Name: Pankreas β Hücrelerinde Mitofaji Akısını Sorgulamak İçin Tamamlayıcı Yaklaşımlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Öğrenin, pankreas β hücrelerinde mitofaji akışını akış sitometrisi ile tek hücre çözünürlüğünde incelemek için mt-Keima genetik raportörü ve MtPhagy floresan boya kombinasyonunu kullanan tamamlayıcı yöntemleri.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

E.L-D. NIH'den (T32-AI007413 ve T32-AG000114) destek alır. SAS, JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), Gazi İşleri Bakanlığı (I01 BX004444), Brehm ailesi ve Anthony ailesi.

Bu protokolde sunulan hayvan çalışmaları, Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Bu çalışma için 15 haftalık düzenli yağ diyeti (RFD) veya yüksek yağlı diyet (HFD) kullanan yirmi haftalık erkek C57BL / 6J fareleri kullanıldı.
1. Boya bazlı MtFagy yaklaşımı ile mitofajinin değerlendirilmesi (Yöntem 1)
<ol><li>Fare adacığı hazırlama ve tedavi<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek adacık kültürü ve valinomisin maruziyetini gerçekleştirin.<ol><li>Daha önce açıklanan yöntemleri izleyerek düzenli yağ diyeti (RFD) veya yüksek yağlı diyet (HFD,% 60 kcal%Yağ 19) farelerinden adacıkları izole edin 2,10.</li>
			<li>100 ünite/mL antimikotik-antibiyotik, 50 ünite/mL penisilin-streptomisin, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM HEPES ve %10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş RPMI ortamında gece boyunca 37 °C'de kültür adacık örnekleri (bkz. Bu ortam "adacık ortamı" olarak anılacaktır.</li>
			<li>Bir pipet kullanarak, 2 mL adacık ortamında 6 cm'lik Petri kaplarına koşul başına 100 adacık seçin. NOT: Bu protokol için kullanılan koşullar: (1) Boyanmamış kontrol: boyanmamış RFD adacıkları; (2) Yalnızca DAPI kontrolü: DAPI ile boyanmış RFD adacıkları; (3) Fluozin-3-sadece kontrol: Fluozin-3-ile boyanmış RFD adacıkları; (4) Sadece MtFaji kontrolü: MtFaji ile boyanmış RFD adacıkları; (5) Sadece TMRE kontrolü: TMRE ile boyanmış RFD adacıkları; (6) RFD işlenmemiş: MtFaji, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış RFD adacıkları; (7) Valinomisine maruz kalan RFD adacıkları: Valinomisine maruz kalan ve MtFaji, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış RFD adacıkları; (8) HFD işlenmemiş: MtFaji, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış HFD adacıkları; (9) Valinomisine maruz kalan HFD adacıkları: Valinomisine maruz kalan ve MtFaji, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış HFD adacıkları.</li>
			<li>Valinomisin'e maruz kalan (7) ve (9) koşullar için (yukarıdaki NOT'a bakınız), mitofajiyi indüklemek için Petri kabındaki adacıklara 3 saat boyunca 2 μL 250 nΜ valinomisin stoğu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.</li>
		</ol></li>
		<li>Tek hücre ayrışması gerçekleştirin.<ol><li>3 saat valinomisin maruziyetinden sonra, bir pipet kullanarak her koşuldan 100 adacığı ayrı mikrosantrifüj tüplerine seçin.</li>
			<li>Adacıkları 10 °C'de 1 dakika boyunca 350 x g'da döndürün ve süpernatanı bir pipet kullanarak atın.</li>
			<li>Numuneleri 2 kez 1 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile, her yıkama arasında sıkma adımlarıyla (350 x g / 1 dk, 10 ° C) yıkayın. Her yıkamadan sonra süpernatanı bir pipetle atın.</li>
			<li>Adacıkları tek hücrelere ayırmak için, adacıkların aşırı sindirimini önlemek için bir numunenin mikrosantrifüj tüpüne 500 μL% 0.05 tripsin (önceden 37 ° C'ye ısıtılmış) ekleyin. Adacıklar gözle görülür şekilde dağılana kadar tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
