Name: İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Türetilen Hepatositleri Saflaştırmak İçin Hücre Sıralamasında Canlı Mitokondri Boyamanın Uygulanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Öğrenin, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden hepatositleri canlı mitokondri boyama ve FACS ile saflaştırma yöntemini. Bu teknik, %97 saflıkta olgun hepatosit elde ederek rejeneratif tıp ve ilaç keşfi için yüksek verim sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Milli Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı hibe numarası [23390072] tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışmada ticari olarak elde edilen insan iPS hücreleri (253G1 suşu) kullanılmıştır (bkz.
1. İnsan iPS hücrelerinin bakımı
<ol><li>İnsan iPS hücrelerini, 0,25 μg/cm2 iMatrix-511 ile kaplanmış kültür kaplarında AK02 ortamında besleyici içermeyen koşullarda tutun (bkz.</li>
</ol>2. 2D kültürlerde insan iPS hücrelerinin hepatik farklılaşması
NOT: Günlük karaciğer farklılaşması programı için Şekil 1A'ya bakın. İşlem boyunca, 6 oyuklu kültür plakaları kullanın ve her bir oyuğa 2 mL belirtilen yıkama veya kültür ortamı ekleyin. Hücre kültürü durumunu 37 °C'de %100 nem, %5 CO2 ve %20 O2'de koruyun.
<ol><li>6 oyuklu bir plakanın her bir kuyusunu 1 mL bazal membran matrisi (PBS (-) içinde 1/25 seyreltilmiş) ile kaplayın ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>İnsan iPS hücrelerini, 10 μM ROCK inhibitörü (Y-27632) ile desteklenmiş AK02N ortamı kullanarak 20.000-30.000 hücre/cm² yoğunlukta kaplanmış tabağa geçirin (bkz. Ertesi gün ortamı Y-27632 olmadan değiştirin ve 2 gün daha kültürleyin.</li>
	<li>Hücreleri RPMI-1640 ortamı ile bir kez yıkayın. Ortamı RPMI-B27-Glu (RPMI-1640 +% 2 B27 İnsülin +% 1 Dipeptid L-Alanil-L-Glutamin) ile değiştirerek endoderm farklılaşmasını başlatın 3-6 μM CHIR-99021 ve 24 saat boyunca 100 ng / mL Aktivin A (bkz.</li>
	<li>Ortamı 24 saat boyunca 50 ng/mL Aktivin A ile desteklenmiş RPMI-B27-Glu ile değiştirin.</li>
	<li>Hepatik progenitör farklılaşmasını indüklemek için, ortamı 5 gün boyunca% 1 dimetil sülfoksit (DMSO) ile desteklenmiş RPMI-B27-Glu ile değiştirin.</li>
	<li>Hepatosit olgunlaşmasını teşvik etmek için, hepatosit olgunlaşma ortamına geçin: 10 μM hidrokortizon 21-hemisüksinat,% 8.3 triptoz fosfat suyu, 100 nM deksametazon (DEX), 50 μg / mL sodyum-L-askorbat,% 0.58 insülin-transferrin-selenyum (ITS),% 8.3 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM Dipeptid L-Alanil-L-Glutamin ve 100 nM N-Hekzanoik-Try-Ile-(6)-amino Heksanoik amid (Dihexa) (bkz.</li>
	<li>Ortamı 20 gün boyunca her 2 günde bir değiştirin. Farklılaşmaya başladıktan yaklaşık 27 gün sonra hücreleri sıralayın.</li>
</ol>3. İnsan iPS hücrelerinden türetilen hepatositlerin saflaştırılması için hücre hazırlığı
<ol><li>Hepatik farklılaşmış hücreleri kuyucuk başına 2 mL PBS (-) ile yıkayın.</li>
	<li>Ads tamponunda %0.1 kollajenaz, %0.083 tripsin, 10 μM ROCK inhibitörü (Y-27632), 20 nM siklosporin A ve 50 μg/mL sodyum-L-askorbat içeren kuyucuk başına 1 mL enzim çözeltisi ekleyin (116 mM NaCl, 12.5 mM NaH2PO4, 20 mM HEPES, 5.4 mM KCl, 5.6 mM glikoz ve 0.8 mM MgSO4; pH 7.35) (bkz. Yaklaşık 2 saat boyunca 37 ° C'de yatay olarak döndürerek hücreleri plakalardan ayırın.</li>
	<li>Hücrelerin mikroskop altında ayrıldığını ve yuvarlandığını onayladıktan sonra, bunları hafif pipetleme ile tek hücrelere dağıtın ve 50 mL'lik bir tüpte toplayın.</li>
	<li>Hücreleri pelet yapmak için 18 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Bir aspiratör kullanarak süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>Hücrelerin mitokondrilerini, 100 nM TMRM (tetrametilrodamin, methl ester) içeren 5 mL hepatosit olgunlaşma ortamında dağıtarak boyayın (bkz. Malzeme Tablosu). Alüminyum folyoya sararak ışıktan koruyarak 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri pelet yapmak için 18 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>Hücreleri% 2 FBS içeren 1-5 mL soğuk Ads tamponu ile yeniden süspanse edin.</li>
	<li>% 0.4 Tripan mavisi çözeltisi ve bir hücre sayım plakası kullanarak hücre sayısını sayın.</li>
