Name: Mikrobiyal otoagregasyonu incelemek için görüntüleme akışı sitometrisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: Öğrenin, Lactobacillaceae türlerinde diyet karbonhidratlarına yanıt olarak mikrobiyal otoagregasyonu görüntüleme akışı sitometrisi ile analiz etmeyi. Bu yüksek verimli yöntem, beslenme ve mikrobiyal davranışlar arasındaki ilişkiyi anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı (Hibe 119/16) ve IMoh hibesi (3-15656) tarafından IKG'ye desteklenmiştir. R.S. Kreitman bursu tarafından desteklenmektedir.

Örnek olarak Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) şablonunu içeren .ast dosyası, Ek Kodlama Dosyası 1'de sağlanır.
1. Medya hazırlığı
<ol><li>Üreticinin talimatlarına göre Lactobacilli MRS suyunu (1 L deiyonize suda 55 g) ve %1.5 (a/h) agar içeren Lactobacilli MRS agar plakalarını hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın). Otoklav sterilizasyonundan sonra, ortam doğrudan kullanıma hazırdır veya 4 °C'de saklanabilir.</li>
	<li>% 50 (1 L deiyonize suda 15 g) Triptik soya suyu (TSB) hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız), TSB %1 (a/h) D- (+) - glikoz ve% 1 (a / h) D- (+) - rafinoz ile desteklenmiş, ardından ortamı sterilize etmek için otoklavlayın. Kirlenmeyi önlemek için 4 °C'de saklanması tercih edilir.</li>
	<li>Glikozlu tamponlu bir ortam için,% 1 (a / h) D - (+) - glikoz, potasyum dibazik ile birlikte 5 mM potasyum fosfat monobazik ve 100 mM MOPS (3- (N-morfolino) propan sülfonik asit ile desteklenmiş TSB'yi hazırlayın, bkz. Daha sonra ortamı sterilize etmek için otoklavlayın.</li>
</ol>2. Numunelerin hazırlanması
NOT: Bu adım, diyetimizden fermente edilebilir veya fermente edilemeyen şekere yanıt olarak hücresel agregasyonun değerlendirilmesini içerir. Numune hazırlama işleminin şematik bir gösterimi Şekil 1'de gösterilmektedir.
<ol><li>Lactobacillaceae suşunu donmuş bir gliserol stoğundan (%50 gliserol) bir Lactobacilli MRS et suyu plakasına (%1.5 agar) koyun. NOT: Burada sunulan örnek deneyde, Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356), Lacticaseibacillus casei (ATCC 393), Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei (ATCC BAA-52), Lactiplantibacillus plantarum (ATCC 8014) ve Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG) probiyotik suşları kullanılmıştır. Bu metodolojiyi firmicutes filumunun ek probiyotik üyelerine genişletmek için Bacillus coagulans (ATCC 10545) seçildi.</li>
	<li>Hücreleri statik koşullar altında gece boyunca 37 ° C'de büyütün.</li>
	<li>5 mL Lactobacilli MRS suyunu tek bir koloni ile aşılayın ve gece boyunca statik koşullar altında 37 °C'de büyütün.</li>
	<li>Önceki adımdaki hücre kültürünü (1:100) 3 mL %50 Triptik soya suyu (TSB), %1 (a/h) D- (+) - glikoz ile takviye edilmiş TSB veya %1 (a/h) D- (+) - rafinoz ile takviye edilmiş TSB içinde seyreltin.</li>
	<li>Statik koşullar altında gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri ortamda homojen bir şekilde karıştırarak numuneyi hazırlayın ve hücre kültürü tüpünü adım 2.5'ten itibaren nazikçe girdaplayın. Tam karıştırma gerçekleşene kadar test tüpünü yavaşça ters çevirin. 200-300 μL'yi 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. NOT: Agregaların kırılmasını önlemek için numuneyi sonikasyon yapmamak önemlidir. Adım 3.4'ten 3.10'a kadar olan veri toplama sırasında, numunelerin çok konsantre olduğu durumlar olabilir. Numunenin çok yavaş çalıştığı veya hiç çalışmadığı gözlemlenirse, numune uygun taze ortam ile seyreltilebilir.</li>