			<li>Tripsini nötralize etmek için hemen 1 mL önceden ısıtılmış adacık ortamı ekleyin. Her numune için tripsinizasyon ve nötralizasyonu teker teker tekrarlayın.</li>
			<li>Numuneleri 500 x g'da 10 °C'de 5 dakika döndürün. Süpernatanı bir pipetle çıkarın, peleti rahatsız etmemeye dikkat edin. NOT: Valinomisin'e maruz kalan numuneler için pelet hassas olacaktır.</li>
			<li>Numuneleri 2x RPMI ortamıyla, fenol kırmızısı olmadan, 100 birim / mL antimikotik-antibiyotik, 50 birim / mL penisilin-streptomisin, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM HEPES ve% 10 sığır serum albümini (BSA) ile desteklenmiş yıkayın. Bu ortam "adacık akış ortamı" olarak anılacaktır. Her yıkama arasında sıkma adımlarını (350 x g/1 dk, 10 °C) ekleyin. Her yıkamadan sonra süpernatanı bir pipetle atın.</li>
		</ol></li>
		<li>Akış sitometrisine hazırlanmak için hücreleri MtFagy, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyayın.<ol><li>Adacık numunelerini 500 μL adacık akış ortamında yeniden süspanse edin.</li>
			<li>MtPhagy boyası alan tüplere 0.25 μL 100 μM MtFaji stoğu ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) (koşullar 4, 6, 7, 8 ve 9, adım 1.1.1'e NOT).</li>
			<li>TMRE boyası alan tüplere 0.25 μL 100 μM TMRE stoğu ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) (koşullar 5, 6, 7, 8 ve 9).</li>
			<li>Fluozin-3-boyası alan tüplere (koşullar 3, 6, 7, 8 ve 9) 0.25 μL 1 mM Fluozin-3-stoğu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.</li>
			<li>Vorteks tüpleri 5 saniye boyunca düşük hızda karıştırın.</li>
			<li>Işıktan korumak için mikrosantrifüj tüplerini alüminyum folyoya sarın ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun yarısında, vorteks tüplerini 5-10 saniye boyunca düşük hızda karıştırın.</li>
			<li>İnkübasyondan sonra, numuneleri 10 °C'de 1 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatanı atın.</li>
			<li>Numuneleri 500 μL adacık akış ortamında yeniden süspanse edin. 2, 6, 7, 8 ve 9 koşullarına 0,2 μg/mL DAPI (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.</li>
			<li>Numuneleri 350 x g'da 10 °C'de 1 dakika döndürün. Bir pipet kullanarak süpernatanı atın ve 500 μL adacık akış ortamında yeniden süspanse edin.</li>
			<li>Numuneleri buzun üzerine yerleştirin.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Akış sitometrisi<ol><li>Cihazı başlatın (Malzeme Tablosuna bakın). NOT: Uygun filtrelere sahip herhangi bir akış sitometresi çalışacaktır. Bu çalışmada aşağıdaki filtreler kullanılmıştır: (1) DAPI için VL1: Uyarma/Emisyon - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) Fluozin-3-için BL1: Uyarma / Emisyon - 488 nm / 530 nm (30 nm); (3) MtFagy boyası için BL2: Uyarma/Emisyon - 488 nm/590 nm (40 nm); (4) TMRE için YL1: Uyarma/Emisyon - 561 nm/585 nm (16 nm).</li>
		<li>Hücre popülasyonlarının dağılım grafiğinin merkezinde olduğundan emin olmak için ileri (FSC) ve yan saçılma (SSC) voltajlarını ayarlayın. Bu protokol için kullanılan voltajlar, hücrelerin FSC-A vs. içinde eşit şekilde düşmesini sağlamak için FSC için 120 V ve SSC için 260 V idi. SSC-A grafiği (Şekil 1A).</li>
		<li>Tek olmayan hücreleri hariç tutmak için, FSC-H vs. FSC-W ve ardından SSC-H vs. SSC-W (Şekil 1B,C).</li>
		<li>Canlı β hücrelerini filtrelemek için DAPI'nin voltajlarını ve kompanzasyonunu ayarlayın. Boyanmamış RFD örneğine dayalı olarak kullanılan her florofor için floresan kapıları ayarlayın (Şekil 1D-F). NOT: Her kanal için kullanılan voltajlar: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V.</li>
		<li>Geçitler oluşturulduktan sonra örnek başına 10.000 olay toplayın. NOT: Bu geçit yaklaşımı kullanılarak, hem RFD hem de HFD adacıklarında bazal koşullar altında ve valinomisin indüksiyonu üzerine mitofaji seviyeleri değerlendirildi (Şekil 2).</li>