	<li>Hücreleri pelet yapmak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>Bir anti-ALCAM antikorunu (birincil antikor, Malzeme Tablosuna bakınız) Ads tamponunda 1:50 oranında seyreltin ve 106 hücre başına 100 μL seyreltilmiş antikor ekleyin. Hücreleri buz üzerinde 50 dakika boyayın. Negatif kontrol olarak birincil antikor ile boyanmamış hücreleri hazırlayın.</li>
	<li>Hücreleri iki kez% 2 FBS içeren soğuk Ads tamponu ile yıkayın.</li>
	<li>Bir Alexa Fluor 488 eşek anti-keçi IgG'yi (ikincil antikor, Malzeme Tablosuna bakınız) Ads tamponunda 1:100 oranında seyreltin ve 106 hücre başına 100 μL seyreltilmiş antikor ekleyin. Hücreleri buz üzerinde 30 dakika boyayın. İkincil antikoru kullanarak birincil antikorla boyanmamış hücreleri boyayın.</li>
	<li>Hücreleri iki kez% 2 FBS içeren soğuk Ads tamponu ile yıkayın.</li>
	<li>Ads arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın ve büyük hücre kümelerini ve kalıntıları gidermek için FACS'ye göre sıralamadan hemen önce bir geçmeli kapaklı hücre süzgecinden (35 μm ağ) süzün.</li>
</ol>4. İnsan iPS hücrelerinden türetilen hepatositlerin FACS analizleri ve sınıflandırılması
<ol><li>Üreticinin talimatlarını izleyerek hücre sıralama için FACS makinesini ayarlayın (bkz. Malzeme Tablosu). NOT: Hepatositler için 85 μm veya 100 μm meme boyutu ve 2.0 ND filtresi kullanın. ALCAM için Alexa Flour 488'i algılamak için FITC kanalını ve mitokondri için TMRM floresansını algılamak için PE kanalını kullanın.</li>
	<li>Hücre popülasyonunu düzgün bir şekilde görselleştirmek için FSC (ileri saçılma) ve SSC (yan saçılma) voltajlarını ayarlayın.</li>
	<li>FITC ve PE floresan kanallarının voltajlarını ayarlayın. Etiketlenmemiş hücrelerle başlayın ve hücre popülasyonunu her kanal grafiğinin altında ortalayın. Etiketli hücrelerin çizim içinde uygun şekilde konumlandırıldığından emin olun.</li>
	<li>İkilileri ortadan kaldırmak için ortak bir geçit stratejisi kullanın: Büyük FSC-A'yı geçit vs. SSC-A popülasyonu (Şekil 2A), ardından FSC-H vs. -W ve ardından SSC-H ile karşılaştırılır. -W (Şekil 2B,C).</li>
	<li>Hepatositleri sıralamak için TMRMhi ve ALCAM + popülasyonunu ( Şekil 2E'de P2) kapılayın. Hepatosit olmayanları sıralamak için TMRMhi ve ALCAM popülasyonunu ( Şekil 2E'de P1) kapılayın. Sıralanmış hepatositleri ve hepatosit olmayanları, hepatosit olgunlaşma ortamı içeren 15 mL'lik toplama tüplerinde toplayın.</li>
	<li>Sıralanmış hücreleri içeren toplama tüpünü 200 x g'da 18 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın ve hepatosit olgunlaşma ortamındaki hücreleri yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücreleri, 10 μM Y-27632 ve 20 nM siklosporin A ile desteklenmiş hepatosit olgunlaşma ortamı ile mitomisin C ile muamele edilmiş fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) veya jel benzeri bazal membran matrisi üzerine tohumlayın. Hücreleri 5 gün boyunca 37 ° C CO2 inkübatörde kültürleyin.</li>
</ol>5. İnsan iPS hücrelerinden türetilen hepatositlerin tespiti için immünositokimya
<ol><li>Kültürlenmiş hücreleri PBS (-) ile ayırdıktan sonra 5 gün boyunca yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.</li>
	<li>Paraformaldehiti çıkarmak için hücreleri TBS-T tamponu (% 1 Tween 20 ile 1x TBS) ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri% 0.1 Triton X-100 seyreltilmiş TBS-T tamponu ile oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Triton X-100'ü çıkarmak için hücreleri TBS-T tamponu ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Piyasada bulunan engelleme solüsyonunu (Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hücrelere ekleyin.</li>
	<li>Albümine (hepatosit markörü) ve insan nükleer antijenine (hNA, bakınız Malzeme Tablosu) karşı birincil antikorlar ekleyin, bloke edici çözelti içinde 1:50 oranında seyreltin.</li>
	<li>Hücreleri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Hücreleri TBS-T tamponu ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>İkincil antikorlar ekleyin: Alexa Fluor 488 eşek anti-tavşan IgG ve Alexa Fluor 546 eşek anti-fare IgG, bloke edici çözelti içinde 1:100 oranında seyreltilmiş (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Hücreleri TBS-T tamponu ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Floresan mikroskobu altında albümin pozitif ve hNA pozitif hücreleri sayarak hepatosit saflığını değerlendirin. Hem P1 hem de P2 popülasyonları için hNA pozitif hücre başına albümin pozitif hücrelerin yüzdesini hesaplayın.</li>
</ol>

