Name: Dehücreli Akciğer Ekstraselüler Matriks Hidrojellerinin Geliştirilmesi ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Öğrenin, sığır akciğer dokusunun dehücrelendirilmesi ve ekstraselüler matris hidrojellerinin yeniden oluşturulması yöntemleriyle organotipik akciğer doku modellerinin nasıl geliştirildiğini. Mekanik özelliklerin hücresel davranışlar üzerindeki etkisini keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK) tarafından desteklenmiştir (Hibe No. 118C238). Yayının/bildirinin tüm sorumluluğu yayın sahibine aittir. TÜBİTAK'tan alınan maddi destek, yayının içeriğinin TÜBİTAK tarafından bilimsel anlamda onaylandığı anlamına gelmemektedir. Yazarlar, Koç Üniversitesi Translasyonel Tıp Araştırma Merkezi'nin (KUTTAM) hizmet ve olanaklarından yararlanmalarını minnetle kabul ederler. Şekil 1 ve Şekil 2a, Biorender.com kullanılarak oluşturulmuştur.

Genç (1-2 yaş) sığır donörlerinden taze yerli akciğerler, yerel bir mezbahadan elde edildi ve buz üzerinde kapalı bir plastik kapta laboratuvara taşındı. Hayvan kurbanı, genel et tüketimi (atık olarak atılan akciğerler) için yapılır ve çalışma ile ilgili veya çalışma nedeniyle değildir. Kesimhanenin ulusal hayvan kurban etme yasalarına ve yönetmeliklerine uygun olduğunu onaylıyoruz. Ayrıca, sadece atık malzeme kullandığımızı ve araştırma projesinin kurban edilen hayvan sayısı üzerinde bir etkisi olmadığını teyit ediyoruz.
1. Organların toplanması ve doku hazırlığı
<ol><li>Deneye kadar taze elde edilen sığır akciğer dokularını -80 °C'de saklayın.</li>
	<li>Deney günü, donmuş akciğer dokularının oda sıcaklığında çözülmesini bekleyin.</li>
	<li>Trakea ve kıkırdaklı hava yollarını çıkarmak için dokuları steril neşter ve makasla inceleyin ve küçük parçalara ayırın (5 mm3).</li>
	<li>En az 3x %2 penisilin / streptomisin (P / S) içeren ultra saf su ile iyice yıkayın.</li>
</ol>2. Dokuların hücresizleştirilmesi
NOT: Doğal sığır akciğer dokuları iki farklı protokol kullanılarak hücreden arındırılmıştır.
<ol><li>Donma-çözülme yöntemi<ol><li>Doku örneklerini 1. adıma göre hazırlayın. Kıyılmış dokuları steril damıtılmış suda (dH2O) 1 dakika boyunca% 2 iyot çözeltisine daldırın. Steril dH2O'da art arda iki yıkama gerçekleştirin.</li>
		<li>Kıyılmış doku parçalarını 15 mL seviyesine kadar 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve taşınabilir bir sıvı nitrojen kabı kullanarak beş manuel donma-çözülme döngüsü uygulayın. Tüpleri steril dH2O ile doldurun ve tüpleri sıvı nitrojen içinde 2 dakika dondurun. 2 dakika sonra hemen 10 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna aktarın. Bu, 1 döngü donma-çözülme oluşturur.</li>
		<li>Numuneleri 10 mL DNaz çözeltisi (10 U/mL) ile 10 mM MgCl2 tamponunda (pH 7.5) 100 rpm'de sabit çalkalama altında 37 °C'de 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>Her 24 saatte bir çözelti ikmali ile 100 rpm'de sürekli çalkalayarak 3 gün boyunca steril dH2O ile kapsamlı bir yıkamaya devam edin.</li>
		<li>Liyofilizasyon ve kriyofrezelemeyi aşağıdaki gibi gerçekleştirin20: Islak dECM numunelerini -80 °C'de 24 saat dondurun. Dondurulmuş numuneleri bir liyofilizatöre aktarın ve tamamen kuruyana kadar 3 ila 4 gün vakum altında kurutma modunda çalıştırın. Dondurarak kurutmanın tamamlanmasının ardından, bir öğütme aparatı ve kuru buz kullanarak numunelerin ince bir toz formuna öğütülmesini gerçekleştirin. NOT: Bu ince toz hali, sindirim işleminin sonraki aşamalarında gelişmiş çözünürlük özellikleri nedeniyle gerekli kabul edilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Triton-X-100 yöntemi<ol><li>Doku örneklerini 1. adıma göre hazırlayın. Akciğer dokularını 4 ° C'de hafif rotasyon altında 3 gün boyunca% 1 Triton-X-100 ile tedavi edin. Her 24 saatte bir değişim çözümü.</li>
		<li>Numuneleri DNaz çözeltisi (10U/mL) ile 10 mM MgCl2 tamponunda (pH 7.5) 37 °C'de 1 saat sabit çalkalama altında inkübe edin.</li>
		<li>Her 24 saatte bir çözelti ikmali ile yumuşak rotasyon altında 3 gün boyunca steril dH2O ile kapsamlı bir yıkamaya devam edin.</li>
		<li>Liyofilizasyonu ve ardından adım 2.1'de açıklandığı gibi kriyo-frezelemeyi gerçekleştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Pepsin sindirimi
<ol><li>Toz haline getirilmiş dECM örneklerini pepsin çözeltisi içinde 15 mg/mL (a/h) konsantrasyonda sindirin (0.01 M HCl, pH 2 içinde 1 mg/mL pepsin). Etkili parçalama için numune parçalama işlemini oda sıcaklığında 48 saat boyunca sürekli karıştırarak gerçekleştirin ve çözeltinin pH'ını sık sık koruyun.</li>