		<li>Analiz için verileri FCS dosyaları olarak kaydedin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Genetik olarak kodlanmış mt-Keima raportörü kullanılarak mitofajinin değerlendirilmesi (Yöntem 2)
<ol><li>Fare adacık hazırlığı ve tek hücreli ayrışma<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek adacık kültürü ve valinomisin maruziyetini gerçekleştirin.<ol><li>Pankreas adacıklarını vahşi tip (WT) ve mt-Keima/+ (mt-Keima) farelerinden izole edin6. Bu yöntemde 20 haftalık erkek WT veya mt-Keima/+ ile beslenen RFD fareler kullanıldı.</li>
			<li>Kültür adacık örnekleri, adacık ortamında 37 °C'de gece boyunca alınır.</li>
			<li>Bir pipet kullanarak, 2 mL adacık ortamı olan 6 cm'lik Petri kaplarına koşul başına 100 adacık seçin. NOT: Bu protokol için kullanılan koşullar: (1) Boyanmamış kontrol: Boyanmamış WT adacıkları; (2) Yalnızca DAPI kontrolü: DAPI ile boyanmış WT adacıkları; (3) Fluozin-3-sadece kontrol: Fluozin-3-ile boyanmış WT adacıkları; (4) mt-Keima sadece kontrol: Boyanmamış mt-Keima/+ adacıkları; (5) Tedavi edilmemiş: Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış mt-Keima/+ adacıkları; (6) Valinomisin: mt-Keima/+ valinomisine maruz kalan ve Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış adacıklar.</li>
			<li>Valinomisin maruziyeti olan durum (6) için, mitofajiyi indüklemek için Petri kabındaki adacıklara 3 saat boyunca 2 μL 250 nM valinomisin stoğu ekleyin.</li>
		</ol></li>
		<li>Tek hücreli ayrışma gerçekleştirin.<ol><li>Adım 1.1.2'de açıklandığı gibi tek hücreli ayrışma adımlarını gerçekleştirin.</li>
		</ol></li>
		<li>Hücreleri Fluozin-3-ve DAPI ile boyayın.<ol><li>Adacık numunelerini 500 μL adacık akış ortamında yeniden süspanse edin.</li>
			<li>Fluozin-3-boyası alan tüplere 0,25 μL 1 mM Fluozin-3-stoğu ekleyin (koşullar 3, 5 ve 6).</li>
			<li>Hücreleri 37 ° C'de inkübe edin ve 1.1.3.5-1.3.10 adımlarında açıklandığı gibi DAPI tedavisine devam edin.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Akış sitometrisi<ol><li>Enstrümanı başlatın. Uygun filtrelere sahip herhangi bir akış sitometresi çalışacaktır. NOT: Bu çalışmada aşağıdaki filtreler kullanılmıştır: (1) DAPI için VL1: Uyarma/Emisyon - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) Fluozin-3-için BL1: Uyarma / Emisyon - 488 nm / 530 nm (30 nm); (3) mt-Keima nötr için VL3: Uyarma/Emisyon - 405 nm/603 nm (48 nm); (4) mt-Keima asidi için YL2: Uyarma / Emisyon - 561 nm / 620 nm (15 nm).</li>
		<li>FSC ve SSC voltajlarını ayarlayın ve 1.2.2-1.2.3 adımlarında açıklandığı gibi tek olmayan hücreleri hariç tutun (Şekil 3A-C).</li>
		<li>Floresan pozitif hücre popülasyonlarının boyanmamış hücrelerden ayırt edilebilmesini sağlamak için boyanmamış ve tek pozitif kontroller (koşullar 1-4) kullanarak DAPI, Fluozin-3-ve mt-Keima için voltajları ve kompanzasyonları ayarlayın. Her kanala uygun kompanzasyon uygulandıktan sonra, canlı β hücrelerini filtrelemek için DAPI negatif kapısı ve Fluozin-3-pozitif kapıları ayarlayın (Şekil 3D-E).</li>
		<li>Asidik ve nötr hücre popülasyonlarını tanımlamak için mt-Keima pozitif örneğini (koşul 4) kullanarak bir üçgen geçit şeması oluşturun (Şekil 3F). NOT: CilttagHer kanal için tipik olarak kullanılır: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V.</li>
		<li>Geçitler oluşturulduktan sonra örnek başına 10.000 olay toplayın. Koşullar 5 ve 6 için geçit şemaları Şekil 3A-G'de gösterilmiştir.</li>
		<li>Analiz için verileri FCS dosyaları olarak kaydedin.</li>
	</ol></li>
</ol>

