Name: Kimerik Küçük Kodlamayan RNA için Hesaplamalı Analiz Eğitimi: Hedef RNA Dizileme Kitaplıkları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Keşfedin kimerik RNA dizileme verilerini analiz etmek için SCRAP hesaplamalı ardışık düzeninin kurulumunu ve kullanımını. Bu açık kaynaklı biyoinformatik yöntem, RNA:RNA etkileşimlerini anlamada yüksek güvenilirlikli sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Boru hattının kurulumu ve uygulanmasını açıklamaya ilişkin kritik geri bildirimler için BH Powell ve WT Mills IV de dahil olmak üzere yararlı tartışmalar için Meffert laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma Braude Vakfı ödülü, Maryland Kök Hücre Araştırma Fonu Lansman Programı, Blaustein Ağrı Araştırma ve Eğitim Vakfı ödülü ve NINDS RO1NS103974 ve NIMH RO1MH129292 tarafından MKM'ye desteklenmiştir.

NOT: Protokol, SCRAP kullanarak kimerik RNA dizileme kitaplıklarını analiz etmek için gereken yazılımın indirilmesi ve yüklenmesiyle başlayacaktır.
1. Kurulum
<ol><li>SCRAP'ı kurmadan önce, analizler için kullanılacak makineye Git ve Miniconda bağımlılıklarını kurun. Git büyük olasılıkla zaten yüklüdür. Örneğin, Mac OSX platformunda, "git" yardımcı programının bu dizinde mevcut olduğunu ve yüklü olduğunu görmek için hangi git'i kullanarak bunu doğrulayın. Miniconda'nın hangi conda kullanılarak kurulup kurulmadığını kontrol edin. Hiçbir şey döndürülmezse, Miniconda'yı yükleyin. Miniconda'yı yüklemek için 400 MB disk alanı gerekir.<ol><li>Miniconda'yı kurmanın birkaç yöntemi vardır ve bunlar platforma göre farklılık gösterir. Windows, MacOS ve Ubuntu'ya yüklemek için daha fazla talimatın bulunduğu Meffert Lab GitHub deposundaki [https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] PLATFORM-SETUP markdown dosyasına bakın. Linux kullanıcıları için, Linux'un kendi varsayılan paket yöneticisi (apt) vardır. Bu çalışmaya özgü durumda, mevcut bir paket yöneticisi olan brew'u kullanarak Miniconda'yı kurmak için brew install Miniconda komutunu kullanın. NOT: 'Brew' olarak adlandırılan 'Homebrew', Apple'ın işletim sistemi macOS'a yazılım yüklenmesini basitleştiren açık kaynaklı bir yazılım paketi yönetim sistemidir.</li>
		<li>conda ilk kez yükleniyorsa, kullanımda olan belirli bir kabuk için komutunu çalıştırın conda init . Buradaki örnekte, kullanılan kabuk zsh'dir. Ardından, kabuğu kapatın ve yeniden açın. Conda başarıyla yüklendiyse, terminal oturumu içinde etkinleştirilen temel ortam görülecektir.</li>
	</ol></li>
	<li>SCRAP kaynağını indirin ve bağımlılıklarını yükleyin.<ol><li>SCRAP kaynağı elde etmek için tercih edilen yöntem Git kullanmaktır. Kaynak kodun en son kopyasını almak için git clone https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP komutunu çalıştırarak buna erişin.</li>
		<li>Conda için geliştirilmiş bir paket çözücü olan mamba'yı kurun ve aşağıdaki komutları kullanarak SCRAP için tüm bağımlılıkları SCRAP_environment.yml'den kendi conda ortamına yükleyin: conda install -n tabanı conda-forge::mamba mamba env oluştur -f HURDA/SCRAP_environment.yml -n HURDA</li>
	</ol></li>
	<li>Ardından, SCRAP için başvuru yüklemesini çalıştırın. Referans kurulumunda kullanılan argümanlar, sncRNA-mRNA etkileşimleri analiz edilen organizmaya özgü olacaktır. bash HURDA/çöp kutusu/Reference_Installation.sh -r dolu/yol/için/HURDA/ -m -g hg38 -s insan var
	<ol><li>Referans kurulumu için SCRAP kaynak klasörünün dizinini sağlayın. Kurulum adımları daha sonra fasta ve açıklama klasörlerindeki dosyalar kullanılarak gerçekleştirilecektir. Herhangi bir kısayol olmadan tam yolu listeleyin. Eğik çizgi ile bitirin.</li>
		<li>Doğru miRbase tür kısaltmaları için README.md'deki tablolara bakın. Güncel referans genomlar https://genome.ucsc.edu/ veya https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/'da bulunabilir. Bu örnekte, fare GRCm38 genomu için hg38 kullanılacaktır.</li>