</ol>3. Veri toplama
<ol><li>Görüntüleme akış sitometresini üretici tarafından sağlanan talimatlara göre ayarlayın (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Karanlık alan ölçümü için 785 nm lazeri 5 mW'a ayarlayın (SSC olarak kısaltılan geleneksel akış sitometrisindeki yan saçılmaya eşdeğerdir). Sayısal diyafram açıklığı (N.A) 0,9 olan 60x lens kullanın, yüksek hassasiyeti seçin ve hızı düşük olarak ayarlayın.</li>
	<li>Herhangi bir veri toplamadan önce, SSC kanalındaki kalibrasyon boncukları akışının kararlılığından emin olun. "Fluidics" kutusundaki oynat düğmesine tıklayın ve boncuk görüntülerinin kalitesini inceleyin. Boncuk görüntüleri keskin ve net görünmelidir.</li>
	<li>Yükle düğmesine basın ve s'yi içeren bir tüp yerleştirin.ample (adım 2.6'dan itibaren) tutucuya.</li>
	<li>"Çalışma alanı" kutusunda yeni bir dağılım grafiği oluşturun. Yeni dağılım grafiği'ni tıklatın ve parlak alan kanalında SSC kanal yoğunluğuna karşılık gelen alanı seçin. Numune ile birlikte cihazda çalışan kalibrasyon boncuklarını hariç tutun. NOT: Boncuklar, yalnızca tamponlu bir numune yüklenerek ve boncukları Alan vs. SSC arsası. Ardından, Çokgen Bölgesi Oluştur düğmesini kullanarak boncuk popülasyonunun etrafına bir kapı çizin.</li>
	<li>"Edinme Ayarları" kutusuna örnek adını girin, veri depolamanın konumunu belirtin, kaydedilecek popülasyonu (boncuksuz tüm hücreler) seçin ve toplanacak olay sayısını ayarlayın. Tipik olarak, 10.000-20.000 olay yeterlidir.</li>
	<li>"Edinme" kutusunda bulunan Kaydet düğmesini tıklayın ve belirtilen olay sayısına ulaşıldığında edinme işlemi otomatik olarak sona erecektir.</li>
	<li>Tüpü boşaltmak için Geri Dön düğmesine tıklayın ve küçük bir pencerede istendiğinde tüpü tutucudan çıkarın.</li>
	<li>Her örnek için 3.5-3.9 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Sonraki tekrarlar için veri alımının tekdüzeliğini korumak için şablonu kaydedin.</li>
</ol>4. Veri analizi
<ol><li>Popülasyondan otomatik toplamanın yüzdesini (%) ölçün.<ol><li>IDEAS yazılımını kullanarak görüntüleme akış sitometresinde elde edilen verileri analiz edin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Ham dosyadan (.rif) bir veri çözümleme dosyası (.daf) oluşturun ve bu dosya (.rif) dosyasını çözümleme yazılımına yükleyin. Dosya düğmesine tıklayın ve gerekli (.rif) dosyasını açın. Açılan pencerede, edinme analizini kullan'a tıklayın ve ardından Tamam'a tıklayın.</li>
		<li>Odaklanılan olayları belirlemek için parlak alan kanalında bir gradyan RMS histogramı (görüntü kontrastı ve odak ölçümü) oluşturun. Analiz alanında, Yeni Histogram düğmesine tıklayın. "Yeni Histogram" penceresinde, analiz etmek için alımdan popülasyonu seçin ve "x ekseni özelliği"nde, parlak alan kanalının Gradyan RMS'sini seçin.<ol><li>Odaklanmamış olayları hariç tutmak için analiz alanındaki Çizgi Bölgesi Oluştur düğmesine tıklayarak bir geçit yerleştirin (Şekil 2A). NOT: Tipik olarak, "Odaklanmış" çizgi bölgesi, en yüksek Gradyan RMS puanına sahip olayların %80-%90'ını içermelidir, ancak her deney kurulumu için "odak" hücreleri için belirli eşikler belirlenmelidir.</li>