İnsan iPSC'den Elde Edilen Hepatositlerin Mitokondriyal-ALCAM Sınıflandırması ile Saflaştırılması

<ol><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+pluripotent+stem+cells+correlates+to+the+level+of+CHD7%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7.</a> Scientific Reports. 8 (1), 241(2018).</li>
<li>Laco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+inconsistencies+of+cardiac+differentiation+efficiency+induced+by+the+GSK3%CE%B2+inhibitor+CHIR99021+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (6), 1851-1866 (2018).</li>
<li>Anderson, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+serendipity+and+reproducibility%3A+Pluripotent+stem+cells+as+experimental+systems+for+intellectual+and+developmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders.</a> Stem Cell Reports. 16 (6), 1446-1457 (2021).</li>
<li>Chen, C. X. -Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+quality+control+workflow+to+evaluate+the+reproducibility+and+differentiation+potential+of+human+iPSCs+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Standardized quality control workflow to evaluate the reproducibility and differentiation potential of human iPSCs into neurons.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Duinsbergen, D., Salvatori, D., Eriksson, M., Mikkers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+originating+from+induced+pluripotent+stem+cells+and+methods+for+their+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tumors originating from induced pluripotent stem cells and methods for their prevention.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 197-204 (2009).</li>
<li>Nori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+issues+of+iPSC-based+cell+therapy+in+a+spinal+cord+injury+model%3A+oncogenic+transformation+with+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term safety issues of iPSC-based cell therapy in a spinal cord injury model: oncogenic transformation with epithelial-mesenchymal transition.</a> Stem Cell Reports. 4 (3), 360-373 (2015).</li>
<li>Hentze, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells%3A+evaluation+of+essential+parameters+for+future+safety+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies.</a> Stem Cell Research. 2 (3), 198-210 (2009).</li>
<li>Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+enrichment+of+cardiomyocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells.</a> Molecular Therapy. 15 (11), 2027-2036 (2007).</li>
<li>Hidaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chamber-specific+differentiation+of+Nkx2.5-positive+cardiac+precursor+cells+from+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Chamber-specific differentiation of Nkx2.5-positive cardiac precursor cells from murine embryonic stem cells.</a> The FASEB Journal. 17 (6), 740-742 (2003).</li>
<li>Gassanov, N., Er, F., Zagidullin, N., Hoppe, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+induces+differentiation+of+ANP-EGFP+expressing+embryonic+stem+cells+towards+a+pacemaker+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Endothelin induces differentiation of ANP-EGFP expressing embryonic stem cells towards a pacemaker phenotype.</a> The FASEB Journal. 18 (14), 1710-1712 (2004).</li>
<li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+enrichment+of+hepatocyte-like+cells+from+human+embryonic+stem+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).</li>
<li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+high-functioning+human+iPS+cell-derived+hepatocyte-like+cells+for+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enrichment of high-functioning human iPS cell-derived hepatocyte-like cells for pharmaceutical research.</a> Biomaterials. 161, 24-32 (2018).</li>
<li>Hattori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature methods. 7, 61-66 (2009).</li>
<li>Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte-like+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+can+be+enriched+by+a+combination+of+mitochondrial+content+and+activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22JMA+Journal%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule.</a> JMA Journal. 2 (2), 174-183 (2019).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Enríquez, J., Pérez-Martos, A., Montoya, J., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+differences+in+mitochondrial+activity+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific differences in mitochondrial activity and biogenesis.</a> Mitochondrion. 11, 207-213 (2010).</li>
<li>Swart, G. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule+%28CD166%2FALCAM%29%3A+Developmental+and+mechanistic+aspects+of+cell+clustering+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Activated leukocyte cell adhesion molecule (CD166/ALCAM): Developmental and mechanistic aspects of cell clustering and cell migration.</a> European Journal of Cell Biology. 81 (6), 313-321 (2002).</li>
<li>Peters, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asialoglycoprotein+receptor+1+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+hepatocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Development. 143 (9), Cambridge, England. 1475-1481 (2016).</li>
<li>Kamiya, A., Inagaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cell+systems+in+liver+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Research%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cell systems in liver development and regeneration.</a> Hepatology Research. 45 (1), 29-37 (2015).</li>
<li>Yanagida, A., Ito, K., Chikada, H., Nakauchi, H., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+vitro+expansion+system+for+generation+of+human+ips+cell-derived+hepatic+progenitor-like+cells+exhibiting+a+bipotent+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">An In vitro expansion system for generation of human ips cell-derived hepatic progenitor-like cells exhibiting a bipotent differentiation potential.</a> PLOS One. 8 (7), e67541(2013).</li>
<li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (5), 939-952 (2015).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALCAM+%28CD166%29+is+a+surface+marker+for+early+murine+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+Tissues%2C+Organs%22%5BJournal%5D)">ALCAM (CD166) is a surface marker for early murine cardiomyocytes.</a> Cells, Tissues, Organs. 184 (3-4), 172-180 (2006).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Besin metabolizması ve detoksifikasyondaki işlevleri nedeniyle, hepatositler diğer hücre tiplerine kıyasla nispeten daha fazla sayıda mitokondriye sahiptir15. ALCAM, immünoglobulin süper ailesinin bir üyesidir ve hücre yapışması ve göçünde rol oynar. Hepatik, epitelyal, lenfositik, miyeloid, fibroblast ve nöronal hücreler dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde eksprese edilir16. Mitokondri bazlı yöntem ve ALCAM antikorunun bir kombinasyonu kullanılarak, insan iPS hücres...

Embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (sırasıyla ES ve iPS), rejeneratif tedaviler için umut verici hücre kaynakları olarak kabul edilir. Bununla birlikte, bu hücreleri belirli hedef hücre tiplerine ayırmanın verimliliği, aynı hücre hattını, protokolü ve deneyci 1,2,3,4 kullanıldığında bile değişebilir. Bu değişkenlik, insan ES/iPS hücrelerinin çevrelerine karşı yüksek hassasiyetine bağlanabilir. Bu nedenle, şu anda tutarlı bir şekilde saf hedef hücreler elde etmek zordur. Son derece güvenli rejeneratif tıp elde etmek için, terapötik hücrelerde proliferatif hücreleri ve farklılaşmamış kök hücreleri ortadan kaldırmak çok önemlidir ve hedef hücreler için gelişmiş saflaştırma teknolojisi esastır 5,6,7.
Hücre sıralayıcı, tek tek hücreleri anında analiz eden ve floresan sinyal güçlerine dayalı olarak ilgilenilen canlı hücreleri sıralayan ve umut verici bir çözüm sunan bir cihazdır. Bu, hücre tipine özgü yüzey belirteçlerinin antikor boyaması yoluyla veya hücre tipine özgü raportör gen ekspresyonları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu tekniği kullanarak, pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler 8,9,10 ve hepatositler 11,12'nin saflaştırılması yöntemleri hakkında birkaç rapor vardır. Hattori ve ark. bir hücre sıralayıcı13 kullanarak yenilikçi bir mitokondriyal saflaştırma yöntemi geliştirdi. Kardiyomiyositlerin mitokondriyal aktivite yoluyla yüksek enerji taleplerine sahip olduğu gerçeğinden yararlanarak, hücrelerin canlı mitokondri gösterge boyası TMRM (tetrametilrodamin metil ester) ile boyanması, çeşitli hücre tipleri içeren insan ES hücresinden türetilmiş embriyoid cisimlerinden FACS ile kardiyomiyositleri etiketlemek ve yüksek oranda saflaştırmak için kullanılabilir. Tümörjenitenin yokluğu, saflaştırılmış kardiyomiyositlerle teratom oluşum testleri ile doğrulandı. Ayrıca, Yamashita ve ark. beklenmedik bir şekilde, yüksek mitokondriyal aktiviteye ve ALCAM pozitif ekspresyona sahip fraksiyonları izole ederek insan ES hücresinden türetilmiş embriyoid cisimlerinden hepatositleri saflaştırmak için bir yöntem keşfettiler14. Bu yöntemin mantığı, hepatositlerin besin metabolizması ve detoksifikasyon için yüksek ATP tüketimleri nedeniyle nispeten yüksek sayıda mitokondriye sahip olmaları15 ve hepatositlerin, hücre yapışması ve göçünde rol oynayan immünoglobulin süper ailesinin bir üyesi olan ALCAM'ı eksprese etmesidir16.
Pluripotent kök hücre türevli hepatositler için önceki yüksek saflaştırma yöntemleri genetik modifikasyonlar gerektiriyordu ve genetik olmayan saflaştırma yöntemleri düşük verimliliğe sahipti17. Mitokondriyal genetik olmayan yöntem, yüksek saflık elde etmek için değer taşır. Hepatik progenitör hücrelere ihtiyaç duyulduğunda CD133 ve CD13 veya Dlk1 tabanlı yöntemler18,19 seçilebilir. Genom düzenleme teknolojisinin doğruluğu ilerlemiş olsa da, öngörülemeyen genomik değişikliklerin (örneğin, karsinogenez) potansiyel riski tamamen ortadan kaldırılamaz. Genetik modifikasyon içermeden mitokondriyal aktiviteye dayalı yöntemler bu tür risklerden muaf olabilir.
Yenidoğan sıçan kardiyomiyositlerinde çeşitli mitokondriyal indikatörlerin incelenmesi sonucunda, TMRM'nin 24 saat içinde tamamen kaybolduğu, diğer boyaların ise en az 5 gün kaldığı gözlenmiştir13. Ayrıca, TMRM ve JC-1'in 3- (4,5-dimetil-tiyazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) testi ile değerlendirildiğinde hücre canlılığını etkilemediğini, diğer boyaların ise hücre canlılığı üzerinde farklı etkiler gösterdiğini belirtmek önemlidir13. TMRM daha yüksek güvenlik gösterir.
