran ve iç retina nöronlarına daha iyi erişimi kolaylaştıran yeni bir flatmount retina preparasyonunu tanıtmaktadır. Teknik, immünohistokimya, in situ hibridizasyon ve elektrofizyoloji deneylerinin verimliliğini önemli ölçüde artırmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Retina biyolojisi
- Elektrofizyoloji
Arka Plan
- Morgans Laboratuvarı, bipolar hücrelerde ışık adaptasyon mekanizmalarını inceler.
- Sivyer Laboratuvarı, iç retina nöronları ve ganglion hücre fonksiyonlarındaki rollerine odaklanır.
- Geleneksel tam dağılım teknikleri, iç çekirdekli katman nöronlarının incelenmesinde zorluklar yaratır.
- Fotoreseptörlerin çıkarılması, daha iyi erişime olanak tanır ve antikor etiketleme süresini azaltır.
Çalışmanın Amacı
- İç retina nöronlarına daha hızlı erişime izin veren bir yöntem geliştirmek.
- Immün etiketleme ve elektrofizyolojik deneylerin verimliliğini artırmak.
- Melanopsin ganglion hücrelerine bipolar hücre girdilerini daha fazla araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Flatmount retinayı hazırlamak için ex vivo retina diseksiyon tekniği kullanılmıştır.
- Biyolojik model, fare gözlerinden retinanın diseksiyonunu ve iç çekirdekli katman nöronlarına erişime olanak tanır.
- Analiz için immünofloresan ve elektrofizyolojik teknikler kullanılmıştır.
- Kritik adımlar arasında dikkatli diseksiyon, PBS'de yıkama ve karbogene Ames ortamına transfer işlemleri yer almıştır.
- Antikor difüzyonu, bir saatlik inkübasyon sonrasında değerlendirilmiştir.
Ana Sonuçlar
- Yeni teknik, antikor difüzyonunun geleneksel yöntemlere göre 20 kat daha hızlı olduğunu göstermiştir.
- Preparasyon süreci boyunca fotoreseptör sinaptik bütünlüğü korunmuştur.
- Bölünme sonrasında hücre canlılığında bölgesel değişkenlik gözlemlenmiş, ancak çoğu retina hücresi canlı kalmıştır.
- İmmünofloresan sonuçları, fotoreseptör sinaptik terminallerinin korunulduğunu doğrulamıştır.
Sonuçlar
- Bu yöntem, çeşitli deneysel yaklaşımlar için iç retina nöronlarına daha kolay erişime olanak tanır.
- Immün etiketleme ve fizyolojik çalışmaların hızını ve verimliliğini artırır.
- Bulgular, retinadaki nöronal mekanizmalar üzerinde daha fazla araştırma için önemli çıkarımlara sahip olabilir.