Murin Pankreatik β-Hücrelerinde Mitofajinin Kantitatif Analizi

<ol><li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+%CE%B2-cell+function%3A+maintaining+the+momentum+for+insulin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).</li>
<li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li>
<li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clec16a%2C+Nrdp1%2C+and+USP8+form+a+ubiquitin-dependent+tripartite+complex+that+regulates+%CE%B2-cell+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li>
<li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+by+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation by mitophagy.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li>
<li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vivo+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Measuring in vivo mitophagy.</a> Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li>
<li>McWilliams, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mito-QC+illuminates+mitophagy+and+mitochondrial+architecture+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).</li>
<li>Aoyagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+beta+cell-specific+mitophagy+reporter+mouse+shows+that+metabolic+stress+leads+to+accumulation+of+dysfunctional+mitochondria+despite+increased+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy.</a> Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).</li>
<li>Ma, X., Ding, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+imaging+based-assay+to+monitor+mitophagy+in+cultured+hepatocytes+and+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Research%22%5BJournal%5D)">A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver.</a> Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).</li>
<li>Sidarala, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+protects+%CE%B2+cells+from+inflammatory+damage+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes.</a> JCI Insight. 5 (24), 141138(2020).</li>
<li>Gingerich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsically+disordered+protein+region+encoded+by+the+human+disease+gene+CLEC16A+regulates+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy.</a> Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).</li>
<li>Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-based+imaging+method+to+measure+in+vitro+and+in+vivo+mitophagy+using+mt-Keima%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima.</a> Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).</li>
<li>Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zinc+indicator+FluoZin-3+is+not+perturbed+significantly+by+physiological+levels+of+calcium+or+magnesium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium.</a> Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).</li>
<li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54(2018).</li>
<li>Thapa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+%CE%B2-cell+function+using+a+zinc-responsive+MRI+contrast+agent+may+identify+first+responder+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 809867(2022).</li>
<li>Iwashita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+mitochondrial+autophagy+with+a+novel+fluorescent+small+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule.</a> ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).</li>
<li>Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mitochondrial+transmembrane+potential+by+TMRE+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361(2016).</li>
<li>Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+intracellular+K%28%2B%29+homeostasis+with+valinomycin+promotes+cell+death+by+mitochondrial+swelling+and+autophagic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes.</a> Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).</li>
<li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+TLR2+and+TLR4+block+the+replication+of+pancreatic+%CE%B2+cells+in+diet-induced+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity.</a> Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).</li>
<li>Sauvat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cellular+viability+by+automated+microscopy+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry.</a> Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).</li>
<li>Liu, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mt-Keima+detects+PINK1-PRKN+mitophagy+in+vivo+with+greater+sensitivity+than+mito-QC%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC.</a> Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).</li>
<li>Mauro-Lizcano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+to+assess+mitophagy+flux+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">New method to assess mitophagy flux by flow cytometry.</a> Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).</li>
</ol>

SAS, Ono Pharmaceutical Co., Ltd.'den hibe fonu almıştır ve Novo Nordisk'in danışmanıdır.

Bu protokol, ayrışmış primer fare adacıklarında mitofaji akısını ölçmek için iki tamamlayıcı yöntemi tanımladı. Mt-Keima yöntemi kullanılarak, mitofajideki bir artış, asidik (561 nm) / nötr (405 nm) hücrelerin oranının artması olarak ölçülürken, MtFaji yönteminde, artan mitofaji akısı, FluozinyüksekMtFajiyüksekTMREdüşük hücre popülasyonunda bir artış olarak ölçüldü. Bu yöntemler, mitofaji akısının hızlı, kantitatif ve β hücreye özgü değerlendirmelerine izin verir.
<p class="jove_conte...