	<li>Digestleri bir tüpe aktarın ve 5000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı toplayın ve 5M NaOH ve 10x PBS ilavesiyle fizyolojik koşullara (pH 7, 1x fosfat tampon salin (PBS)) nötralize edin ve tamponlayın. NOT: Asidik sindirimin pH ayarlaması için konsantre alkali çözeltilerin kullanılması önerilir, çünkü bu yaklaşım, sonraki adımlarda jelleşmeyi zararlı bir şekilde etkileyebilecek istenmeyen hacim genişlemesini önler.</li>
	<li>Daha ileri çalışmalar için ön jel sindirimlerini −20 °C'de saklayın.</li>
</ol>4. Histolojik boyama
<ol><li>Gece boyunca 4 ° C'de 1 mL %3.7 formaldehit çözeltisi içinde hücreden arındırılmış doku örneğinin küçük bir kısmını (5 mm3) sabitleyin.</li>
	<li>PBS'de 1 ml% 30 sükroz çözeltisi içeren tüplerdeki dokuları sabit bir kaya üzerinde 4 ° C'de 12 saat inkübe edin.</li>
	<li>Dokuları optimum kesme sıcaklığı bileşiğine (OCT) gömmek için, bir kriyokalıba 1 mL OCT dökün, dokuyu kriyokalıbın ortasına yerleştirin, ardından dokunun üzerine 2 mL OCT dökün.</li>
	<li>Doku içeren kriyokalıpları kuru buz üzerine yerleştirin ve sıvı nitrojen kullanarak dondurun. OCT tamamen beyaza döndüğünde numuneler hazırdır, bu genellikle 3 dakika sürer. OCT gömülü dokuları kullanana kadar -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>Poli-L-lizin kaplı bir cam slayt üzerinde -25 ° C'de kriyostatta 10 μm'lik kesitler elde edin ve doku bölümünün slayt üzerinde erimesini sağlamak için slaytı oda sıcaklığına aktarın. Slaytları kullanana kadar -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>Hücreden arındırmadan sonra çekirdeğin yokluğunu doğrulamak için, aşağıda açıklandığı gibi bir Hematoksilen ve Eozin (H & E) boyaması gerçekleştirin.<ol><li>Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Slaytları PBS'ye daldırın ve kullanıma hazır 50 mL hematoksilen çözeltisi ile bir boyama kavanozunda 3 dakika boyayın, ardından 3 dakika musluk suyuyla yıkayın.</li>
		<li>Slaytları %95 etanole batırın ve 50 mL %0.5 alkollü Eosin çözeltisi ile bir boyama kavanozunda 45 saniye boyayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreden arındırma işleminden sonra kollajen içeriğinin korunduğunu göstermek için Sirius kırmızı boyama yapın.<ol><li>Slaytları PBS ile nemlendirin ve 1 saat boyunca bir boyama kavanozunda doymuş sulu pikrik asit çözeltisinde 50 mL% 0.1 Sirius kırmızısına daldırın.</li>
		<li>Slaytları %0,5 asetik asit solüsyonunda 5 saniye durulayın ve tüm slaytları sırayla %70, %95 ve %100 etanole her biri 1 dakika bekleterek kurutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Doku örneklerindeki sGAG içeriğini analiz etmek için, aşağıda açıklandığı gibi Alcian mavisi boyama yapın.<ol><li>Slaytları 50 mL %1 Alcian mavisi içinde %3 asetik asit çözeltisine (pH 2.5) 30 dakika boyama kavanozuna daldırın. Slaytları akan musluk suyuyla 2 dakika yıkayın.</li>
		<li>Tüm slaytları sırayla %70, %95 ve %100 etanole 1 dakika batırarak kurutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Numunelerin üzerine 0,1 mL montaj ortamı ekleyin ve 10x büyütme kullanarak ışık mikroskobu kullanarak görselleştirin.</li>
</ol>5. Mekanik karakterizasyon
<ol><li>Paralel plaka geometrisine sahip bir reometre kullanarak salınımlı reoloji ölçümleri uygulayın.</li>
	<li>Hızlı jelleşmeyi önlemek için buz üzerinde tutulan 250 μL ön jel solüsyonunu önceden soğutulmuş (4 °C) bir alt plakaya dökün.</li>
	<li>Ön jel çözeltisi iki plaka arasında 1 mm boşluk genişliğine sahip bir disk oluşturana kadar 20 mm paralel plakayı indirin.</li>
	<li>Ölçümü hemen başlatın. Jelleşme kinetiğini gözlemlemek için alt plakayı 30 dakika boyunca 37 °C'ye ısıtırken sabit bir frekans ve gerinim ile zaman içindeki depolama ve kayıp modüllerini ölçün. 0,5 Hz sabit frekans ve %0,1 gerinim kullanın.</li>
	<li>Depolama modülü değerinin artması durduktan ve bir platoya ulaştıktan sonra bir sürünme-kurtarma testi gerçekleştirin.</li>
	<li>Hidrojele 15 dakika boyunca 1 Pa kesme gerilimi uygulayın, gerilimi ölçün, numuneyi gerilimden boşaltın ve gerinim değerindeki değişikliği 15 dakika boyunca kaydedin.</li>
	<li>Stresi gevşetme davranışını göstermek için bir gerilme-zaman grafiği çizin. Üç farklı dECM özeti için ölçümleri kopya olarak tekrarlayın.</li>
</ol>