Bugüne kadar, üç boyutlu (3D) embriyoid cisim oluşumuna kıyasla farklılaşmayı indüklemek için daha etkili yaklaşımlar olarak birkaç iki boyutlu (2D) farklılaşma yöntemi geliştirilmiştir. Bunun nedeni, kademeli farklılaşmayı indükleyen bileşiklerin veya sitokinlerin, hücrelere 3 boyutlu bir alanda değil, 2 boyutlu bir düzlemde eşit şekilde uygulanabilmesidir. Bu çalışmada, daha önce bildirilen yöntem20 , insan iPS hücresinden türetilmiş hepatositlere farklılaşmayı indüklemek için modifiye edilmiştir. Burada, insan iPS hücrelerinden türetilen hepatositlerin güncel 2D farklılaşması ve saflaştırılması için prosedürlerin ayrıntıları açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>253G1 insan iPS hücre hattı</td><td>RIKEN BioResource Araştırma Merkezi</td><td>HPS0002</td><td></td></tr><tr><td>%4 paraformaldehit</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>Activin A Solüsyonu, İnsan, Rekombinant</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>18585</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Çekirdek Antikoru, klon 235-1</td><td>Chemicon</td><td>MAB1281</td><td>İnsan nükleer antijenine karşı antikor</td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi (50x), serum içermez</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Hücre sıralayıcı</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ciclosporin A</td><td>FUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi</td><td>035-18961</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz</td><td>FUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi</td><td>034-22363</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bodrum Membran Matrisi</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Jel benzeri bazal membran matrisi</td></tr><tr><td>CultureSure Y-27632</td><td>FUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi</td><td>036-24023</td><td>KAYA inhibitörü</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>FUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi</td><td>047-18863</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>FUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi</td><td>047-29353</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti-Keçi IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-Fare IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10036</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Yuvarlak Alt Polistiren Test Tüpü, Hücre Süzgeci Çıtçıtlı Kapaklı</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Biowest</td><td>51820-500</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Takviyesi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>35050061 Dipeptid L-Alanil-L-Glutamin</td></tr><tr><td>İnsan / Fare / Sıçan / Köpek ALCAM / CD166 Antikor</td><td>R & D Systems</td><td>AF1172</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon 21-hemisüksinat sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2270</td><td></td></tr><tr><td>iMatrix-511 ipek</td><td>Nippi 892021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImmunoBlock</td><td>KAC</td><td>CTKN001</td><td>Engelleme çözümü</td></tr><tr><td>ITS-G Takviyesi (ve kez; 100)</td><td>FUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi</td><td>090-06741</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz'in L-15 Orta</td><td>FUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi</td><td>128-06075</td><td></td></tr><tr><td>N-Heksanoik-Try-Ile-(6)-amino Heksanoik amid (Diheksa)</td><td>Toronto Araştırma Kimyasalları</td><td>H293745</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonal Tavşan Anti-İnsan Albümini</td><td>Dako</td><td>A0001</td><td></td></tr><tr><td>Polioksietilen Sorbitan Monolaurat (Tween 20)</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>28353-85</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>FUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi</td><td>189-02025</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum L-Askorbat</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>03422-32</td><td></td></tr><tr><td>StemFit AK02N</td><td>REPROCELL</td><td>RCAK02N</td><td></td></tr><tr><td>TBS (10x)</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>12748-31</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamin, metil ester (TMRM)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>28229-25</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözeltisi</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>20577-34</td><td></td></tr><tr><td>TRYPSIN 250</td><td>Difco</td><td>215240</td><td></td></tr><tr><td>Triptoz fosfat suyu çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8159</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilen hepatositleri saflaştırmak İçin hücre sıralamasında canlı mitokondri boyamanın uygulanması