		<li>Şu anda açıklama için dahil edilen türler insan, fare ve solucandır. SCRAP kaynak klasöründeki ek açıklama dizininde karşılık gelen species.annotation.bed dosyalarını görüntüleyin. Analiz için farklı bir türün kullanılması isteniyorsa, aynı adlandırma şemasını izleyen bir annotation.bed dosyası sağlayın species.annotation.bed.</li>
	</ol></li>
</ol>2. HURDA Çalıştırma
<ol><li>Bağımlılıklar ve SCRAP yüklendiğine göre, - betiği çalıştırın SCRAP.sh bash HURDA/çöp kutusu/SCRAP.sh -d dolu/yol/için/CLASH_Human/ -a dolu/yol/için/CLASH_Human/CLASH_Human_Adapters.txt -p hayır -f evet -r dolu/yol/için/HURDA/ -m -g hg38'e sahiptir
	<ol><li>Herhangi bir kısayol olmadan örnek dizinlere giden tüm yolu listeleyin. Örnek dizinleri, Şekil 1'de gösterildiği gibi, örnek adla tam olarak eşleşen klasör adıyla biçimlendirin.</li>
		<li>Listelenen yolun, tek bir örnek klasörün veya örnek dosyanın yolu değil, tüm örnek klasörleri içeren dizinin yolu olduğunu unutmayın (adım 2.1'deki komut satırına bakın).</li>
		<li>Ardından, bağdaştırıcı dosyasının tüm yolunu listeleyin. Bağdaştırıcı dosyasındaki örnek adların daha önce bahsedilen klasör adları ve dosya adlarıyla eşleştiğinden emin olun (adım 2.1'deki komut satırına bakın).</li>
		<li>Numunelerin eşleştirilmiş uç olup olmadığını ve pre-miRNA'lar ve/veya tRNA'lar için filtreleme yapılıp yapılmayacağını belirtin. İsterseniz rRNA temizliği için bir filtre ekleyin (adım 2.1'deki komut satırına bakın). NOT: Kullanıcılar, örnek türlerine ve deneysel hedeflere bağlı olarak bu filtreleri kullanmaya karar verebilir veya vermeyebilir. Deneysel tasarıma bağlı olarak, pre-miRNA'lar, tRNA'lar ve rRNA'lar, gerçek sncRNA:hedef RNA kimeraları için mevcut dizileme derinliğini tüketebilir ve kullanıcılar bunları dışlamak için filtreler kullanabilir. Bununla birlikte, kullanıcılar belirli durumlarda bu tür filtrelemeden kaçınmak isteyebilir (örneğin, sncRNA hedeflerini mitokondriyal rRNA'ları içeren mitokondriyal genoma eşlemek).</li>
		<li>Ardından, başvuru dizininin tüm yolunu, miRbase kısaltmasını ve başvuru genom kısaltmasını listeleyin (adım 2.1'deki komut satırına bakın). NOT: Komut dosyasının tamamlanması, veri kümesi boyutuna ve kullanılan bilgisayarın CPU'suna bağlı olarak birkaç saat sürebilir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Tepe arama ve açıklama
<ol><li>SCRAP'ın çalışması bittiğinde, çıktının diğer dosyaların yanı sıra bir SAMPLE.aligned.unique.bam dosyası içerip içermediğini kontrol edin. Bu, hedef RNA'ların kullanıcı tarafından sağlanan referans genom üzerindeki hizalamalarını içeren bir ikili dosyadır.</li>
	<li>Şimdi Peak_Calling.sh çalıştırarak yoğun arama gerçekleştirin. bash HURDA/çöp kutusu/Peak_Calling.sh -d CLASH_Human/ -a CLASH_Human/CLASH_Human_Adapters.txt -c 3 -l 2 -f no -r HURDA/ -m -g hg38 NOT: Tepe çağrısı, araştırmacıların kimerik RNA kütüphaneleri içindeki en sağlam ve tekrarlanabilir küçük kodlamayan RNA'yı kolayca değerlendirmelerini sağlamak için tasarlanmış bir SCRAP özelliğidir: hedef RNA etkileşimleri. Örneğin bu özellik, araştırmacıların daha fazla araştırma için seçmek isteyebilecekleri etkileşimleri belirlemelerine yardımcı olabilir. Aşağıdaki Adım 3.2.2, kullanıcının bir tepe noktasının çağrıldığı sıkılığı tanımlamak için kullanılmasını istediği kriterleri nasıl belirlediğini açıklar - bu, çağrılacak tepe noktası için meydana gelmesi gereken benzersiz etkileşimlerin veya sıralama okumalarının sayısını ve bu belirli etkileşimin gerçekleşmesi gereken kitaplıkların sayısını içerir.<ol><li>Yine, örnek klasörleri ve bağdaştırıcı dosyasını içeren dizinin tam yollarını listeleyin (adım 3.2'deki komut satırına bakın).</li>