Sığır Akciğeri ECM Hidrojelleri için Decellularizasyon Tekniklerinin Karşılaştırmalı Çalışması

<ol><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+micropattern+arrays+fabricated+by+lung-derived+dECM+hydrogels+for+chemotherapeutic+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Ordered micropattern arrays fabricated by lung-derived dECM hydrogels for chemotherapeutic drug screening.</a> Mater Today Bio. 15, 100274(2022).</li>
<li>Ulldemolins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+extracellular+matrix+hydrogels-derived+vesicles+contribute+to+epithelial+lung+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Lung extracellular matrix hydrogels-derived vesicles contribute to epithelial lung repair.</a> Polymers. 14 (22), 4907(2022).</li>
<li>Biehl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+standardized+multi-tissue+decellularization+protocol+for+the+derivation+of+extracellular+matrix+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Towards a standardized multi-tissue decellularization protocol for the derivation of extracellular matrix materials.</a> Biomater Sci. 11 (2), 641-654 (2023).</li>
<li>Pak, J., Lee, J. H., Park, K. S., Jeong, B. C., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+cartilage+in+human+knee+osteoarthritis+with+autologous+adipose+tissue-derived+stem+cells+and+autologous+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biores+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Regeneration of cartilage in human knee osteoarthritis with autologous adipose tissue-derived stem cells and autologous extracellular matrix.</a> Biores Open Access. 5 (1), 192-200 (2016).</li>
<li>Spang, M. T., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22In+vivo+applications+and+development.Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogel therapies.</a> In vivo applications and development.Acta Biomater. 68, 1-14 (2018).</li>
<li>Schwartz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomaterial+screening+approach+reveals+microenvironmental+mechanisms+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">A biomaterial screening approach reveals microenvironmental mechanisms of drug resistance.</a> Integr Biol. 9 (12), 912-924 (2017).</li>
<li>Monteiro, M. V., Gaspar, V. M., Ferreira, L. P., Mano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+3D+in+vitro+tumor+models+for+screening+cell+aggregation+mediated+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Hydrogel 3D in vitro tumor models for screening cell aggregation mediated drug response.</a> Biomater Sci. 8 (7), 1855-1864 (2020).</li>
<li>Nakamura, R., Nakamura, F., Fukunaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+composition+of+the+extracellular+matrix+accumulated+by+mesenchymal+stem+cells+during+in+vitro+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Sci+J%22%5BJournal%5D)">Changes in the composition of the extracellular matrix accumulated by mesenchymal stem cells during in vitro expansion.</a> Anim Sci J. 85 (6), 706-713 (2014).</li>
<li>Bual, R. P., Ijima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+extracellular+matrix+component+promotes+maintenance+of+liver-specific+functions+and+larger+aggregates+formation+of+primary+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Intact extracellular matrix component promotes maintenance of liver-specific functions and larger aggregates formation of primary rat hepatocytes.</a> Regen Ther. 11, 258-268 (2019).</li>
<li>Jhala, D., Vasita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+extracellular+matrix+mimicking+strategies+for+an+artificial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Poly+Rev%22%5BJournal%5D)">A review on extracellular matrix mimicking strategies for an artificial stem cell niche.</a> Poly Rev. 55 (4), 561-595 (2015).</li>
<li>Jeong, W., Kim, M. K., Kang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+detergent+type+on+the+performance+of+liver+decellularized+extracellular+matrix-based+bio-inks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Effect of detergent type on the performance of liver decellularized extracellular matrix-based bio-inks.</a> J Tissue Eng. 12, 2041731421997091(2021).</li>
<li>Lee, S. J., Lee, J. H., Park, J., Kim, W. D., Park, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+3D+printing+scaffold+with+porcine+skin+decellularized+bio-ink+for+soft+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 3D printing scaffold with porcine skin decellularized bio-ink for soft tissue engineering.</a> Materials. 13 (16), 3522(2020).</li>