Pankreas β hücreleri, metabolik talepleri karşılamak için insülin üretir ve salgılar ve β hücre disfonksiyonu, hem tip 1 hem de tip 2 diyabette hiperglisemi ve diyabet başlangıcından sorumludur. β-Hücreler, fonksiyonel mitokondriyal kütlerezervine bağlı olan mitokondriyal enerji ve metabolik çıktı yoluyla glikoz metabolizmasını insülin sekresyonu ile birleştirir 1,2,3. Optimal β hücre fonksiyonunu sürdürmek için, β hücreleri, yaşlı veya hasarlı mitokondriyi uzaklaştırmak ve fonksiyonel mitokondriyal kütleyi korumak için mitokondriyal kalite kontrol mekanizmalarına güvenir4. Mitofaji olarak da bilinen seçici mitokondriyal otofaji, mitokondriyal kalite kontrol yolunun önemli bir bileşenidir.
Canlı hücrelerde mitofaji değerlendirmeleri genellikle mitofaji sırasında meydana gelen mitokondriyal pH'daki değişikliklere dayanır. Mitokondri hafif alkali bir pH'a sahiptir ve sağlıklı mitokondri normalde pH-nötr sitozolde bulunur. Mitofaji sırasında, hasarlı veya işlevsiz mitokondri seçici olarak otofagozomlara dahil edilir ve sonunda asidik lizozomlar5 içinde temizlenir. mt-Keima6, mitoQC7 ve CMMR8 gibi birkaç in vivo transgenik mitofaji raportör fare modelinin yanı sıra Cox8-EGFP-mCherry plazmid9 gibi transfekte edilebilir mitofaji probları, mitofajinin kantitatif değerlendirmelerini sağlamak için bu pH değişimini kullanır. mt-Keima pH'a duyarlı çift uyarma oranı metrik probunu eksprese eden transgenik farelerin kullanımı, akış sitometrisi10,11 yoluyla adacıklarda ve β hücrelerinde mitofaji değerlendirmeleri için optimize edilmiştir. Asidik-nötr mt-Keima dalga boyu emisyonlarının oranı (asidik 561 nm'nin nötr 480 nm uyarıma oranı) mitofajiyi 6,12 sağlam bir şekilde ölçmek için kullanılabilir.
Bu protokol, mt-Keima transgenik farelerinden izole edilen primer adacıklarda ve β hücrelerinde mitofaji akısını değerlendirmek için optimize edilmiş bir yaklaşımı açıklar10,11. mt-Keima oldukça hassas bir prob olsa da, ya karmaşık hayvan yetiştirme şemaları ya da hücrelerin transfeksiyonunu gerektirir, bu da diğer genetik modellerle veya birincil insan adacıklarıyla birlikte çalışırken genellikle zor olabilir. Ek olarak, nötr ve asidik hücre popülasyonlarını tanımlamak için çoklu floresan lazerlerin ve dedektörlerin kullanılması, diğer floresan raportörlerin kombinatoryal kullanımını sınırlayabilir.
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, bu protokol aynı zamanda izole fare adacıklarından β hücrelerinde mitofajinin sağlam tespiti için tamamlayıcı, tek floresan kanallı, boya bazlı bir yöntemi de açıklar. MtFagy yöntemi olarak adlandırılan bu yaklaşım, β hücrelerini seçmek, aktif olarak mitofaji geçiren hücre popülasyonlarını ölçmek ve aynı anda mitokondriyal membran potansiyelini (MMP veya Δψm) değerlendirmek için üç hücre geçirgen boyanın bir kombinasyonunu kullanır.
Bu boyalardan ilki, Ex/Em 494/516 nm13'e sahip hücre geçirgen bir Zn2+ göstergesi olan Fluozin-3-'dir. Fare adacıkları, α, β, δ- ve PP hücreleri dahil olmak üzere işlevsel olarak farklı hücrelerden oluşan heterojen bir popülasyon içerir. β-Hücreleri, fare adacığı içindeki hücrelerin yaklaşık% 80'ini oluşturur ve insülin granülleri14,15 içindeki yüksek Zn2+ konsantrasyonları nedeniyle diğer adacık hücre tiplerinden ayırt edilebilir, bu da β hücrelerinin Fluozin-3-yüksek popülasyonu olarak tanımlanmasına izin verir. Kimyasal bir bağ yoluyla mitokondri üzerinde hareketsiz hale getirilen ve zayıf floresan yayan pH'a duyarlı bir boya olan MtPhagy boyası da bu protokoldekullanılmaktadır 16. Mitofaji indüksiyonu üzerine, hasarlı mitokondri asidik lizozoma dahil edilir ve MtFagy boyası, düşük pH ortamında (Ex/Em 561/570-700 nm) floresan yoğunluğunu arttırır.
Ek olarak, MMP'yi değerlendirmek için Tetrametilrodamin, etil ester (TMRE) kullanılır. TMRE, membran potansiyeli 17 tarafından desteklenen nispi negatif yük nedeniyle sağlıklı mitokondri tarafından tutulan, hücre geçirgen pozitif yüklü bir boyadır (Ex/Em552/575 nm). Hasarlı veya sağlıksız mitokondri, membran potansiyellerini dağıtır ve bu da TMRE'yi ayırma yeteneğinin azalmasına neden olur. Bu boyalar birlikte kullanıldığında, mitofajiye uğrayan β hücreleri, akış sitometrisi yoluyla FluozinyüksekMtFajiyüksekTMREdüşük popülasyonu olarak tanımlanabilir. Mitofaji statik bir süreçten ziyade dinamik bir süreç olduğundan, bu protokol, MMP18'in dağılmasını takiben mitofajiyi indükleyen bir K+-iyonofor olan valinomisin kullanılarak mitofaji akısını değerlendirmek için optimize edilmiştir. Valinomisin varlığında ve yokluğunda mitofajinin karşılaştırılması, farklı örneklem gruplarında mitofaji akısının değerlendirilmesine olanak tanır.
Mevcut yaklaşımın boya bazlı doğası, insan adacıklarına ve diğer transfekte edilmesi zor hücre tiplerine tahmin edilmesine izin verir ve mt-Keima protokolünün aksine karmaşık hayvan yetiştirme şemalarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Bu protokolün genel amacı, iki bağımsız akış sitometrisi tabanlı yöntemle tek hücre düzeyinde β hücrelerde mitofajiyi ölçmektir. Birlikte ele alındığında, bu protokol, mitokondriyal kalite kontrolünün kantitatif çalışmasında hem kesinlik hem de esneklik sağlayan iki güçlü ve tamamlayıcı yöntemi açıklar.