		<li>Ardından, çağrılacak bir tepe noktası için gereken en düşük sıralama okuma sayısını ayarlayın (adım 3.2'deki komut satırına bakın).</li>
		<li>Çağrılması için bir tepe noktası içermesi gereken en az farklı sıralama kitaplığı sayısını ayarlayın (adım 3.2'deki komut satırına bakın). NOT: Hem 3.2.2 hem de 3.2.3 için değer seçimi, sıralanan numunelerin doğasına ve numunelerin veya numune tiplerinin sayısına bağlı olacaktır. Burada, bir zirveyi çağırmak için bir örnekte en az 3 kimerik dizileme okuması gerekir ve tepe noktası en az 2 örnek tarafından desteklenmelidir. Örneğin, belirli bir koşul için birçok sıralama kitaplığı yinelemesinin bulunduğu bir veri kümesini değerlendiren bir araştırmacı, okumaların daha fazla sayıda örnek sıralama kitaplığında bulunmasını gerektirmeye karar verebilir.</li>
		<li>Aynı ailenin sncRNA'larının aynı zirveye katkıda bulunması gerekip gerekmediğini belirtin. Örneğin, aynı aileden miRNA'lar tohum dizilerini paylaştığından, bu miRNA'lar paylaşılan ve örtüşen gen hedefleri kümelerini bağlayabilir; Bir kullanıcı, bir ailenin bu hedefler üzerindeki tam etkisini, kolektif zirvelerini değerlendirerek belirlemek isteyebilir (Adım 3.2'deki komut satırına bakın).</li>
		<li>Ardından, başvuru dizininin tam yolunu, miRBase kısaltmasını ve başvuru genom kısaltmasını belirtin (adım 3.2'deki komut satırına bakın).</li>
	</ol></li>
	<li>Yoğun çağrı tamamlandıktan sonra yoğun ek açıklamayı çalıştırın. bash HURDA/çöp kutusu/Peak_Annotation.sh -p CLASH_Human/tepeler.yatak -r HURDA/ -s insan
	<ol><li>Tepe çağrısından elde edilen peaks.bed (veya peaks.family.bed ) dosyasının tam yolunu, başvuru dizininin tam yolunu ve ek açıklama için istenen türü listeleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Verileri görselleştirme
NOT: SCRAP kullanarak analiz için tüm adımlar tamamlanmıştır. Verileri görselleştirmek için çeşitli yaklaşımlar önerilir:
<ol><li>Birlikte görselleştirmek istenecek tüm .bam (ikili SAM dosyası) dosyalarını birleştirin (samtools birleştirme).</li>
	<li>Elde edilen birleştirilmiş .bam dosyasını sıralayın (samtools sıralaması). Dosya içeriği, samtools'un dizine ekleyebilmesi için satır satır sıralanır.</li>
	<li>Sıralanan .bam dosyasını (samtools dizini) dizine ekleyin. Bütünleştirici genomik görüntüleyicide (IGV) görselleştirmeye izin vermek için bir BAI (ikili samtools biçim dizini) dosyası oluşturulur.</li>
	<li>Son olarak, ortaya çıkan sıralanmış .bam ve dizine alınmış .bai dosyasını IGV'de açın. NOT: SncRNA: İlgilenilen hedef RNA etkileşimleri, araştırmaya özgü bir dizi yolla takip için önceliklendirilebilir. Genel bir başlangıç yaklaşımı, zirvelerin en kimerik sıralama okumaları tarafından desteklendiği etkileşimleri değerlendirmektir. İlgilenilen etkileşimler, tespit edilen etkileşimden hem sncRNA hem de hedef RNA için dizi girilerek RNAstructure paketinden DuplexFold Web Sunucusu kullanılarak da görselleştirilebilir11. Her tepe noktası için, kromozom (ilk sütun) ve genomik koordinatlar (başlangıç: 1. sütun sonu: 2. sütun), tepe ek açıklamasında oluşturulan peaks.bed.species.annotation.txt dosyasında bulunabilir. Özellikle miRNA'lar için, tekrarlanabilir ve fonksiyonel etkileşimler kapsamlı tohum uyumlu bağlanmadan yoksun olabilirken (örneğin, etkileşimler 3' telafi edici bağlanma kullanabilir), hedef RNA'nın eş kökenli bir bağlanma motifinde tohum eşleşen bölgelerin varlığı yine de işlevsel olarak önemli tespit edilen etkileşimlerin doğrulayıcı bir özelliği olarak değerlendirilebilir 4,12. Yardımcı veri işleme, farklı biyolojik koşullardaki pikler arasındaki diferansiyel okuma kapsamının karşılaştırmalarını ve bir yol analiz aracı kullanılarak düzenlenmiş genlerin yollara kümelenmesinin potansiyel olarak değerlendirilmesini içerebilir.</li>
</ol>