<li>Won, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+dermal+substitute+using+decellularized+dermis+extracellular+matrix+derived+bio-ink%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Cells+Nanomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A potential dermal substitute using decellularized dermis extracellular matrix derived bio-ink.</a> Artif Cells Nanomed Biotechnol. 47 (1), 644-649 (2019).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+decellularized+extracellular+matrix+hydrogel+microspheres+fabricated+using+a+temperature-controlling+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioactive decellularized extracellular matrix hydrogel microspheres fabricated using a temperature-controlling microfluidic system.</a> ACS Biomater Sci Eng. 8 (4), 1644-1655 (2022).</li>
<li>Kaushik, N., Kim, S., Suh, Y., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinvasive+extracellular+matrix+remodeling+for+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Proinvasive extracellular matrix remodeling for tumor progression.</a> Arch Pharm Res. 42 (1), 40-47 (2019).</li>
<li>Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+a+dynamic+niche+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression.</a> J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).</li>
<li>Poltavets, V., Kochetkova, M., Pitson, S. M., Samuel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+extracellular+matrix+and+its+molecular+and+cellular+regulators+in+cancer+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of the extracellular matrix and its molecular and cellular regulators in cancer cell plasticity.</a> Front Oncol. 8, 431(2018).</li>
<li>Takeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+drug+screening+system+using+three-dimensional+cardiac+tissues+containing+multiple+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Development of a drug screening system using three-dimensional cardiac tissues containing multiple cell types.</a> Sci Rep. 11 (1), 5654(2021).</li>
<li>Jensen, A. R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific%2C+fibroblast-derived+matrix+as+a+tool+for+studying+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Organ-specific, fibroblast-derived matrix as a tool for studying breast cancer metastasis.</a> Cancers (Basel). 13 (13), 3331(2021).</li>
<li>Kuşoğlu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+decellularization+methods+in+bovine+lung+tissue+reveals+distinct+biochemical+composition%2C+stiffness%2C+and+viscoelasticity+in+reconstituted+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Different decellularization methods in bovine lung tissue reveals distinct biochemical composition, stiffness, and viscoelasticity in reconstituted hydrogels.</a> ACS Appl Bio Mater. 6 (2), 793-805 (2023).</li>
<li>Fernández-Pérez, J., Ahearne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+decellularization+methods+on+extracellular+matrix+derived+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels.</a> Sci Rep. 9 (1), 14933(2019).</li>
<li>Park, S., Kim, T. H., Kim, S. H., You, S., Jung, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+vascularized+lung+cancer-on-a-chip+with+lung+extracellular+matrix+hydrogels+for+in+vitro+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional vascularized lung cancer-on-a-chip with lung extracellular matrix hydrogels for in vitro screening.</a> Cancers (Basel). 13 (16), 3930(2021).</li>
<li>Uriarte, J. J., Uhl, F. E., Rolandsson Enes, S. E., Pouliot, R. A., Weiss, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+bioengineering%3A+advances+and+challenges+in+lung+decellularization+and+recellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Lung bioengineering: advances and challenges in lung decellularization and recellularization.</a> Curr Opin Organ Transplant. 23 (6), 673-678 (2018).</li>
<li>Roth, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+freeze-thaw+cycles+for+decellularization+of+tendon+tissue+-+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Automated freeze-thaw cycles for decellularization of tendon tissue - a pilot study.</a> BMC Biotechnol. 17 (1), 13(2017).</li>
<li>Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+DNA+in+biologic+scaffold+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification of DNA in biologic scaffold materials.</a> J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Cox, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+matrix+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The matrix in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).</li>
<li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+forces+direct+stem+cell+behaviour+in+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 728-742 (2017).</li>
<li>Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+extracellular+matrix+viscoelasticity+on+cellular+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour.</a> Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).</li>
<li>Chaudhuri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+tunable+stress+relaxation+regulate+stem+cell+fate+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity.</a> Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).</li>
</ol>