<table><tbody><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Akış Sitometresi</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A24858</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>317275</td><td></td></tr><tr><td>Yağ Asidi Serbest ısı şoku BSA tozu</td><td>Equitech</td><td>BAH66</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>İkizler Bio</td><td>900-108</td><td></td></tr><tr><td>Fluozin-3AM&nbsp;</td><td>Thermofisher Bilimsel&nbsp;</td><td>F24195</td><td>100 ve mu; g Fluozin-3AM tozu, 51 & mu'da yeniden yapılandırıldı; L DMSO ve 51 &mu; L Pluronic F-127 1 mM stoka ulaşacak.</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; RPMI 1640 Orta Fisher</td><td>Scientific</td><td>11-875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MtPhagy boya</td><td>Dojindo</td><td>MT02-10</td><td>5 &mu; g MtPhagy tozu 50 &mu ile sulandırıldı; L DMSO 100 &mu'ya ulaşmak için; M hissesi.&nbsp;</td></tr><tr><td>MtPhagy boya</td><td>Dojindo</td><td>MT02-10</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (100x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td>1x ddH2O Fosfat tamponlu tuzlu suda 1:10 seyreltilerek prokotolde kullanılan</td></tr><tr>çözelti<td>, 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>ddH2O Sodyum Pirüvat (100x)Yaşamda 1:10 seyreltilerek prokotolde kullanılan çözelti</td></tr><tr><td></td><td> Teknolojiler</td><td>11360-070</td><td>5 &mu; g MtPhagy tozu 50 &mu ile sulandırıldı; L DMSO 100 &mu'ya ulaşmak için; M hissesi.&nbsp;</td></tr><tr><td>TMRE [Tetrametilrodamin, etil ester, perklorat]</td> <td>Anaspec</td><td>AS-88061</td><td>TMRE tozu, DMSO'da 100 & mu'ya ulaşacak şekilde yeniden yapılandırıldı; M hisse senedi.</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Valinomisin</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Valinomisin tozu, 250 nM stoğuna ulaşmak için DMSO'da yeniden yapılandırıldı.</td></tr></tbody></table>