İn Vivo RNA: SCRAP Biyoinformatik Boru Hattı Kullanılarak RNA Etkileşimleri

<ol><li>Morris, K. V., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+of+regulatory+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The rise of regulatory RNA.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).</li>
<li>Li, X., Jin, D. S., Eadara, S., Caterina, M. J., Meffert, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+by+noncoding+RNAs+of+local+translation%2C+injury+responses%2C+and+pain+in+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Pain+%28Cambridge%2C+Mass.%29%22%5BJournal%5D)">Regulation by noncoding RNAs of local translation, injury responses, and pain in the peripheral nervous system.</a> Neurobiology of Pain (Cambridge, Mass.). 13, 100119(2023).</li>
<li>Shi, J., Zhou, T., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+expanding+universe+of+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring the expanding universe of small RNAs.</a> Nature Cell Biology. 24 (4), 415-423 (2022).</li>
<li>Broughton, J. P., Lovci, M. T., Huang, J. L., Yeo, G. W., Pasquinelli, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pairing+beyond+the+seed+supports+microRNA+targeting+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Pairing beyond the seed supports microRNA targeting specificity.</a> Molecular Cell. 64 (2), 320-333 (2016).</li>
<li>Grosswendt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unambiguous+identification+of+miRNA%3Atarget+site+interactions+by+different+types+of+ligation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Unambiguous identification of miRNA:target site interactions by different types of ligation reactions.</a> Molecular Cell. 54 (6), 1042-1054 (2014).</li>
<li>Mills, W. T., Eadara, S., Jaffe, A. E., Meffert, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCRAP%3A+a+bioinformatic+pipeline+for+the+analysis+of+small+chimeric+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">SCRAP: a bioinformatic pipeline for the analysis of small chimeric RNA-seq data.</a> RNA. 29 (1), 1-17 (2023).</li>
<li>Helwak, A., Kudla, G., Dudnakova, T., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+human+miRNA+interactome+by+CLASH+reveals+frequent+noncanonical+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the human miRNA interactome by CLASH reveals frequent noncanonical binding.</a> Cell. 153 (3), 654-665 (2013).</li>
<li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA-200+family+coordinately+regulates+cell+adhesion+and+proliferation+in+hair+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).</li>
<li>Moore, M. J., Zhang, C., Gantman, E. C., Mele, A., Darnell, J. C., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li>
<li>Bjerke, G. A., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+analysis+of+directly+captured+microRNA+targets+reveals+the+impact+of+microRNAs+on+mammalian+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Integrated analysis of directly captured microRNA targets reveals the impact of microRNAs on mammalian transcriptome.</a> RNA. 26 (3), 306-323 (2020).</li>
<li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAstructure%3A+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11 (1), 129(2010).</li>
<li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA-target+chimeras+reveal+miRNA+3%E2%80%B2-end+pairing+as+a+major+determinant+of+Argonaute+target+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">miRNA-target chimeras reveal miRNA 3′-end pairing as a major determinant of Argonaute target specificity.</a> Nature Communications. 6 (1), 8864(2015).</li>
<li>Travis, A. J., Moody, J., Helwak, A., Tollervey, D., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyb%3A+a+bioinformatics+pipeline+for+the+analysis+of+CLASH+%28crosslinking%2C+ligation+and+sequencing+of+hybrids%29+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif.%29%22%5BJournal%5D)">Hyb: a bioinformatics pipeline for the analysis of CLASH (crosslinking, ligation and sequencing of hybrids) data.</a> Methods (San Diego, Calif.). 65 (3), 263-273 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