Application of Live Mitochondria Staining in Cell-Sorting to Purify Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

İnsan embriyonik kök (ES) ve indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücreleri, sınırsız çoğalmaları ve pluripotent özellikleri nedeniyle ciddi şekilde hastalıklı organları tedavi etmek için hücre bazlı rejeneratif tıpta potansiyel uygulamalara sahiptir. Bununla birlikte, insan ES/iPS hücrelerini %100 saf hedef hücre tiplerine ayırmak, çevreye karşı yüksek hassasiyetleri nedeniyle zordur. Transplantasyondan sonra tümörijenez, kontamine olmuş, çoğalan ve farklılaşmamış hücrelerden kaynaklanır ve bu da rejeneratif tıbbın güvenli bir şekilde gerçekleştirilmesi için yüksek saflaştırma teknolojisini gerekli kılar. Tümör oluşumu riskini azaltmak için, insan iPS hücresinden türetilen hepatositler için yüksek saflaştırma teknolojisi geliştirilmiştir. Yöntem, genetik modifikasyon olmadan yüksek mitokondriyal içerik ve hücre yüzeyi işaretleyicisi ALCAM'ın (aktive edilmiş lökosit hücre adezyon molekülü) bir kombinasyonunu kullanarak FACS (floresanla aktive edilen hücre sıralama) kullanır. Bu yöntem kullanılarak saflaştırılan hepatositlerin %97 ± %0.38'i (n=5) albümin protein ekspresyonu sergilemiştir. Bu makale, insan iPS hücreleri için hepatositlere en güncel iki boyutlu farklılaşma yöntemine uygulandığı gibi, bu yöntem için ayrıntılı prosedürler sağlamayı amaçlamaktadır.