pankreas β hücrelerinde mitofaji akısını sorgulamak İçin tamamlayıcı yaklaşımlar

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Mitofaji, optimal mitokondriyal fonksiyonu sürdürmek için gerekli bir kalite kontrol mekanizmasıdır. Disfonksiyonel β hücreli mitofaji, yetersiz insülin salınımına neden olur. Mitofajinin gelişmiş kantitatif değerlendirmeleri genellikle genetik raportörlerin kullanılmasını gerektirir. Akış sitometrisi yoluyla mitofajiyi ölçmek için mitokondri hedefli pH'a duyarlı çift uyarma oranı metrik probunu ifade eden mt-Keima fare modeli, β hücrelerde optimize edilmiştir. Asidik-nötr mt-Keima dalga boyu emisyonlarının oranı, mitofajiyi sağlam bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, karmaşık genetik fare modelleri veya birincil insan adacıkları gibi transfekte edilmesi zor hücrelerle çalışırken genetik mitofaji raportörlerini kullanmak zor olabilir. Bu protokol, MtFagy kullanarak birincil adacıklarda β hücreli mitofajiyi ölçmek için yeni bir tamamlayıcı boya bazlı yöntemi açıklar. MtFagy, mitokondride biriken ve mitofaji sırasında lizozomlar gibi mitokondri düşük pH'lı ortamlarda olduğunda floresan yoğunluğunu artıran, pH'a duyarlı, hücre geçirgen bir boyadır. MtFagy boyasını, β hücrelerini seçen bir Zn2+ göstergesi olan Fluozin-3-ve mitokondriyal membran potansiyelini değerlendirmek için Tetrametilrodamin, etil ester (TMRE) ile birleştirerek, mitofaji akısı, akış sitometrisi yoluyla β hücrelerde spesifik olarak ölçülebilir. Bu iki yaklaşım oldukça tamamlayıcıdır ve çok sayıda β hücreli modelde mitokondriyal kalite kontrolünün değerlendirilmesinde esneklik ve kesinlik sağlar.

Boya bazlı MtFagy yaklaşımı ile mitofajinin değerlendirilmesi Bu boya bazlı yaklaşım, ölü hücreleri dışlamak için DAPI'nin yanı sıra Fluozin-3-, TMRE ve MtPhagy kullanılarak, genetik bir raportöre ihtiyaç duymadan birincil fare β hücrelerindeki mitofaji akışını analiz etmek için optimize edilmiştir. Bu protokol, mitofajiyi indüklemek için bu boyaları valinomisin ile eşleştirerek, birincil fare β hücrelerinde mitofaji akısını seçici olarak ölçmek için boya bazlı bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir<sup ...

Bu protokol, pankreas β hücrelerinde mitofajinin kantitatif analizi için iki yöntemi özetlemektedir: birincisi, hücre geçirgen mitokondriye özgü boyaların bir kombinasyonu ve ikincisi, genetik olarak kodlanmış bir mitofaji raporlayıcısı. Bu iki teknik tamamlayıcıdır ve belirli ihtiyaçlara göre konuşlandırılabilir, bu da mitokondriyal kalite kontrolünün nicel olarak ele alınmasında esneklik ve kesinlik sağlar.

Pankreas β Hücrelerinde Mitofaji Akısını Sorgulamak İçin Tamamlayıcı Yaklaşımlar

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...

Protokolümüz, akış sitometrisi yoluyla tek hücre çözünürlüğünde beta hücre mitofaji akısını incelemek için iki tamamlayıcı yöntemi açıklar. mt-Keima protokolü genetik bir mitofaji raportörü kullanırken, MtPhagy protokolü üç floresan boyayı birleştirir, bu da insan örneklerinde transfekte edilmesi zor hücrelere ekstrapolasyon yapmayı kolaylaştırır. Geleneksel biyokimyasal yaklaşımlar ve görüntüleme yaklaşımları kullanılarak mitofajinin değerlendirilmesi hem zaman alıcı hem de zordur.Bu nedenle, beta hücrelerinde mitofaji akısını incelemek için yeni, sağlam ve etkili yöntemler geliştirmek önemlidir. Hem mt-Keima hem de MtPhagy yöntemi, pankreas beta hücrelerinde mitofaji akısını incelemek için etkili olan kantitatif değerlendirmelerdir. Bu nedenle, Soleimanpour laboratuvarı pankreas beta hücre yetmezliği ve diyabeti yönlendiren farklı mekanizmalara odaklanmaktadır.Ve özellikle mitokondriyal fonksiyondaki kusurların diyabet gelişimini nasıl yönlendirdiğini anlamak için mitofaji de dahil olmak üzere mitokondriyal yaşam döngüsünün farklı yönlerine odaklanıyoruz.