sncRNA:hedef RNA etkileşimlerinin analizi için SCRAP boru hattının kullanımına ilişkin bu protokol, hesaplamalı analize giren araştırmacılara yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Eğitimin tamamlanmasının, giriş seviyesi veya daha fazla hesaplama deneyimine sahip araştırmacılara, bu boru hattının kurulumu ve kullanımı için gerekli adımlarda ve kimerik RNA dizileme kitaplıklarından elde edilen verileri analiz etmek için uygulamasında rehberlik etmesi beklenmektedir. Bu protokolün tamamlanması için kritik olan adımlar, özell...

Küçük kodlamayan RNA'lar, farklılaşma ve gelişme, sinyal işleme ve hastalık 1,2,3 gibi çeşitli süreçlerde gen paketlerinden ekspresyonun koordinasyonunda transkripsiyon sonrası rolleri nedeniyle oldukça incelenmiştir. MikroRNA'lar (miRNA'lar) dahil olmak üzere gen düzenleyici küçük kodlamayan RNA'ların (sncRNA'lar) hedef transkriptlerini doğru bir şekilde belirleme yeteneği, hem temel hem de translasyonel seviyelerde RNA biyolojisi çalışmaları için önemlidir. miRNA tohum dizisi ile potansiyel hedefleri arasında beklenen tamamlayıcılıktan yararlanan biyoinformatik algoritmalar, miRNA:hedef RNA etkileşimlerinin tahmini için sıklıkla kullanılmıştır. Bu biyoinformatik algoritmalar başarılı olsa da, başka bir yerde gözden geçirildiği gibi, hem yanlış pozitif hem de yanlış negatif sonuçları barındırabilirler 4,5,6. Son zamanlarda, in vivo sncRNA:hedef RNA etkileşimlerinin in vivo çapraz bağlanması ve ardından sncRNA'yı tek bir kimerik RNA 4,5,7,8,9,10 oluşturmak üzere hedefine fiziksel olarak bağlamak için bir ligasyon adımının dahil edilmesi yoluyla açık ve yarı kantitatif olarak belirlenmesine izin veren çeşitli biyokimyasal yaklaşımlar tasarlanmış ve uygulanmıştır.. Kimerik RNA'lardan dizileme kitaplıklarının daha sonra hazırlanması, dizileme verilerinin hesaplamalı işlenmesiyle sncRNA:hedef RNA etkileşimlerinin değerlendirilmesine izin verir. Bu video, kimerik RNA dizileme kitaplıklarından sncRNA:hedef RNA etkileşimlerinin sağlam ve tekrarlanabilir analizine izin vermek için tasarlanmış, küçük kimerik RNA analiz boru hattı (SCRAP) olarak adlandırılan bir hesaplama işlem hattının kurulması ve kullanılması için bir eğitim sağlar6.
Bu eğitimin amacı, sncRNA'nın kimerik moleküler okumalarını sağlayan biyokimyasal yaklaşımlar yoluyla üretilen verilerin analizinin önündeki engelleri azaltarak, araştırmacılara tamamen tahmine dayalı biyoinformatik algoritmalara aşırı güvenmekten kaçınmalarında yardımcı olmaktır: hedef RNA etkileşimleri. Bu eğitim, giriş seviyesi hesaplamalı bilim insanlarına, hibritlerin çapraz bağlanması, ligasyonu ve dizilenmesi (CLASH) ve endojen Argonaute'ye bağlı RNA'ların kovalent ligasyonu (CLEAR-CLIP)7,9 dahil olmak üzere mevcut birkaç biyokimyasal protokol tarafından üretilebilen kimerik RNA dizileme verilerini analiz etmek için geliştirilmiş bir boru hattı olan SCRAP'ın kullanımı yoluyla rehberlik edecek pratik adımlar ve ipuçları sağlar.