Tüm yazarlar hiçbir rakip mali çıkar beyan etmezler.

Organ kaynaklı hidrojeller, doğal doku ECM'sini özetleyen ve organotipik hücresel fonksiyonu taklit eden umut verici modeller haline gelmiştir. Hücre dışı akciğer ECM'si doku mühendisliğinde sıklıkla kullanılmış olsa da, biyomateryal bileşiminin ve mekanik özelliklerin kapsamlı bir karakterizasyonu, homeostaz veya hastalık sırasında biyolojik süreçleri modellemek için hücre-ECM etkileşimlerinin nasıl modüle edilebileceğinin daha iyi anlaşılmasına fayda sağlayacaktır. Özellikle, sulandırılmış hidrojellerin sertlik ve visk...

Konvansiyonel tek tabakalı kültür koşulları, doğal doku mikro ortamlarının sadık bir temsilini sunmaz ve hücre-matris ve hücre-hücre etkileşimlerini sağlayan öğretici ligandlarla üç boyutlu (3D) bir iskele sağlama yeteneğinden yoksundur1. Ekstraselüler matriks (ECM) bileşimi ve mekanik özellikleri oldukça dokuya özgüdür, zamana bağlıdır ve patolojik durumlarda değişikliklere uğrar. Bu nedenle, bu özelliklerin ayarlanabilirliğine, hücresel davranışın modülasyonuna ve istenen doku işlevselliğinin elde edilmesine izin veren biyomimetik 3D doku modellerine ihtiyaç vardır. Doğal ECM'den türetilen biyomalzemeler, dokuya özgü ECM 1,2,3,4,5'i doğrudan kullanabilme yeteneği ile doku mühendisliğinde büyük ilgi görmektedir. ECM tabanlı taşıyıcılar, doku rejenerasyonundan hastalık modeli geliştirmeye kadar birçok uygulamada kullanılmıştır. Enjekte edilebilir veya implante edilebilir biyomateryal iskeleleri 4,5, ilaç tarama uygulamalarında 6,7, hücre büyümesini indükleyen materyallerin geliştirilmesinde 8,9,10, biyo-mürekkepler 11,12,13, mikroakışkanlar14 ve kanser dokusu modellerinde 15,16,17,18,19.
Doku ve organların hücreden arındırılması, dokuya özgü ECM'yi taklit eden yapı iskeleleri oluşturmak için popüler bir yaklaşımdır. Hücrelerden arındırılmış doku ve organların hidrojeller halinde sulandırılması, hücrelerin biyomimetik 3D doku modellerine gömülmesine izin verir20. Hücre çözme teknikleri, esas olarak ECM bileşimini korurken hücresel bileşenleri ortadan kaldırmaya odaklanır. Dokuları hücreden arındırmak için donma-çözülme döngüleri gibi fiziksel yöntemler veya Triton-X-100 tedavisi gibi kimyasal işlemler yaygın olarak uygulanır. Ayrıca, hücre gömülmesi üzerine immünolojik yanıtları en aza indirmek için kalıntı DNA'nın uzaklaştırılması için DNaz tedavisi tercih edilir. Hücre giderme prosedürlerini optimize etmek için maksimum hücre giderimi ve minimum ECM bozulması elde etmek çok önemlidir21. Bu yönlerin yanı sıra, yeniden yapılandırılmış iskelelerin viskoelastisite ve sertlik dahil olmak üzere biyokimyasal ve mekanik özelliklerinin karakterizasyonu, doğal matrislerden türetilen tasarlanmış 3D doku modellerinin iyileştirilmesi için çok önemlidir20.