İnsan iPS hücrelerinin 2D kültür (Şekil 1A) ve temsili hücre özellikleri (Şekil 1B) yoluyla hepatositlere farklılaşmasını indükleyen işlemlerin zaman çizelgesi gösterilmektedir. Yaklaşık olarak farklılaşma 12. günde, hücreler, hepatositlerin karakteristiği olan poligonal hücre şekilleri ve yuvarlak çekirdekler sergilemeye başladı. Bazı hepatositler ayrıca çoklu çekirdeklenme gösterdi.
Farklılaşma 27. günde hücreler kullanılarak FACS a...

Pluripotent kök hücrelerden türetilen hepatositler, mitokondriyal ve aktive edilmiş lökosit hücre adezyon molekülünün (CD166 olarak da bilinen ALCAM) bir kombinasyonu kullanılarak hücre sıralama yoluyla saflaştırılabilir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Türetilen Hepatositleri Saflaştırmak İçin Hücre Sıralamasında Canlı Mitokondri Boyamanın Uygulanması

Human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have potential applications in cell-based regenerative medicine for treating severely ...

Araştırmamızın kapsamı, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı hepatositleri genetik modifikasyon olmadan saflaştırmaktır. İnsan iPS hücrelerinden farklılaşmış olanlar arasında, farklılaşmamış hücrelerle ilişkili tümörjenik risk konusunu ele almayı amaçlıyoruz. Mevcut deneysel zorluklardan biri, sıralamanın mekanik depolanması nedeniyle düşük hücre saflığıdır.Büyük ölçekli saflaştırma için hepatositlerin benzersiz metabolizma özelliklerini kullanan yeni bir saflaştırma yöntemi geliştiriyoruz. Hepatik progenitör hücreler için hücre dışı bir sıralama yöntemi, saf hepatositler elde edemez. Olgun hepatositler için bir diğeri, işaretleyici proteinin sınırlı ekspresyonu nedeniyle hepatositlerin sadece küçük bir kısmını tedavi edebilir.Buna karşılık, yaklaşımımız daha yüksek bir arife ile farklı olgunlaşma seviyelerinde hepatositler elde edebilir. İnsan iPS hücresinden türetilen hepatositler son derece olgunlaşmamıştır ve saflaştırmadan sonra daha azalmış hepatosit makro ekspresyonu gösterir. Gelecekteki hedefimiz, organoidal teknolojiyi ve rejeneratif tıp ve ilaç keşfindeki günlük gelişmeleri kullanarak hepatosit modülasyonunu geliştirmektir.

application-live-mitochondria-staining-cell-sorting-to-purify

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu çalışma, somatik hücrelerin in vivo olarak teratom oluşumu olmadan pluripotentliğe doğru yeniden programlandığını göstermektedir. Yetişkin hepatositlerin artmış pluripotentliğe sahip hücrelere in vivo yeniden programlanmasını indüklemek için Yamanka faktörlerini kodlayan plazmid DNA'nın hidrodinamik kuyruk veni enjeksiyonunu kullandık.

İn vivo Yamanaka Faktörlerinin Aşırı İfadesi ile Yetişkin Somatik Hücrelerin Pluripotentliğe Yeniden Programlanması

Burada, kardiyovasküler hastalık modellemesi ve ilaç taraması amacıyla saflaştırılmış kardiyomiyositlerin üretimini sağlayan, küçük molekül modülasyonlu kardiyak farklılaşma ve glikoz yoksunluğu aracılı kardiyomiyosit saflaştırmasını birleştiren insan kardiyomiyosit türevi için sağlam bir protokol açıklıyoruz.

Küçük Molekül-modüle Farklılaşma ve sonraki Glikoz şiddetli açlık kullanma İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin yüksek oranda saf kardiyomiyositlerde türetilmesi

İnsan hepatositlerini ve parankimal olmayan karaciğer hücrelerini aynı donörden izole etmek için bir teknik tanımlanmıştır. Farklı karaciğer hücresi tipleri, fonksiyonel karaciğer modelleri ve doku mühendisliği için temel oluşturur. Bu yeni yöntem, karaciğer hücrelerini yüksek verim ve canlılıkta izole etmeyi amaçlamaktadır.