SCRAP kullanımı, diğer hesaplama boru hatlarına kıyasla kimerik RNA dizileme verilerinin analizi için çeşitli avantajlar sunar6. Göze çarpan bir avantaj, boru hattındaki adımlar için genellikle özel ve/veya desteklenmeyen komut dosyalarına dayanan alternatif işlem hatlarına kıyasla, kapsamlı ek açıklaması ve boru hattı içindeki iyi desteklenen ve rutin olarak güncellenen biyoinformatik komut dosyalarına çağrıların dahil edilmesidir. Bu özellik, SCRAP'a istikrar kazandırarak, araştırmacıların boru hattını tanımalarını ve kullanımını iş akışlarına dahil etmelerini daha değerli hale getirir. SCRAP'in ayrıca, önceki bir yayındaayrıntılı olarak açıklandığı gibi, sncRNA:hedef RNA etkileşimlerinin tepe noktalarını çağırmada alternatif boru hatlarından daha iyi performans gösterdiği ve platformlar arası işlevselliğe sahip olduğu gösterilmiştir 6.
Bu eğitimin sonunda, kullanıcılar (i) SCRAP için platform gereksinimlerini öğrenebilecek ve SCRAP boru hatlarını kurabilecek, (ii) referans genomları kurabilecek ve SCRAP için komut satırı parametreleri ayarlayabilecek ve (iii) tepe çağrı kriterlerini anlayabilecek ve tepe çağrı ve tepe ek açıklaması gerçekleştirebilecektir.
Bu video, RNA biyolojisini inceleyen araştırmacıların, dizileme kütüphanesi hazırlığına yönelik tartışılan biyokimyasal yaklaşımlardan biri aracılığıyla elde edilen kimerik RNA dizileme verilerinde haberci RNA'lar gibi hedef RNA'larla sncRNA etkileşimlerini analiz etmek için hesaplama boru hattı SCRAP'ı nasıl kurabileceklerini ve en uygun şekilde nasıl kullanabileceklerini pratik olarak ayrıntılı olarak açıklayacaktır.
SCRAP bir komut satırı yardımcı programıdır. Genel olarak, aşağıdaki kılavuzu izleyerek, kullanıcının (i) SCRAP'ı (https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP) indirip yüklemesi, (ii) referans genomları kurması ve SCRAP'yi çalıştırması ve (iii) en yüksek çağrı ve açıklama gerçekleştirmesi gerekir.
Bu yordamdaki hesaplama adımlarıyla ilgili daha fazla ayrıntı https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP'da bulunabilir. Bu makale, giriş seviyesi hesaplama becerilerine sahip araştırmacıların kimerik RNA dizileme kitaplığı veri kümelerinde SCRAP yüklemesine, optimize etmesine ve kullanmasına izin vermek için kurulum ve arka plan bilgileri sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>Genomlar</td><td>UCSC Genom tarayıcı</td><td>N/A</td><td>https://genome.ucsc.edu/ veya https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/</td></tr> <tr><td>Linux</td><td></td><td>Linux Ubuntu 20.04 veya 22.04 LTS önerilir</td><td></td></tr><tr><td>Mac</td><td>Apple</td><td>Mac OSX (>11)</td><td></td></tr><tr><td>Platform kurulumu</td><td>GitHub</td><td>N/A</td><td>https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md]</td></tr><tr><td>HURDA boru hattı</td><td>GitHub</td><td>N/A</td><td>https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP</td></tr><tr><td>Unix kabuğu</td><td>Unix işletim sistemi</td><td>bash >=5.0</td><td></td></tr><tr><td>Unix kabuğu</td><td>Unix işletim sistemi</td><td>zsh (5.9 önerilir)</td><td></td></tr><tr><td>Windows</td><td></td><td>Windows WSL Ubuntu 20.04 veya 22.04 LTS</td><td></td></tr></tbody></table>

kimerik küçük kodlamayan rna için hesaplamalı analiz eğitimi: hedef rna dizileme kitaplıkları

Computational Analysis Tutorial for Chimeric Small Noncoding RNA: Target RNA Sequencing Libraries

MikroRNA'lar (miRNA'lar) gibi küçük kodlamayan RNA'ların (sncRNA'lar) hedef RNA'ları ile in vivo gen düzenleyici etkileşimlerinin anlaşılması, son yıllarda, kimerik RNA'ların oluşumu ve müteakip dizileme kütüphaneleri yoluyla sncRNA:hedef RNA etkileşimlerini yakalamak için çapraz bağlanmayı ve ardından ligasyonu kullanan biyokimyasal yaklaşımlarla ilerletilmiştir. Kimerik RNA diziliminden elde edilen veri kümeleri, miRNA tahmin yazılımından genom çapında ve önemli ölçüde daha az belirsiz girdi sağlarken, bu verileri anlamlı ve eyleme geçirilebilir bilgilere damıtmak ek analizler gerektirir ve hesaplama altyapısına sahip olmayan araştırmacıları caydırabilir. Bu rapor, giriş seviyesi hesaplama biyologlarını yeni bir açık kaynaklı yazılım aracı olan Küçük Kimerik RNA Analiz Boru Hattı'nı (SCRAP) kurma ve uygulama konusunda desteklemek için bir eğitim sağlar. Platform gereksinimleri, güncelleştirmeler ve işlem hattı adımlarının açıklaması ve önemli kullanıcı girişi değişkenlerinin işlenmesi sağlanır. Biyologların kimerik RNA dizileme yaklaşımlarından içgörü elde etmelerinin önündeki bir engeli azaltmak, düzenleyici sncRNA'nın keşfe dayalı araştırmalarına sıçrama tahtası yapma potansiyeline sahiptir: çoklu biyolojik bağlamlarda hedef RNA etkileşimleri.

CLEAR-CLIP9 kullanılarak hazırlanan daha önce yayınlanmış dizileme veri kümelerinde SCRAP'nin değiştirilmiş bir sürümü (rRNA filtrelemesi için modifikasyonları uygulayan SCRAP sürüm 2.0) tarafından tespit edilen sncRNA sonuçları: hedef RNA Şekil 2 ve Tablo 1'de gösterilmektedir. Kullanıcılar, SCRAP'de pik çağrısı ile yüksek güvenilirlikli etkileşimlerin izolasyonunu takiben meydana gelen intron bölgeleri ile nispi fraksiyon miRNA etkileşimlerindeki az...

Burada, in vivo RNA:RNA etkileşimlerinin incelenmesinde kullanılan kimerik RNA dizileme verilerini analiz etmek için bir biyoinformatik boru hattının kurulumunu ve kullanımını gösteren bir protokol sunuyoruz.

Kimerik Küçük Kodlamayan RNA için Hesaplamalı Analiz Eğitimi: Hedef RNA Dizileme Kitaplıkları

An understanding of the in vivo gene regulatory interactions of small noncoding RNAs (sncRNAs), such as microRNAs (miRNAs), with their target RNAs has ...

Bu protokol, kimerik kodlamayan RNA-hedef RNA etkileşimlerinden elde edilen yüksek verimli dizileme verilerini analiz etmek için tasarlanmış bir hesaplama ardışık düzeninin kullanımı için kurulum ve pratik adımları kapsar. Kimerik RNA'ları oluşturmak için moleküler strateji, genom çapında kodlamayan RNA-hedef RNA-etkileşim ortamını açık bir şekilde anlamada önceki biyokromatik tahmin araçlarına kıyasla avantajlara sahip nispeten yeni bir gelişmedir. Kimerik RNA'ların yüksek verimli diziliminden elde edilen verilerin dizilenmesi, bu stratejinin yeni uygulayıcıları için bir analiz zorluğu sunabilir.Giriş seviyesindeki kullanıcıların kimerik kodlamayan RNA hedef RNA dizileme deneylerinden elde edilen verileri analiz etmelerine olanak sağlamak için yüksek açıklamalı açık kaynaklı bir çapraz platform hesaplama hattı oluşturduk. Gelecekteki deneylerde, Mefford laboratuvarı, memeli sinir sistemindeki transkripsiyon sonrası düzenlemeye yönelik devam eden araştırmalarımızdan elde edilen veri kümesi üzerinde hurda ile hesaplama analizini kullanmayı ve GitHub'ımızda bir güncelleme hurdası tutmayı planlıyor.

computational-analysis-tutorial-for-chimeric-small-noncoding-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada T7 lineer RNA amplifikasyon dayalı gen ekspresyon analizi için iki tek okudum ve eşleştirilmiş sonuna Illumina mRNA Seq sıralama kütüphaneler hazırlanması için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, toplam RNA başlayan sadece 10 nanogram gerektirir ve tüm transkript temsil eden son derece tutarlı bir kütüphane oluşturur.

10 nanogram Total RNA tek okuyun ve Eşleştirilmiş Sona mRNA-Seq Illumina Kütüphaneler

Bu protokol ile veya trombin tedavi olmadan insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde profili transcriptomes RNA-seq, güçlü bir nesil DNA dizileme teknolojisi, uygulamak için tam ve ayrıntılı prosedür sunar. Bu protokol, farklı reaktifler veya hastalık durumlarında etkilenen çeşitli hücreleri veya dokulara genellenebilir olduğunu.

RNA-seq Trombin-tedavi içinde Transcriptomes Analizi ve Kontrol İnsan Pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde

Gen ekspresyonu, mutasyonlar ve gen füzyonları için seçilen transkriptleri sorgulamak için indekslenmiş cDNA kütüphanelerinin hazırlanmasını, özel problarla hibridizasyon ve yakalama ve veri analizini içeren hedefli RNA dizileme tabanlı bir yöntemi tanımlıyoruz. Hedeflenen RNAseq, seçilen transkriptlerin bir masaüstü sıralayıcıda uygun maliyetli, hızlı bir şekilde değerlendirilmesine izin verir.

RNA Sıralama Deneyi Gen İfade ve Genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen

Burada katı tümörler ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci üzerinde anormal yapıştırma etkisini araştıran amaçlayan bir protokol açıklar. Bu hedefe, biz RNA seq ile ebeveyn ve in vitro dirençli modellerin transkriptomik profillerini analiz ve aday genler doğrulamak için bir QRT-PCR tabanlı bir yöntem kurdu.

İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Kanser Modelleri

Bu iletişim kuralı ChIP-seq, 4sU seq, toplam RNA-seq ve hücre satırları ve Primer hücre için profil oluşturma ribozom Kombinatorik kullanımını açıklar. Transkripsiyon faktörü de novo transkripsiyon, RNA işlenmesi, ciro ve çeviri zamanla, bağlama ve olayların genel gidişatı harekete geçirmek ve/veya hızla değişen hücrelerde görüntüleme izleme değişiklikleri sağlar.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Dairesel RNA'lar (circRNA'lar), transkripsiyonel düzenlemede ve proteinler arasındaki iletişimlerde rol alabilecek kodlamayan RNA'lardır. CircRNA sıralama kütüphanelerinin inşası için farklı parametrelerin değerlendirilmesinin ardından, RNase R ön arıtma ile mahsur kalan toplam RNA kitaplığı hazırlığı kullanılarak bir protokol derlenmiş ve burada sunulmuştur.

RNA Sıralaması Kullanılarak Dairesel RNA'ların Tanımlanması

Standart yöntemlere göre daha az önyargılı ve 2'-O-metil RNA'lar için artan hassasiyetiçeren ayrıntılı bir küçük RNA kütüphane telafi protokolü saiyoruz. Bu protokol maliyet tasarrufu veya kolaylık sağlamak için kitleri kullanarak ev yapımı reaktifler kullanılarak izlenebilir.

Küçük RNA-seq iyileştirilmesi: Daha Az Önyargı ve 2'-O-Metil RNA'ların Daha İyi Tespiti

Mutlak miktar tayini RNA dizilimi (AQRNA-seq), biyolojik karışımlardaki tüm küçük RNA'ların manzarasını ölçmek için geliştirilmiş bir teknolojidir. Burada, açlığın neden olduğu uyku hali sırasında Mycobacterium bovis BCG'deki transfer RNA (tRNA) havuzundaki değişiklikleri ölçen AQRNA-seq'nin hem kütüphane hazırlama hem de veri işleme adımları gösterilmektedir.

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Bu protokol, sınırlı biyoinformatik deneyimine sahip ıslak laboratuvar biyologları için RNA-seq deneyleri için ilk kalite kontrolüne izin verir.

Rup (RNA-seq Kullanılabilirlik Değerlendirme Hattı) - Ökaryotlarda Toplu RNA-seq Deneyleri için Kalite Kontrol

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Keşfedin kimerik RNA dizileme verilerini analiz etmek için SCRAP hesaplamalı ardışık düzeninin kurulumunu ve kullanımını. Bu açık kaynaklı biyoinformatik yöntem, RNA:RNA etkileşimlerini anlamada yüksek güvenilirlikli sonuçlar sağlar.

Kimerik Küçük Kodlamayan RNA için Hesaplamalı Analiz Eğitimi: Hedef RNA Dizileme Kitaplıkları

Daha fazla video keşfet