Akciğer doku mühendisliğinde organa özgü ECM, gelişimsel, homeostatik veya patolojik süreçleri in vitro modellemek ve terapötikleri fizyo-mimetik bir ortamda test etmek için pulmoner mikroçevrenin taklit edilmesine izin verir 20,22,23. Önceki çalışmalar, sıçanlar, domuz eti ve insanlar gibi çeşitli türlerden akciğer dokusunun hücreden arındırıldığını göstermiştir, ancak bu yöntemler henüz sığır gibi daha az kullanılan türlere uyarlanmamıştır. Hücreden arındırma sürecinin parametrelerinin ve bunların biyokimyasal bileşim ve mekanik özelliklerle ilgili olarak ortaya çıkan yeniden yapılandırılmış ECM iskelelerini nasıl etkilediğinin daha iyi anlaşılması, bu yönlerin daha iyi ayarlanmasına izin verecek ve sağlık ve hastalıkta daha güvenilir doku modellerinin önünü açacaktır. Bu çalışmada, donma-çözülme siklusları ve Triton-X-100 tedavisi olmak üzere iki farklı yöntemle sığır akciğeri hücreden arındırma açıkça tanımlanmış ve ardından hücrelerden arındırılmış akciğer ECM (dECM) hidrojellerinin biyokimyasal ve mekanik analizleri yapılmıştır. Bulgular, her iki yöntemin de ECM ligandlarının etkili bir şekilde hücreden arındırılmasını ve tutulmasını sağladığını ortaya koymaktadır. Özellikle, yöntem seçimi, sulandırılmış hidrojellerin ortaya çıkan sertliğini ve viskoelastisitesini önemli ölçüde değiştirir. Sığır dECM'sinden türetilen hidrojeller, insan akciğerinin hücre dışı matrisi ile dikkate değer biyokimyasal analojiler gösterir ve güvenilir termal jelleşme özellikleri sergilerler20. Daha önce açıklandığı gibi, her iki yöntem de akciğer kanseri hücrelerinin, sağlıklı bronşiyal epitel hücrelerinin ve hasta kaynaklı akciğer organoidlerinin 3D kültürü için uygundur20.

<table><tbody><tr><td>Mutlak etanol</td><td>ISOLAB</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>ISOLAB</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Alcian mavisi çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8438</td><td></td></tr><tr><td>Sığır pankreasından Deoksiribonükleaz I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Discovery HR-2 reometre</td><td>TA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Entellan montaj ortamı</td><td>Merck</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Eozin çözeltisi</td><td>Parlak slayt</td><td>2.BS01-105-1000</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>50-980-485</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>İyot</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3002</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Mayer'in hematoksilen boyama solüsyonu</td><td>Merck</td><td>2.BS01-103-1000</td><td></td></tr><tr><td>OCT bileşiği</td><td>Doku-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Biowest</td><td>L0018-100</td><td></td></tr><tr><td>Domuz mide mukozasından Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Pikrik asit</td><td>Polysciences</td><td>88-89-1</td><td></td></tr><tr><td>Sirius Kırmızı</td><td>Polysciences</td><td>09400-25</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Merck</td><td>112298</td><td></td></tr></tbody></table>

dehücreli akciğer ekstraselüler matriks hidrojellerinin geliştirilmesi ve karakterizasyonu