complementary-approaches-to-interrogate-mitophagy-flux-pancreatic

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, hasarlı mitokondrinin seçici olarak uzaklaştırılması sırasında EYFP-Parkin'in zamansal alımını ölçmek için hızlandırılmış bir video mikroskobu yaklaşımını ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Hasarlı mitokondrinin EYFP-Parkin'e bağlı olarak uzaklaştırılmasının bu dinamik süreci, farklı deneysel koşullar altında hücresel sağlığın bir göstergesi olarak kullanılabilir.

Hücresel Mitophagy için bir Marker olarak EYFP-Parkin Toplama Değerlendirme Time-Lapse video Mikroskopi

Mitophagy, takas zarar mitokondri, süreci mitokondrial homeostazı ve sağlık bakım için gereklidir. Bu makale en son mitophagy bazılarını algılama yöntemleri insan hücreleri, Caenorhabditis elegansve fareler sunar.

Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

Bu protokol, özellikle primer insan Islet örneklerinden Beta hücrelerinde mitofagoy protein kompleksi oluşumunun nicel analizi için bir yöntem özetliyor. Bu teknik, değerli insan pankreatik beta hücre örneklerinde önemli olan sınırlı biyolojik materyalden mitophaginin analizini sağlar.

Yakınlık ligasyon assay kullanarak ınsan pankreatik Beta hücrelerinde situ Içinde endojen Mitophagy kompleksleri görselleştirme

Mitofaji, mitokondriyal kalite kontrolünün birincil mekanizmasıdır. Bununla birlikte, in vivo mitofajinin değerlendirilmesi, güvenilir kantitatif tahlillerin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, hücre pervasıtalı yeşil-floresan mitokondri boyası ve kırmızı-floresan lizozom boyası kullanılarak canlı hücrelerde mitofajinin gözlemlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Mitokondri ve Lizozom için Floresan Boyalarla Mitopajinin Görselleştirilmesi

Bu protokolün amacı, LC3 immünofloresan ve LC3 nokta ölçümü yoluyla pankreas kanseri ve pankreas asinar hücrelerinde otofajik düzeyleri belirlemektir.

LC3 İmmünofloresan Kullanılarak İki Farklı Pankreas Hücre Modelinde Otofaji Düzeylerinin Değerlendirilmesi

Mitofaji'yi elektron mikroskobu, genetik sensörler ve immünofloresan yoluyla keşfetmek, pahalı ekipman, yetenekli personel ve önemli bir zaman yatırımı gerektirir. Burada, ticari bir floresan boya kitinin hem Caenorhabditis elegans hem de bir karaciğer kanseri hücre hattındaki mitopaji sürecini ölçmedeki etkinliğini gösteriyoruz.

Caenorhabditis elegans ve Memeli Hücrelerinde Mitopajinin Organele Özgü Boyalar Kullanılarak Saptanması

Murin Pankreas Adacık İzolasyonu

Doku Mühendisliği Deneysel Yaklaşımlar

, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu için prosedürler: değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanılarak (bölüm I sindirim ve pankreas dokusu toplanması).

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm I: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon

Sanal kesit görüntüleme için aşağıdaki protokol pankreas diseksiyonu sürecini özetliyor ve sonraki tüm pankreas tüm GFP etiketli beta-hücrelerinin kantifikasyon.

Farelerde, pankreatik beta-hücre Kütle yerinde Niceleme

Öğrenin, pankreas β hücrelerinde mitofaji akışını akış sitometrisi ile tek hücre çözünürlüğünde incelemek için mt-Keima genetik raportörü ve MtPhagy floresan boya kombinasyonunu kullanan tamamlayıcı yöntemleri.

Pankreas β Hücrelerinde Mitofaji Akısını Sorgulamak İçin Tamamlayıcı Yaklaşımlar

Daha fazla video keşfet