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Bu iletişim kuralının amacı yüksek canlılık ve yüksek verim tetkikine ve sinüsoidal endotel hücreleri karaciğer elde etmektir. Bu bir tür IV collagenase eriyik yolu ile portal ven, hepatositlerin ve sinüsoidal endotel hücreleri elde etmek için farklı aralıklarla tarafından takip ile karaciğer Ventriküler tarafından gerçekleştirilir.

Arıtma tetkikine ve fare karaciğer sinüsoidal endotel hücrelerinden perfüzyon

Burada sunulan Protokolü küçük moleküller karaciğer hastalığının tedavisi için tanımlamak için bir platform açıklar. Adım adım açıklamasını nasıl iPSCs hücrelere 96-şey plakaları hepatosit özellikleri ile ayırt etmek ve küçük moleküller için potansiyel terapötik etkinlik ile ekran için hücreleri kullanmak için ayrıntılı sunulmaktadır.

İnsan kullanarak Pluripotent kök hücre kaynaklı hepatosit benzeri hücreler indüklenen ilaç bulma için

Bu iletişim kuralı insan pluripotent kök hücreler 96 iyi plaka kartvizitlere hepatosit benzeri hücreleri üretmek için yarı otomatik bir yaklaşımı açıklar. Bu hızlı ve uygun maliyetli, hepatosit benzeri hücreler temel ve uygulamalı insan araştırma için toplu halde üretim kalite güvence sağlayan işlemdir.

Hepatosit Pluripotent kök hücreler hücreleri gibi yarı otomatik üretimi

Bu protokol, 18 gün içinde insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSCs) hepatosit benzeri hücreleri verimli bir şekilde üretmek için bir monolayer, serum içermeyen bir yöntem ayrıntıları. Bu hpscs sırayla ilkel çizgi, kesin endoderm, posterior foregut ve karaciğer tomurcuk ataları hepatosit benzeri hücreler oluşturmadan önce gibi ara hücre türlerine ayırt olarak altı adım gerektirir.

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

Primer hepatositler, karaciğer yanıtını ve metabolizmasını in vitro olarak incelemek için değerli bir araçtır. Ticari olarak temin edilebilen reaktifler kullanılarak, fare primer hepatosit izolasyonu için geliştirilmiş bir zaman ve emek verimli protokol geliştirilmiştir.

Fare Primer Hepatosit İzolasyonu için Geliştirilmiş Zaman ve İş Gücü Verimli Protokolü

Bu makalede, hESC farklılaşması sırasında Activin A ve CHIR99021'in kesin endoderm (DE) olarak sürekli olarak takviye edilmesiyle insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC' ler) fonksiyonel hepatosit benzeri hücrelere (HLC) farklılaştırılması için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Hepatosit Benzeri Hücre İndüksiyonu İçin Etkili Bir Yöntem

Bu çalışma, mitokondriyal hacim, mitokondriyal membran potansiyeli, reaktif oksijen türleri seviyesi, mitokondriyal solunum zinciri bileşimi ve mitokondriyal DNA'daki değişiklikleri tespit etmek için iki floresan muhabir veya antikor ile akış sitometrisine ve çift boyamaya dayalı çoklu mitokondriyal fonksiyonel parametreleri ölçmek için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerde Multipl Mitokondriyal Parametrelerin ve Nöral ve Glial Türevlerinin Akış Sitometrik Analizi

Öğrenin, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden hepatositleri canlı mitokondri boyama ve FACS ile saflaştırma yöntemini. Bu teknik, %97 saflıkta olgun hepatosit elde ederek rejeneratif tıp ve ilaç keşfi için yüksek verim sağlar.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Türetilen Hepatositleri Saflaştırmak İçin Hücre Sıralamasında Canlı Mitokondri Boyamanın Uygulanması (Video) | JoVE Journal

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Türetilen Hepatositleri Saflaştırmak İçin Hücre Sıralamasında Canlı Mitokondri Boyamanın Uygulanması

Daha fazla video keşfet