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

Hücre dışı matriks (ECM) türevi hidrojellerin doku mühendisliğinde kullanımı, hücrelerin doğal ortamını in vitro olarak taklit edebildikleri için giderek daha popüler hale gelmiştir. Bununla birlikte, ECM'nin doğal biyokimyasal içeriğini korumak, mekanik stabiliteyi sağlamak ve hücreden arındırma işleminin ECM hidrojellerinin mekanik özellikleri üzerindeki etkisini anlamak zordur. Burada, iki farklı protokol kullanılarak sığır akciğer dokusunun hücreden arındırılması için bir boru hattı, hücreden arındırmanın etkinliğinin aşağı akış karakterizasyonu, sulandırılmış hücreden arındırılmış akciğer ECM hidrojellerinin üretimi ve mekanik ve sitouyumluluk özelliklerinin değerlendirilmesi anlatılmıştır. Sığır akciğerinin hücreden arındırılması, fiziksel (donma-çözülme döngüleri) veya kimyasal (deterjan bazlı) bir yöntem kullanılarak gerçekleştirildi. Hematoksilen ve Eozin boyama, ana ECM bileşenlerinin hücreden arındırılmasını ve tutulmasını doğrulamak için yapıldı. Decellularize örneklerde rezidüel kollajen ve sülfatlanmış glikozaminoglikan (sGAG) içeriğinin değerlendirilmesi için sırasıyla Sirius kırmızısı ve Alcian mavisi boyama teknikleri kullanıldı. Hücrelerden arındırılmış akciğer ECM hidrojellerinin mekanik özellikleri, salınımlı reoloji ile karakterize edildi. Sonuçlar, hücrelerden arındırılmış sığır akciğer hidrojellerinin, çoğu doğal ECM bileşenini koruyarak ticari ECM ürünlerine güvenilir bir organotipik<span style="font-size: 11pt; font-family: Calibri, sans-serif; color: black; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;"> alternatif sağlayabileceğini göstermektedir. Ayrıca, bu bulgular, tercih edilen hücre çözme yönteminin, jelleşme kinetiğinin yanı sıra elde edilen hidrojellerin sertlik ve viskoelastik özelliklerini önemli ölçüde etkilediğini ortaya koymaktadır.

Hücresizleştirme Doğal akciğer mikroçevresini özetleyecek dECM hidrojelleri üretmek için sığır akciğer dokusunun hücreden arındırılması, hem fiziksel (donma-çözülme) hem de kimyasal (Triton-X-100) yöntemlerle sağlanmıştır. Diseksiyondan sonra, doku parçaları, daha sonra dECM hidrojellerinin sterilitesini etkileyebilecek patojenleri uzaklaştırmak içindH2Oiçeren antibiyotiklerde yıkandı. Hücresel yapıları bozmak için donma-çözülme yöntemi için sıvı nitrojen ile 37 °C su banyosu arasında değiş...

Protokol, doğal sığır pulmoner dokularına uygulanan iki farklı hücre dışı bırakma metodolojisini açıklığa kavuşturur ve bunların ilgili karakterizasyonlarının kapsamlı bir açıklamasını sağlar.

Dehücreli Akciğer Ekstraselüler Matriks Hidrojellerinin Geliştirilmesi ve Karakterizasyonu

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...

development-characterization-decellularized-lung-extracellular-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz bir decellularized akciğer ekstraselüler matriks ve fonksiyonel akciğer dokusu oluşturmak için kullanılan olabilir romanı biomimetic biyoreaktör geliştirdik. Biyoreaktör matris ve kültür hücreleri ekim, kısa bir süre için in vivo olarak nakledilen zaman etkili gaz değişimi gösteren doku oluşturur.

Akciğer Mühendisliği Prosedürü

Bu videoda, in vitro çalışmalar için ex vivo ışınlamayı takiben murin meme yağ yastıkçıklarını hücreden arındırarak hücre dışı matris hidrojelleri türetme tekniği açıklanmaktadır. Bu hidrojel, tümör hücresi davranışını incelemek için radyasyon tedavisi sonrası in vivo meme dokusu ortamını taklit etmeye yardımcı olur.