		</ol></li>
		<li>Parlak alan kanalının en boy oranıyla (genişlik bölü en uygun elipsin uzunluğu) karşılaştırılarak alanın (μm2) bir dağılım grafiği oluşturun. Analiz alanındaki Yeni Dağılım Grafiği düğmesine basın. "Yeni Dağılım Grafiği" penceresinde, 4.1.3 adımındaki Odaklanmış popülasyonu seçin.<ol><li>X ekseni unsuru için parlak alan kanalının Alanı'nı ve y ekseni unsuru için parlak alan kanalının En Boy Oranı'nı seçin. Bu dağılım grafiği, tekilleri ve küçük agrega olaylarını daha büyük mikrobiyal agregalardan ve zincirlerden ayırt etmek için odaklanmış popülasyon üzerinde geçit oluşturmaya izin verir.</li>
		</ol></li>
		<li>Bu dağılım grafiğinde, Dikdörtgen Bölge Oluştur düğmesini (veya Çokgen Bölgesi Oluştur) kullanarak, toplama olayları popülasyonu için alan değerine ve tekiller ve küçük agregalar popülasyonu için başka bir geçit çizin (Şekil 2B). NOT: Bazı arka planlarda, küçük agregaları tekillerden ayırmak zor olabilir, bu nedenle aynı kapıda birleştirilebilirler. Aynısı daha büyük agregalar ve zincirler için de geçerlidir (Şekil 3).</li>
		<li>Geçit stratejisinin güvenilirliğini doğrulamak için her kapıdaki olayların görüntülerini manuel olarak inceleyin ve değerlendirin. Gerekirse, kapının alan değerini ayarlayın. Bunu, "Popülasyonlar" açılır menüsünden incelenen popülasyonu seçerek gerçekleştirin. NOT: Geçit, analiz edilen bakterinin özelliklerine bağlı olarak değişebileceğinden, belirli bir alan değerine sahip değildir.</li>
		<li>Veri analizini şablon olarak kaydedin. Dosya sekmesine tıklayın, Template.ast Olarak Kaydet'i seçin ve veri çözümleme dosyasını (.daf) oluşturmak için aynı şablon altında sonraki örnek (.rif) dosyasını açın (LGG örneği olarak .ast dosyasını destekler).</li>
		<li>Daha fazla analiz için önemli olayları numaralandırmak üzere bir istatistik tablosu oluşturun. Raporlar sekmesine tıklayın, ardından İstatistik Raporunu Tanımla'ya tıklayın.</li>
		<li>Yeni pencerede, Sütun Ekle'ye tıklayın. Singlets/aggregates sayısını ve %gated istatistiklerini ekleyin. "İstatistikler" bölümünün altında %gated/count'ı seçin ve seçili popülasyonun altında singlets/aggregates'i seçin. İstatistiği listeye eklemek ve şablon olarak kaydetmek için İstatistik Ekle'yi tıklayın.</li>
		<li>İstatistik raporu oluştur'a tıklayın ve analiz için istatistik şablonunu ve (.daf) dosyalarını seçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Agregaların boyut dağılımını ölçün.<ol><li>Toplama olaylarının ortalama boyutunu analiz etmek için, adım 4.1.5'teki toplama olayları popülasyonunun alanının (μm2) histogramını çizin (Şekil 2C).</li>
		<li>Veri analizini şablon olarak kaydedin. Dosya sekmesine tıklayın, Şablon Olarak Kaydet'i seçin ve veri çözümleme dosyası (.daf) için aynı şablon altında sonraki örnek (.rif) dosyasını açın.</li>
		<li>4.1.7-4.19 adımlarını tekrarlayın. Toplamaların boyutu için, istatistikler'in altında ortalama'yı seçin ve seçili popülasyonun altındaki toplamaları seçin. Özellikler altında, Parlak alan kanalının alanı'nı seçin. İstatistiği listeye eklemek ve şablon olarak kaydetmek için İstatistik Ekle'ye tıklayın.</li>
		<li>Bir istatistik raporu oluşturmak için adım 4.1.9'u tekrarlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak Mikrobiyal Otoagregasyonun Kantitatif Analizi

<ol><li>Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+autoaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial autoaggregation.</a> AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).</li>
<li>Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtaA%2C+a+new+member+of+the+trimeric+autotransporter+adhesins+from+Acinetobacter+sp.+Tol+5+mediating+high+adhesiveness+to+various+abiotic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating high adhesiveness to various abiotic surfaces.</a> PLoS One. 7, e48830(2012).</li>
<li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+low-molecular-weight+component+protein%2C+Flp%2C+in+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+fimbriae%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of low-molecular-weight component protein, Flp, in Actinobacillus actinomycetemcomitans fimbriae.</a> Medical Microbiology and Immunology. 42 (4), 253-258 (1998).</li>
<li>Boddey, J. A., Flegg, C. P., Day, C. J., Beacham, I. R., Peak, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-regulated+microcolony+formation+by+Burkholderia+pseudomallei+requires+pilA+and+enhances+association+with+cultured+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Temperature-regulated microcolony formation by Burkholderia pseudomallei requires pilA and enhances association with cultured human cells.</a> Infection and Immunity. 74 (9), 5374-5381 (2006).</li>
<li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+differences+in+the+functional+responses+of+Lactobacillaceae+strains+to+fermentable+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Context-dependent differences in the functional responses of Lactobacillaceae strains to fermentable sugars.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 949932(2022).</li>
<li>Isenring, J., Geirnaert, A., Lacroix, C., Stevens, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistable+auto-aggregation+phenotype+in+Lactiplantibacillus+plantarum+emerges+after+cultivation+in+in+vitro+colonic+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bistable auto-aggregation phenotype in Lactiplantibacillus plantarum emerges after cultivation in in vitro colonic microbiota.</a> BMC Microbiology. 21, 268(2021).</li>
<li>Kos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+and+aggregation+ability+of+probiotic+strain+Lactobacillus+acidophilus+M92%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92.</a> Journal of Applied Microbiology. 94 (6), 981-987 (2003).</li>
<li>Zommiti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+the+probiotic+properties+and+bacteriocinogenic+potential+of+Pediococcus+pentosaceus+MZF16+isolated+from+artisanal+tunisian+meat+%26%2334%3BDried+Ossban%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of the probiotic properties and bacteriocinogenic potential of Pediococcus pentosaceus MZF16 isolated from artisanal tunisian meat &#34;Dried Ossban&#34;.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2607(2018).</li>
<li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rewiring+of+the+probiotic+bacterium+rhamnosus%3C%2Fem%3E+GG+contributes+to+cell-wall+remodeling+and+antimicrobials+production%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Metabolic rewiring of the probiotic bacterium rhamnosus GG contributes to cell-wall remodeling and antimicrobials production.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Connell, J. L., Kim, J., Shear, J. B., Bard, A. J., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+quorum+sensing+in+3D-printed+bacterial+aggregates+using+scanning+electrochemical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of quorum sensing in 3D-printed bacterial aggregates using scanning electrochemical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18255-18260 (2014).</li>
<li>Misawa, N., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+autoagglutination+activity+by+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of autoagglutination activity by Campylobacter jejuni.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6168-6175 (2000).</li>
<li>Sherlock, O., Schembri, M. A., Reisner, A., Klemm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+roles+for+the+AIDA+adhesin+from+diarrheagenic+Escherichia+coli%3A+cell+aggregation+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Novel roles for the AIDA adhesin from diarrheagenic Escherichia coli: cell aggregation and biofilm formation.</a> Journal of Bacteriology. 186 (23), 8058-8065 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry.</a> Nature Reviews Methods Primers. 2, 87(2022).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+characteristics+of+lactic+acid+bacteria+and+the+expanding+applications+in+food+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Metabolism characteristics of lactic acid bacteria and the expanding applications in food industry.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 612285(2021).</li>
<li>Turroni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dialogue+between+the+human+gut+microbiota+and+the+host%3A+a+Lactobacillus+and+Bifidobacterium+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular dialogue between the human gut microbiota and the host: a Lactobacillus and Bifidobacterium perspective.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 183-203 (2014).</li>
<li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W. Jr, Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageStream+System%3A+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochemica+et+Cytobiologica%22%5BJournal%5D)">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochemica et Cytobiologica. 45, 279-290 (2007).</li>
<li>Dashkova, V., Malashenkov, D., Poulton, N., Vorobjev, I., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+for+phytoplankton+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry for phytoplankton analysis.</a> Methods. 112, 188-200 (2017).</li>
<li>Maan, H., Gilhar, O., Porat, Z., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+colonization+of+arabidopsis+thaliana+roots+induces+multiple+biosynthetic+clusters+for+antibiotic+production%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis colonization of arabidopsis thaliana roots induces multiple biosynthetic clusters for antibiotic production.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 722778(2021).</li>
<li>Maan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+reveals+a+dual+role+for+exopolysaccharides+in+biofilms%3A+To+promote+self-adhesion+while+repelling+non-self-community+members%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry reveals a dual role for exopolysaccharides in biofilms: To promote self-adhesion while repelling non-self-community members.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 15-25 (2022).</li>
<li>Konieczny, M., Rhein, P., Czaczyk, K., Bialas, W., Juzwa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+to+study+biofilm-associated+microbial+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry to study biofilm-associated microbial aggregates.</a> Molecules. 26 (23), 7096(2021).</li>
<li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178(2016).</li>
</ol>

Akış sitometrisi, ökaryotik hücrelerde floresan yoğunluklarını ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir, ancak daha büyük boyutları veya küçük agregaları nedeniyle bakteri hücreleri için doğru ölçümler sağlayamayabilir. Bu faktörler, farklı koşullarda otoagregasyonun kesin miktar tayinini ve bazal agrega oluşumu seviyesini önemli ölçüde etkileyebilir. Bunu ele almak için, karbonhidratların probiyotik bakterilerin agregasyonunu nasıl etkilediğine dair daha iyi bir çözünürlük elde etmek için görüntüleme akış sito...

Bakteriyel otoagregasyon, biyofilm oluşumunda birincil adım olarak kabul edilir. Bu süreçte (bazen otoaglütinasyon veya flokülasyon olarak da adlandırılır), aynı tipteki bakteriler, sonunda kültür tüplerinin dibine yerleşen veya hedef dokularına veya yüzeylerineyapışan çok hücreli kümeler oluşturur 1.
Otoagregasyon yaygın olarak gözlenen bir fenomendir ve şimdiye kadar fırsatçı patojen Acinetobacter baumannii2, diş patojeni Aggregobacter actinomycetemcomitans3 ve ortaya çıkan patojen Burkholderia pseudomallei4 gibi Gram negatif patojenlerde gösterilmiştir. Otoagregasyon ayrıca birkaç probiyotik Gram-pozitif suşta 5,6,7,8 tanımlanmıştır. Lactobacillus (L.) acidophilus'ta, otoagregasyona kısmen S-tabakası proteinleri aracılık etti ve ksilan7'ye bir yapışma ile ilişkilendirildi. Benzer şekilde, glikoza bağlı otoagregasyon ile probiyotik türlerin yapışkan özelliklerinin indüksiyonu arasında bir korelasyon bulduk (müsine yapışma ile değerlendirildiği gibi) Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei ve Lactiplantibacillus plantarum5. Artan otoagregasyon, büyük olasılıkla, glikoz ve katabolitlerine yanıt olarak hücresel adezinlerin ekspresyonundaki değişiklikleri yansıtıyordu9. Otoagregasyonun moleküler mekanizmaları henüz belirlenmemiş olsa da, bu işlemin agrega edilmiş bakterilerin fenotipini değiştirdiği ve onlara çevresel stres faktörlerine 1 karşı gelişmiş toleransve ayrıca çekirdek algılama moleküllerine10 karşı artan hassasiyet sağladığı gösterilmiştir.
Otomatik toplamayı ölçmek için çeşitli yaklaşımlar kullanılmıştır; Deneysel bir yaklaşım, kültürlerin belirli bir süre boyunca dar kültür tüplerinde statik olarak durmasına izin vermektir. Kontrol kültürleri bulanık kalırken, otoagregasyon kültürleri tüpün dibine yerleşecektir. Daha kantitatif bir yaklaşım, sedimantasyon veya çökeltme tahlili ile otoagregasyonu ölçer11.
Akış sitometrisi de son yıllarda bakteriyel otoagregasyonu araştırmak için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu yöntem, boyutu yaklaşık 0,5 ila 1000 μm arasındaki partikülleri analiz etmek için uygundur. Tek bakteri veya oluşan agregalar sıvı içinde süspanse edilir, bir akıntıya beslenir ve tek tek tespit edilebilir11. Öne doğru saçılan ışığın kaydedilmesi, hücrenin veya agreganın göreceli boyutunun ölçülmesine olanak tanır. Nispeten hızlı ve basittir, ancak toplam boyutu veya agregalardaki ortalama hücre sayısı gibi çeşitli parametreleri algılayamaz. Bu nedenle, bu yaklaşım mikroskobik olarak tamamlanabilir ve daha fazla parametrenin kontrol edilmesine izin verir12. Bununla birlikte, geleneksel mikroskopi zaman alıcıdır ve bu nedenle test edilen numunelerin sayısını ve analizin istatistiksel gücünü sınırlar. Genel olarak, görüntüleme akış sitometrisi, hücre morfolojisi ve fenotipin eşzamanlı analizi, görüntü tabanlı analiz yapma, nadir olayları tespit etme ve akış sitometrisi verilerinin doğrulanması gibi geleneksel akış sitometrisine kıyasla çeşitli özellikler sağlar13. Bu avantajlar, akış sitometrisinin yeteneklerini geliştirir ve hücre popülasyonlarının daha ayrıntılı bir şekilde incelenmesini kolaylaştırır.
Bu çalışma, laktik asit bakterilerinde (LAB) otoagregasyonu izlemek için görüntüleme akışı sitometrisi için değerli bir protokol sağlar. Bu Gram pozitif çubuklar fakültatif anaeroblardır ve LAB grubuna aittir. Bu verimli glikoz fermentörleri, karbonhidrat metabolizmasının ana son ürünü olarak laktik asit üretir14. Bu bakteriler mikrobiyomun faydalı çekirdek üyeleridir ve doğal olarak insanların ve hayvanların gastrointestinal sisteminde (GIT) ve ayrıca dişilerin ürogenital sisteminde bulunur15. Bu nedenle, otoagregasyon özelliklerinin kesin karakterizasyonu yüksek biyoteknolojik ve klinik ilgi çekicidir.
Önceki bulgularımız, bazal otoagregasyon seviyesinin farklı probiyotik suşlar arasında farklılık gösterdiğini göstermiştir. Bu heterojenlik, karbon kaynağı olarak kullanılan farklı karbonhidratlardan etkilenir5. Probiyotik bakterilerin bu temel özelliğinin üstesinden gelmek için, diyetteki karbonhidratların etkileri, IFC kullanılarak tek hücre düzeyinde otoagregasyon üzerinde izlendi. Bu IFC tabanlı yaklaşım, geleneksel akış sitometrelerinin gücünü ve hızını mikroskobun çözünürlüğü ile birleştirir. Bu nedenle, fenotipik olarak tanımlanmış bir şekilde yüksek hızlı karmaşık morfometrik ölçümlere izin verir16,17. Bu yaklaşım, gen ekspresyonunu izlemek için floresan raportörlerle birleştirilen diğer probiyotik ve patojenik bakterilere ve heterojen agregalarda spesifik bakteri türlerinin varlığını ve bolluğunu izlemek için floresan etiketli suşlara genişletilebilir.

<table><tbody><tr><td>14 mL kültür tüpleri</td><td>Falcon</td><td>352051</td><td></td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpü</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Baeton, Dickinson ve Şirketi</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tipik Soya Suyu</td><td>Baeton, Dickinson ve Şirketi</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>D - (+) - Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D - (+) - Rafinoz pentahidrat</td><td>Sigma</td><td>83400-25G</td><td></td></tr><tr><td>Difco Lactobacilli MRS et suyu</td><td>Baeton, Dickinson and Company</td><td>288130</td><td></td></tr><tr><td>EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)</td><td>FL medikal</td><td>23053</td><td></td></tr><tr><td>IDEAS Yazılım</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>&nbsp; Ayrıntılar şu adreste mevcuttur: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1</td></tr><tr><td>ImageStream X Mark II</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>&nbsp; Ayrıntılar şu adreste mevcuttur: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>MOPS, 3- (N-morfolino) propansülfonik asit</td><td>Fisher biyoreaktifleri</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat dibazik</td><td>Fisher Scientific, 174.18 g/mol</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma, 136.09 g/mol</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrobiyal otoagregasyonu incelemek için görüntüleme akışı sitometrisi

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Yararlı ve probiyotik bakteriler, konakçılarında önemli roller oynar ve bulaşıcı hastalıklara karşı bağışıklık da dahil olmak üzere çeşitli sağlık yararları sağlar. Lactobacillaceae ailesi, doğrulanmış probiyotik özelliklere sahip Gram pozitif bakterilerden oluşur. Bu çalışma, hücresel agregasyonun incelenmesinde tek hücreli yüksek verim analizinin etkinliğini göstermek için Lactobacillaceae türlerini bir model olarak kullanmaktadır. Odak noktası, bu faydalı türlerin diyetteki basit karbonhidratlara tepkisini analiz etmektir.
Çalışma, Görüntüleme Akış Sitometrisinin (IFC), karbonhidratların varlığında ve yokluğunda probiyotik bakterilerin montajındaki temel farklılıkların üstesinden nasıl gelebileceğini göstermektedir. IFC, konvansiyonel akış sitometrisinin gücünü ve hızını mikroskopinin uzamsal çözünürlüğü ile birleştirerek, faydalı bakteri suşları ve koşullarından oluşan bir kütüphane boyunca fenotipik olarak tanımlanmış bir şekilde yüksek hızlı karmaşık morfometrik ölçümler sağlar. Bu protokol, Lactobacillaceae türlerinin otoagregasyonu hakkında bilgi sağlar ve diyet karbonhidratlarına verdikleri tepkilere ışık tutarak, bu probiyotik bakterilerin yararlı etkilerinin arkasındaki mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunur.

Sonuçlar, bu yöntemin LAB bakterilerindeki diyet şekerlerine yanıt olarak otoagregasyondaki farklılıkları kolayca ölçebildiğini göstermektedir. Yöntem, bireyleri agregalardan ayırarak, diyetten fermente edilebilir veya fermente edilemeyen şekerlere yanıt olarak tüm olaylardan agregasyon olaylarının popülasyonunun yüzdesinin hesaplanmasına izin verir. Ek olarak, tedaviler arasında toplam popülasyonun ortalama büyüklüğünde farklılıklar olup olmadığını ölçmek mümkün olmuştur.
<strong class="xfig"...

Bu protokol, görüntüleme akış sitometrisi kullanarak mikrobiyal otoagregasyonu ölçmek için kantitatif bir yaklaşımı tanımlar.

Mikrobiyal otoagregasyonu incelemek için görüntüleme akışı sitometrisi

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...

Bu çalışmada, mikrobiyal otoagregasyonun incelenmesinde görüntüleme akış sitometrisi analizinin etkinliğini göstermek için Lactobacillus türleri bir model olarak kullanılmıştır. Odak noktası, Lactobacillus türlerinin diyetteki basit karbonhidratlara otoagregasyonunun tepkisini analiz etmektir. Otoagregasyonu ölçmek için en çok kullanılan yöntemler, mikrobiyal süspansiyonları, bulanıklığı veya optik yoğunluğu ölçen spektral fotometri ve parlak alan, faz kontrastı ve floresan mikroskobu gibi geleneksel mikroskopi teknikleridir.Yüksek verimli görüntüleme hakkında konuşurken, en büyük deneysel zorluklardan biri tek olay segmentasyonudur. Bu protokolde tek bir agregadır. Görüntüleme akışı sitometrisi bu zorluğu zarif bir şekilde ele alır ve araştırmacılara otoagregasyonu incelemek için güçlü bir araç sağlar.

imaging-flow-cytometry-to-study-microbial-autoaggregation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu yazıda, RAW 264.7 hücreleri tarafından polianhidrid nanopartiküller veya bakteri içselleştirilmesi ölçmek için multi-spektral görüntüleme sitometrisi kullanan bir metodu tanımlar.

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Source: Barbero, A. M., et al. Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates the procedure for labeling host immune receptors that bind bacterial surface antigens, enabling their detection through flow cytometry.

Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry

Biz tarafından salgılanan PSM ve diğer toksinlerin etkisini araştırmak için yöntemler...

Etkileşimi incelenmesi<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Akım Sitometri ve Time Lapse Mikroskopi tarafından Nötrofiller ile

Bu yöntem, bakterilerin fagositozunu ve oksidatif patlamayı aynı anda ölçerek granülosit fonksiyonunu değerlendirmek için bir teknik gösterir. Görüntü tabanlı akış sitometrisi, hepsi göreceli fonksiyonel kapasitelerinde farklılık gösteren üç farklı aktive granülosit alt kümesinin tanımlanmasına izin verdi.

Görüntü tabanlı Sitometrisi Tekniği Granülosit Fonksiyonu Değişiklikleri değerlendirin İn Vitro

Akış Sitometresi görsel kümeleme ile birlikte su biyofilmler çalışmak için kullanımı kolay ve hızlı bir yöntem sunar. Biyofilm karakterizasyonu, biyofilm toplum yapısındaki değişikliklerin tespiti ve biyofilm içinde gömülü abiyotik parçacıklar tespiti için kullanılabilir.

Akış sitometresi ile su biyofilmler karakterizasyonu

Akış sitometrik çözümlemesi saf kültürler araştıran ve mikrobiyal topluluk dinamikleri izleme için değerli kanıtlamıştır. Biz üç kapsamlı iş akışları, örnekleme veri analizi için saf kültürler ve net Orta de olduğu gibi zorlu matrisler, karmaşık toplulukları için gelen sırasıyla mevcut.

Karakteristik Microbiome Dynamics-akış sitometresi doğal topluluklar için iş akışları saf kültürler dayalı

Çığır açan eğriler (BTC'ler), gözenekli ortamda bakterilerin taşınmasını incelemek için etkili araçlardır. Burada, BTC'ler elde etmek için mikroskopik ve akış sitometrik sayma ile birlikte akışkan cihazlara dayalı araçlar sıyoruz.

Akışkan Cihazların Mikroskopi ve Akış Sitometrisi ile Birleştirilmesi, Mekansal Ölçekler Arasında Gözenekli Ortamda Mikrobiyal Taşımayı İncelemek

Bu protokolün amacı ökaryotik patojen insan norovirüsünün bakterilere bağlanmasını ölçmektir. İlk virüs-bakteri eki testi yaptıktan sonra, akış sitometrisi popülasyon içinde viral bağlı bakterileri tespit etmek için kullanılır.

Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi

Diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi ile karakterizasyonu, implantlara karşı immün yanıt paterninin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu makale, diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrik analizi için boyanması için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

Sentetik kistik fibrozis balgam ortamı (SCFM2), bakteriyel agregaları yüksek çözünürlükte gözlemlemek için hem konfokal lazer tarama mikroskopisi hem de floresan ile aktive hücre sıralama ile birlikte kullanılabilir. Bu makalede, antimikrobiyal tedavi sırasında toplam popülasyonları gelecekteki çalışmalar için bir platform olarak değerlendirme yöntemleri ayrıntılı olarak açıklar.

Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyon Modelinin Gerçek Zamanlı Değerlendirilmesi için Araçlar

Öğrenin, Lactobacillaceae türlerinde diyet karbonhidratlarına yanıt olarak mikrobiyal otoagregasyonu görüntüleme akışı sitometrisi ile analiz etmeyi. Bu yüksek verimli yöntem, beslenme ve mikrobiyal davranışlar arasındaki ilişkiyi anlamanıza yardımcı olur.

Mikrobiyal otoagregasyonu incelemek için görüntüleme akışı sitometrisi

Daha fazla video keşfet