Hücre Dışı Meme Yağ Pedleri: Meme Yağ Pedlerinden Hücre Dışı Matriks Hidrojellerinin Türetilmesi

Bu protokol verimli hava yolu epitel hücreleri olgun fare embriyonik kök hücre kaynaklı kesin endoderm yönlendirir. Bu farklılaşma tekniği tanımlanmış bir serum içermeyen kültür ortamında, akciğer soy özellikleri doğrudan 3 boyutlu hücresizleştirilmiş akciğer iskeleleri kullanır.

Decellularized Akciğer Yapı iskeleleri kullanarak ESC türetilmiş Fare Havayolu Epitel Hücreleri Üretimi

Bu akciğer hücre dışı matristen 3 boyutlu hücre kültürü iskele oluşturmak için bir yöntemdir. Bozulmamış akciğer üç boyutlu hücrelerin büyümesini destekleyen hidrojeller olarak işlenir.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

dokuya özgü, hücre dışı matris (ECM) hücre fonksiyonunun önemli bir düzenleyicidir. Bu makalede, saf ECM türevli köpükler ve in vitro hücre kültürü modelleri ileri 3D uygulamaları için ya da ön-rejeneratif bioscaffolds gibi kimyasal çapraz bağlama yapılmasına gerek olmadan kültürdeki kararlı olan mikro taşıyıcıları sentezlenmesi için yöntemler tarif etmektedir.

Doku spesifik Hücre Kültürü ve Delivery Platform olarak Ekstrasellüler Matriks kaynaklı Köpükler ve mikro Fabrikasyon

Bu iletişim kuralı tam decellularization insan Miyokardiyum, hücre dışı matriks bileşenlerinin koruma sırasında açıklar. Microparticles ve cytoprotective kendi kendine montaj hidrojel üretiminde hücre dışı matriks sonuçlarının daha fazla alay.

İnsan kalp dokusu hücre dışı matriks hidrojel Vitro ve In Vivo uygulamaları için kendi kendine montaj doğru işlenmesi

Burada bir iletişim kuralı yerel böbrek hücre dışı matriks (ECM) yapısal ve biyokimyasal kompozisyonu tutulacağı bir böbrek korteks ekstraselüler matrisi elde edilen hidrojel imal etmek mevcut. İmalat süreci ve uygulamaları açıklanmıştır. Son olarak, böbrek özel cep ve doku rejenerasyonu ve Biyomühendislik desteklemek için bu hidrojel kullanarak bir bakış açısı ele alınmıştır.

Bir böbrek korteks ekstraselüler matrisi elde edilen hidrojel imalatı

Bu protokol, deselülarizasyon ve ex vivo ışınlama sonrasında murine meme Yağ pedleri sonraki hidrojel oluşumu için bir yöntem sunar.

Ekstrasellüler matris Hidrogeller kullanarak normal doku radyasyon etkileri eğitim

Bu protokol, desellülarize hassas kesilmiş akciğer dilimlerini alveoler epitel tip 2 hücreleri, fibroblastlar ve endotel hücreleri ile yeniden doldurarak tekrarlanabilir, küçük ölçekli mühendislik ürünü akciğer dokuları oluşturmak için bir yöntemi açıklar.

Desellülerize Akciğer Dilimlerinden Hazırlanan Mühendislik Akciğer Dokuları

Bu makale, hücresellikten arındırılmış kıkırdak hücre dışı matriks (DC-ECM) hidrojellerinin sentezi için yeni bir yöntem sunmaktadır. DC-ECM hidrojelleri mükemmel biyouyumluluğa sahiptir ve hücre büyümesi için üstün bir mikro ortam sağlar. Bu nedenle, ideal hücre iskeleleri ve biyolojik dağıtım sistemleri olabilirler.

Decellularize Kıkırdak Hücre Dışı Matriks Hidrojellerinin Sentezi

Burada bölgesel desellülarize akciğer dokusunun izolasyonu için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, hücre dışı matris ve hücre-matris etkileşimlerindeki karmaşıklıkları incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Bölgeye Özgü Desellülarize Akciğer Dokusunun Diseksiyonu ve İzolasyonu

Öğrenin, sığır akciğer dokusunun dehücrelendirilmesi ve ekstraselüler matris hidrojellerinin yeniden oluşturulması yöntemleriyle organotipik akciğer doku modellerinin nasıl geliştirildiğini. Mekanik özelliklerin hücresel davranışlar üzerindeki etkisini keşfedin.

Dehücreli Akciğer Ekstraselüler Matriks Hidrojellerinin Geliştirilmesi ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet