Name: Aşil Tendonu Sıkışmasının Mekanobiyolojisini İncelemek için Murin Hind Limb Eksplant Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Keşfedin, murin arka ekstremite eksplant modeli kullanarak aşil tendonu sıkışmasının mekanobiyolojisini. Bu yöntem, çok eksenli mekanik gerinim desenlerini karakterize ederek fibrokıkırdak değişimlerini incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, Rochester Üniversitesi Kas-İskelet Araştırmaları Merkezi'nin Histoloji, Biyokimya ve Moleküler Görüntüleme (HBMI) Çekirdeği'nden Jeff Fox ve Vidya Venkatramani tarafından sağlanan ve kısmen P30AR06965 tarafından finanse edilen destek ve yardım için minnettardır. Ek olarak, yazarlar multifoton mikroskobu ile ilgili yardımları için Rochester Üniversitesi Tıp Merkezi'ndeki Işık Mikroskobu ve Nanoskobu Merkezi'ne (CALMN) teşekkür eder. Bu çalışma R01 AR070765 ve R01 AR070765-04S1'in yanı sıra 1R35GM147054 ve 1R01AR082349 tarafından finanse edilmiştir.

Tüm hayvan çalışmaları, Rochester Üniversitesi Hayvan Kaynakları Komitesi tarafından onaylandı.
1. Doku kültürü ortamının hazırlanması
<ol><li>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (1x DMEM) tüm eksplantları 37 °C ve% 5 CO2'de bir inkübatörde %1 v / v penisilin-streptomisin ve 200 μM L-askorbik asit ile kültürleyin. İlk 48 saatlik ön işlem için, her bir eksplantın 100 nM deksametazon74 ile desteklenmiş 70 mL kültür ortamında kültürlenmesi. Ön tedaviden sonra, her 48-72 saatte bir ortam değiştirerek, deksametazon olmadan 7 gün daha kültür uzuvları. NOT: Kültür ortamına fetal sığır serumu gibi serumların eklenmesi, Wunderli, Blache ve Snedeker57 tarafından sağlanan önerilere uygun olarak tavsiye edilmez. Kısaca, serumsuz koşullar, in vivo olarak var olan avasküler, besin açısından fakir tendon mikro ortamını daha iyi temsil eder. Ayrıca, serum takviyesi, belirli kültür koşulları altında doku bozulmasınıteşvik edebilir 75 ve tendon patolojisinin57 her iki özelliği olan hücre proliferasyonunu ve doku dışına göçü uyarabilir.</li>
	<li>Yüksüz grup için, her bir eksplantı 70 mL besiyerinde kültürleyin. Temel gerilim ve statik çarpma grupları için, her platform, uzvu su altında tutmak için yaklaşık 125 mL kültür ortamı gerektirir. Bu hacim, üst bacağın tutamaklardaki konumuna ve başta dolgu yoğunluğu olmak üzere 3D baskı parametrelerine bağlı olarak değişebilir.</li>
</ol>2. Eksplant diseksiyon ve deksametazon ön tedavisi
<ol><li>Fareleri CO2 inhalasyonu ve sekonder servikal çıkık yoluyla veya kurumsal yönergelere göre ötenazi yapın. Bu protokol, 1 yaşından küçük C57BL/6 fareleri kullanır. Arka uzuv boyutu yaşla birlikte artacaktır ve tutamaklara sığması zorlaşabilir.</li>
	<li>Diseksiyondan önce, 70 mL önceden ısıtılmış (37 °C) kültür ortamını steril bir biyolojik güvenlik kabininde (BSC) 100 mm (çap) x 25 mm (yükseklik) Petri kabına aktarın. 100 nM çalışma konsantrasyonu elde etmek için deksametazon ekleyin.</li>
	<li>Diseksiyonlar, arka ekstremite eksplantlarını BSC'ye aktarmadan önce diseksiyon boyunca hızlı bir şekilde çalışarak, emici alt pedler kullanılarak tezgah üzerinde gerçekleştirilebilir. Pürüzsüz, düz, ince uçlu forseps içeren bu diseksiyon için gerekli cerrahi aletleri bir araya getirin; tırtıklı dişlere sahip düz, ince uçlu forseps; ve düz, keskin, ince makas.</li>
	<li>Arka bacak eksplantlarının diseksiyonu için, fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve kalça eklemini tanımlayın. İnce makas kullanarak, üst bacağın proksimal ve anterior (kraniyal) yönünü kaplayan deriden küçük (5-10 mm) bir kesi yapın.</li>
	<li>Genişletmek için kesiği ayırın, açıkta kalan üst bacağı parmaklarınızı kullanarak sıkıştırın ve arka uzuvu ayak bileği seviyesine çıkarmak için cildi dikkatlice distal olarak çekin. Bir makas bıçağını ayağın dorsal yönü boyunca derinin altına nazikçe sokun ve ayak parmaklarına uzanan bir kesi yapın. Tamamen çıkarmak için cildi distal olarak çekmeye devam edin.</li>
	<li>Aşil tendonunun ayak bileğine yakın kalkaneusun arka (kaudal) yönüne yerleştirilmesini görselleştirmek için fareyi konumlandırın. Aşil tendonu girişinin proksimalinde, plantaris tendonu doğrudan Aşil tendonunun medial sınırına bitişik olarak uzanır ve kalkaneusun arka yönünden geçerek ayağın plantar yönüne doğru distal olarak uzanır.</li>
	<li>Plantaris tendonunu çıkarmak için, pürüzsüz, ince uçlu forsepslerin bir ucunu iki tendon arasına dikkatlice yerleştirin ve ucu plantaris tendonunun altından medial olarak uzatın. Ucu proksimal olarak çizin ve plantaris kasını yırtın. İnce uçlu, tırtıklı forseps kullanarak, plantaris tendonunun ayrılmış proksimal ucunu tutun ve çıkarmak için distal olarak çekin.</li>
	<li>Kalça ekleminde, pelvisi kesmek ve arka bacakları izole etmek için ince makas kullanın. Kalan pelvisi kaldırmak ve femur başını ortaya çıkarmak için makası kullanın.</li>
	<li>Arka bacak eksplantını BSC'ye ve deksametazon içeren hücre kültürü ortamı içeren tabağa aktarın. Çanağı inkübatöre taşıyın ve 48 saat boyunca ön işlemden geçirin.</li>
</ol>3. Eksplant kültürü ve yükleme platformları
<ol><li>48 saatlik ön işlem sona erdiğinde, yeterli miktarda kültür ortamını önceden ısıtın (bölüm 1). Bu noktadan itibaren, kültür ortamına deksametazon eklenmeyecektir. Şu anda, ön işlem görmüş (0. gün) grubundaki uzuvlar sabitlenebilir, kireçten arındırılabilir ve gelecekteki kesit, boyama ve analiz için parafine gömülebilir.</li>
	<li>Yüksüz grup için, ön işlem ortamını aspire edin ve eksplantları taze Petri kaplarına aktarın, her birine 70 mL kültür ortamı ekleyin ve inkübatöre geri dönün.</li>
	<li>Temel gerilim ve statik çarpma grupları için eksplant platformları hazırlayın. Kavrama plakalarına benzer boyutta zımpara kağıdı parçaları kesin. Statik çarpma grubu için, yaklaşık 18 inç uzunluğunda örgülü ip parçalarını kesin ve hattın uzunluğu boyunca yarıya kadar gevşek bir el üstü düğümü önceden bağlayın. Her akrilik banyoyu kaplayacak şekilde alüminyum folyo parçalarını yırtın ve p etanol (EtOH) püskürtün. Hazırlıkları BSC'ye aktarın.</li>
	<li>Her platform bir akrilik banyo, taban, hacim azaltma eki, klips ve kulplar içerir. Her tutamak, iki merdane ve tutamakları tabana bağlayan bir M5 x 0,8 mm diş x 10 mm uzunluğunda vida dahil olmak üzere üç farklı tipte vida içerir; kulpları sıkıştırmak için plakaları uzatan iki M6 x 1 mm diş x 20 mm uzunluğunda vida; ve dört sıkıştırma yayı ile birlikte kulpları açmak için plakaları geri çeken dört adet M3 x 0,5 mm diş x 14 mm uzunluğunda vida.</li>
	<li>Tüm bileşenleri, bir sızıntı durumunda tüm kültür ortamlarını yakalayabilen ikincil kaplara yerleştirin. % 10'luk ≥ çamaşır suyu çözeltisine batırın ve en az 1 saat bekletin. Çamaşır suyu solüsyonunu musluk suyuyla durulayın (gerektiğinde otoklav) ve BSC'ye geçin. NOT: Kirlenmeyi gidermek için tüm musluk suyunu otoklavlamayı veya arıtılmış su kullanmayı düşünün. Kontaminasyonu ele alırken ek ipuçları için Tartışma'ya bakın.</li>
	<li>Merdaneleri tutamaklara takmak için M3 vidaları ve sıkıştırma yaylarını kullanın, M5 vidayı kullanarak tutamakları tabana sabitleyin ve M6 vidaları merdanelere oturana kadar takın. Zımpara kağıdını plakalara yapıştırmak için çift taraflı bant kullanın, ardından zımpara kağıdının plakalara yapışmasını sağlamak için tutamakları kapatın. Tüm platformlar için tekrarlayın.</li>
	<li>Bir platform yüklemeye hazır olduğunuzda, tutamakları tamamen açın ve forseps kullanarak, üst bacağı ve dizini Aşil tendonunun yüzeysel yüzeyi yukarı bakacak şekilde plakaların arasına yerleştirin (Şekil 1A). Yavaşça yerinde tutmak için tutamakları gevşek bir şekilde kapatın.</li>
	<li>Açıkta kalan femur başını veya ayağını tutmak için forseps kullanın ve yerine sabitlemek için tutamakları kademeli olarak kapatırken diz fleksiyon açısını manipüle edin. Başlangıç gerginlik grubu için, diz eklemini daha önce açıklandığı gibi uzatın. Diz uzatıldığında kavramalar sıkılaştıkça, ayak bileği doğal olarak uzamalıdır. Statik sıkışma grubu için, diz eklemini daha önce açıklandığı gibi tutamaklar arasında esnetin.</li>
	<li>Statik çarpma grubu için, ipin üst düğümünü distal pençenin etrafına yerleştirin ve sıkın. İpi, eksplantın altında bulunan tabandaki bir yuvadan ve klips deliğinden geçirin. Tabanı akrilik banyoya yerleştirin ve klipsi banyonun üst kenarına sabitleyin (Şekil 1A).</li>
	<li>Ayağı kaval kemiğine göre en az 110° dorsiflex yapmak için ipi çekin ve ipi klipsten çıkarken işaretlemek için kalıcı bir işaretleyici kullanın. Daha sonra dorsifleksiyon açısını ölçmek için bu pozisyonda eksplantın bir fotoğrafını çekin (Şekil 1A).</li>
	<li>Tabanı çıkarın ve tabandaki bir ray boyunca kaydırarak hacim azaltma ekini takın. Tabanı (şimdi hacim azaltma ekine takılı) akrilik banyoya geri yerleştirin ve klipsi üst kenara yeniden yerleştirin. İşaretli ipi kılavuz olarak kullanarak orijinal dorsifleksiyon açısına dönmek için ipi çekin ve statik dorsifleksiyonu korumak için ipi banyonun dışına bantla sabitleyin.</li>
	<li>Temel gerginlik grubu için, eksplant tutamaklar arasına yerleştirildikten sonra hacim azaltma eki olan tabanı akrilik banyoya yerleştirin ve dorsifleksiyon açısının ölçülmesi için bir fotoğraf çekin.</li>
	<li>Eksplantları daldırmak için her platforma 125 mL önceden ısıtılmış (37 °C) kültür ortamı ekleyin. Banyonun üstünü alüminyum folyo ile örtün, ikincil bir kaba koyun ve inkübatöre taşıyın. 7 ek gün boyunca kültür, her 48-72 saatte bir medya değiştirme. NOT: Banyonun üst kısmına yerleştirilen bant, PLA parçalarının yüzmesini önleyebilir.</li>
</ol>4. Fiksasyon, dekalsifikasyon ve parafin gömme
<ol><li>Eksplant kültürünü takiben, ayak tırnaklarını/distal ayak parmaklarını kesmek için makas kullanın ve Aşil miyotendinöz bileşkesinin proksimalindeki üst bacağı kesin. Kesilen her ayak bileği eklemini köpük biyopsi pedleriyle kaplı bir işleme kasetine yerleştirin. Ayak bileğini yaklaşık 90° dorsifleksiyonda konumlandırmak için ayak bileğini kaset köşesine itin ve yerinde tutmak için kaseti kapatın.</li>
	<li>% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) içinde 3 gün boyunca sabitleyin ve pH'ı 7.4-7.6'ya ayarlanmış pH'ı 7.4-7.6'ya ayarlanmış damıtılmış suda (diH2O) çözülmüş% 14 etilendiamentetraasetik asit (EDTA) içinde 2 hafta boyunca kireçten arındırın.</li>
	<li>Tuzları çıkarmak için, numuneleri her iki 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ve ardından diH2O, her biri 5 dakika içinde üç kez iyice durulayın. Parafin histolojisi için rutin numune işleme gerçekleştirin: dereceli bir dizi EtOH ile dehidre edin, ksilen içinde temizleyin ve parafin mumu ile sızın. Aşağıdaki bölüm 5'te açıklandığı gibi medial-lateral ilerlemede Aşil tendonu boyunca sagital doku kesitleri elde etmek için örnekleri parafine yönlendirin ve gömün (Şekil 1B).</li>
</ol>5. Doku kesiti
<ol><li>Bir mikrotomla, bölümler blok yüzüne paralel olana kadar numuneyi dikkatlice kesin. Eklemin medial yönünden ayak bileğine kaba bir şekilde kesin, Aşil tendonu girişinin medial sınırına ulaşmadan önce durun.</li>
	<li>Sıcaklığı ve hidrasyonu ayarlamak için numuneyi bir buz bloğuna aktarın ve bıçakları değiştirin (veya mevcut bıçağın yeni bir bölümüne geçin). Numuneye 10 μm kalınlığında kesit almaya devam edin ve parlak alan mikroskobu ile Aşil tendonu girişine girişi dikkatlice belirleyin. Tanımlandıktan sonra, tüm Aşil tendonu yerleştirme boyunca seri kesit izleme bölüm numarasını (yani doku derinliği) gerçekleştirin.</li>
</ol>6. Deparafinizasyon/rehidrasyon ve lam seçimi
<ol><li></li></ol><ol><li></li><li><li></li><li><li></ol><ol><li></li><li><li><li> </li><li><li><li></li><li></li><li><li></li><li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65801/65801eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> </li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65801/65801eq02.jpg" style="margin: auto;"></li><li></ol><ol><li><li></li><li></li><li> </li><li><li></ol>

Tendon Sıkışmasını Anlamak – Mekanobiyoloji Çalışmak için Murin Eksplant Modeli

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu çalışmada tarif edilen doku kültürü protokolü ile eşleştirilmiş deneysel murin arka ekstremite eksplant platformu, Aşil tendonu girişinde sıkışmaya bağlı fibrokartilaj oluşumunun mekanobiyolojisini incelemek için uygun bir model sağlar. Bu eksplant modelinin faydası, 7 günlük statik sıkışmadan sonra Toluidin mavisi boyamasında önemli ve mekansal olarak heterojen bir değişiklikle birlikte hücre canlılığının korunmasını gösteren temsili sonuçlarla gösterilmiştir. Bu bulgular, diğer modeller ve klinik çalışmalarla tutarl...

Aşil tendonu ve rotator manşet tendonları da dahil olmak üzere çok sayıda tendon, normal anatomik konumlandırma nedeniyle kemik sıkışması yaşar1,2,3,4. Tendon sıkışması, uzunlamasına lif eksenine enine yönlendirilmiş basınç gerilimi oluşturur5,6,7. Tendon sıkışma bölgeleri, büzülmüş, yuvarlak hücrelerin (fibrokondrositler) belirgin şekilde artmış glikozaminoglikan (GAG) içeriğine sahip düzensiz bir kollajen ağı içine gömüldüğü benzersiz bir fibrokartilaj fenotipi gösterir2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Önceki çalışmalar, tendon sıkışması tarafından üretilen farklı mekanik ortamın, altta yatan mekanizmalar belirsiz olsa da, büyük agrega eden proteoglikanların, özellikle de agreganın birikmesini sağlayarak bu GAG açısından zengin matrisi sürdürdüğünü göstermektedir1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Fibrokartilaj, sağlıklı tendonların sıkışmış bölgelerinde normal bir özellik iken, aşırı fibrokartilaj oluşumu ile ilişkili anormal proteoglikan metabolizması, kronik olarak sıkışan tendonlarda orantısız bir şekilde ortaya çıkan yaygın ve zayıflatıcı bir hastalık olan tendinopatinin ayırt edici bir özelliğidir1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Buna göre, tendon sıkışması, rotator manşet hastalığı ve insersiyonel Aşil tendinopatisi (IAT) dahil olmak üzere en yaygın tendinopatilerin birçoğunu tetikleyen önemli bir ekstrinsik faktör olarak klinik olarak kabul edilmektedir50,51,52. Günümüzde tendinopati tedavisi yetersizdir. Örneğin, ÖÇT'li hastaların yaklaşık% 47'si başarısız konservatif tedaviden sonra cerrahi müdahaleye ihtiyaç duyar ve postoperatif sonuçlar değişkendir53,54,55,56. Sıkışma ve tendinopati arasındaki belirgin ilişkiye rağmen, sıkışan tendondaki hücrelerin mekanik ortamlarını algıladıkları ve tepki verdikleri mekanobiyolojik mekanizmalar yetersiz tanımlanmıştır, bu da tendinopati patogenezinin anlaşılmasını engellemekte ve yetersiz tedaviye neden olmaktadır.
Eksplant modelleri, tendon mekanobiyolojisi57,58 çalışmasında yararlı araçlardır. Tendon sıkışmasının mekanobiyolojisini anlamaya yönelik ilk adım olarak, daha önce yapılan birkaç çalışma, hücrelere basit tek eksenli kompresyon uygulanmasını veya eksize edilentendon eksplantlarını takiben hücresel yanıtı araştırmıştır 27,29,30,31,32,33,34,39. Bununla birlikte, in vitro hücreler, gerinim transferini kolaylaştıran, mekanik deformasyonla salınan önemli büyüme faktörlerini ve sitokinleri tutan ve mekanotransdüksiyonda rol oynayan fokal yapışma kompleksleri için substrat sağlayan hücre dışı ve periselüler matrislerden yoksundur57,59. Ek olarak, hem in vitro hem de eksize edilmiş eksplant çalışmaları, sıkışan bölgeninanatomik özelliklerine bağlı olarak in vivo tendon sıkışması tarafından üretilen çok eksenli mekanik gerilme ortamını özetlemekte başarısız olmaktadır 5,6. Sıkışan Aşil tendonu girişi bağlamında, bu, retrokalkaneal bursa ve Kager yağ yastığı 60,61,62,63 gibi çevre dokuları içerir. Tersine, tendon sıkışmasının in vivo modelleri 25,28,36,37,38,64,65,66, doğrudan tendona uygulanan yükün büyüklüğü ve sıklığı üzerinde minimum kontrole izin verir, bu da tendon mekanobiyolojisini incelemek için in vivo modellerin iyi bilinen bir sınırlamasıdır 57,58,67,68,69,70. Tendon gerilmesinin in vivo olarak ölçülmesindeki zorluklar göz önüne alındığında, bu modellerde üretilen iç gerinim ortamı genellikle zayıf bir şekilde karakterize edilir.
Bu yazıda, bu doku kültürü protokolü ile eşleştirildiğinde, eksplant kültüründe 7 gün boyunca canlılığı koruyan ve tendon sıkışmasının biyolojik sekellerinin incelenmesine izin veren, tüm murin arka uzuv eksplantları içinde kalkaneus üzerine Aşil tendonu girişinin sıkışmasını yeniden oluşturan özel bir deneysel platform sunuyoruz. Platform, kulpların tutturulması için temel sağlayan 3D baskılı bir polilaktik asit (PLA) tabanı ve 3D baskılı PLA hacim azaltma eki üzerine inşa edilmiştir. Tutamaklar, üst bacak ve dizini Aşil miyotendinöz bileşkesine proksimal, arka bacak kaudal yönü yukarı bakacak şekilde sıkıştırmak için kullanılır ve Aşil tendonunun bir ultrason probu veya ters mikroskop kullanılarak yukarıdan görüntülenmesine izin verir (Şekil 1A). Hacim azaltma eki, tabandaki bir iz boyunca kayar ve gerekli doku kültürü ortamı hacmini azaltır. Arka pençenin etrafına sarılmış örgülü bir çizgi, taban tasarımı ve 3D baskılı bir PLA klipsi kullanılarak platformdan dışarı yönlendirilir. İpi çekerek, arka pençe dorsiflekse edilir ve Aşil tendonu girişi kalkaneusa çarparak enine basınç gerilmesininartmasına neden olur 5,6 (Şekil 1A). Platform, doku kültürü ortamına batırılmış arka bacak eksplantlarını koruyan akrilik bir banyo içinde bulunur. Gergin ipin yapışkan bantla banyonun dışına sabitlenmesi, Aşil tendonu girişinin statik sıkışmasını sağlamak için ayak bileği dorsifleksiyonunu korur. 3D baskılı bileşenler için CAD dosyaları, deneysel ihtiyaçlara uyacak şekilde değişiklik için bir dizi ticari ve ücretsiz, açık kaynaklı CAD yazılımına içe aktarmaya izin veren birden fazla formatta (Ek Dosya 1) sağlanır. İmalat için 3D yazıcılara erişim mevcut değilse, CAD dosyaları, parçaları düşük maliyetle basacak ve gönderecek çevrimiçi 3D baskı hizmetlerine sağlanabilir.
Daha da önemlisi, triceps surae-Achilles kas külotendinöz kompleksi hem diz hem de ayak bileği eklemlerini kapsar 71,72,73. Sonuç olarak, Aşil tendonundaki gerilme gerilmesi diz fleksiyonundan etkilenir. Diz ekstansiyonu Aşil tendonunu gergin hale getirirken, diz fleksiyonu gerginliği azaltır. Önce dizi uzatarak ve daha sonra ayak bileğini pasif olarak dorsiflekse ederek, sıkışan yerleştirmedeki basınç gerilmeleri, gerilme gerilmelerinin üzerine bindirilebilir. Tersine, diz bükülmüş durumdayken ayak bileğini pasif olarak dorsiflekse ederek, gerilme gerilmesi azalır ve basınç gerilmesi kalır. Mevcut protokol bu tür üç koşulu araştırıyor. 1) Statik sıkışma için, gerginliği azaltmak için diz bükülürken, girişi sıkıştırmak için ayak tibiaya göre < 110°'ye kadar dorsifleks edilir. 2) Başlangıç gerginlik grubu için, ayak bileği diz uzatılmış olarak 145 ° dorsifleksiyonun üzerine uzatılır ve yerleştirmede ağırlıklı olarak gerilme gerilimi oluşturur. 3) Yüksüz grup için, eksplantlar, dışarıdan uygulanan yükün yokluğunda diz ve ayak bileği nötr pozisyonlarda olacak şekilde bir Petri kabında kültürlenir. Yukarıda belirtilen açılar, ayak ve kaval kemiğinin 180°'lik bir açıyla paralel ve 90°'lik bir açıyla dik olduğu bir koordinat sistemine göre fotoğrafik olarak ölçülür.
Protokolün temel adımları şunları içerir: 1) arka bacak eksplantlarının diseksiyonu ve cildin ve plantaris tendonunun dikkatli bir şekilde çıkarılması; 2) 48 saatlik bir deksametazon ön işlemini takiben eksplant kültürü; 3) doku kesiti ve histolojik boyama; ve 4) fibrokartilaj oluşumunu değerlendirmek için renkli görüntü analizi. Diseksiyonu takiben, her bir arka ekstremite eksplantı, deksametazon74 ile takviye edilmiş kültür ortamında 48 saat boyunca ön işleme tabi tutulur. Her fareden alınan kontralateral uzuvlar, biyolojik değişkenliği kontrol etmeye yardımcı olan ikili karşılaştırma için ayrı deney gruplarına atanır. Ön işlemden sonra, eksplantlar yukarıda tarif edildiği gibi platformlara yerleştirilir ve 7 gün daha kültürlenir (Şekil 1B). 48 saatlik ön işlemden hemen sonra eksplantların çıkarıldığı bir ön işlem görmüş (0. gün) grubuna ek karşılaştırmalar yapılır.
Eksplant kültüründen sonra, arka bacaklar kesilir, formalin sabitlenir, kireçten arındırılır ve parafine gömülür. Sagital oryantasyonda seri kesitleme, Aşil tendonunun miyotendinöz bileşkeden kalkaneal girişe kadar görselleştirilmesini sağlarken, kesit derinliğinin tüm tendon boyunca izlenmesine izin verir. Terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) aracılı dUTP X-nick etiketleme (TUNEL), apoptoza sekonder DNA hasarını görselleştirmek ve canlılığı değerlendirmek için kullanılır. GAG boyamasındaki değişiklikleri ölçmek için toluidin mavisi histolojisi ve özel renkli görüntü analizi yapılır. Toluidin mavisi boyalı doku kesitleri daha sonra kollajen lif organizasyonundaki değişiklikleri karakterize etmek için SHG görüntülemesi için kullanılır (Şekil 1B).
Sağlanan temsili sonuçlar, GAG'den zengin matrisin histolojik olarak boyanmasının değiştiğini ve model içinde 7 günlük statik sıkışma ile oluşturulan hücre dışı kollajen ağının düzensizliğini göstermektedir. Bu model, sıkışmaya bağlı fibrokartilajinöz değişimin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Emici alt pedler</td><td>VWR</td><td>82020-845</td><td>Tezgah üstü diseksiyon için</td></tr><tr><td>Akrilik banyo</td><td>Kaynak Bir</td><td>X001G46CB1</td><td>Kültür ortamına batırılmış eksplant platformunu içerir</td></tr><tr><td>Otoklav kutusu</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-361-20</td><td>İkincil muhafaza olarak kullanılır, iki platform tutar</td></tr><tr><td>Taban</td> <td>-</td><td></td> <td>Ek Dosyalar olarak sağlanan CAD dosyalarından 3D olarak basılmıştır</td></tr><tr><td>Örgülü çizgi</td><td>KastKing</td><td>30lb testi</td><td>Pençenin etrafını sarmak ve ayak bileği dorsifleksiyonunu uygulamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Klips</td> <td>-</td><td></td> <td>Ek Dosyalar olarak sağlanan CAD dosyalarından 3D basılmıştır</td></tr><tr><td>Kapak camı</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541-034</td><td>Dikdörtgen, No. 2, 50 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Cytoseal XYL</td><td>VWR</td><td>8312-4</td><td>Lamel için ksilen bazlı montaj ortamı Toluidin mavisi lekeli doku bölümler</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>MP Biyomedikal LLC</td><td>194561</td><td>CAS # 50-02-2</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO),</td><td>ThermoFisher</td><td>D12345</td><td>CAS # 67-68-5 tarafından susuz Invitrogen, deksametazonu konsantre stok çözeltilerine çözündürmek için kullanın</td></tr><tr><td>Çift taraflı bant</td><td>Scotch Marka</td><td>34-8724-5195-9</td><td>Kavrama plakalarına zımpara kağıdı takmak için</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (1X) DMEM)</td><td>Gibco by ThermoFisher 11965092</td><td></td><td>yüksek glikoz, (-) piruvat, (+) glutamin</td></tr><tr><td>EDTA tetrasodyum tuzu dihidrat</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>J15700. A1</td><td>CAS # 10378-23-1, numune dekalsifikasyonu için% 14 EDTA çözeltisi yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Etanol, 200 kanıt</td><td>Thermo Scientific</td><td>T038181000</td><td>CAS # 64-17-5, 1 L besleme</td></tr><tr><td>Köpük biyopsi pedleri</td><td>Leica</td><td>3801000</td><td>İşleme kasetleri ile birlikte kullanılır, sabitleme ve dekalsifikasyon sırasında ayak bileği eklemlerini istenen pozisyonda tutmaya yardımcı olur</td></tr><tr><td>Forseps, #SS Standart Inox</td><td>Dumont</td><td>11203-23</td><td>Düz, pürüzsüz, ince ipuçları</td></tr><tr><td>Forseps, Micro-Adson 4.75 "</td><td>Fisherbrand</td><td>13-820-073</td><td>Tırtıklı dişli düz, ince uçlar</td></tr><tr><td>Garnet Zımpara Kağıdı, 50-D Grit</td><td>Norton</td><td>M600060 01518</td><td>Veya diğer kaba kumlu zımpara kağıdı</td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38S-500</td><td>CAS # 64-19-7, Toluidin mavisi histolojisi için kullanılan sodyum asetat tamponunun pH'ını ayarlamak için ve% 14 EDTA dekalsifikasyon çözeltisi</td></tr><tr><td>Saplar</td><td>ADMET</td><td>GV-100NT-A4</td><td>Protokolde açıklanan paslanmaz çelik mengene kulpları, vidalar ve yaylar dahildir</td></tr><tr><td>Histobond Yapıştırıcı Mikroskop Slaytları</td><td>VWR</td><td>16005-108</td><td>Arka bacakların sagital bölümleri eksplantlar, tüm boyama protokolleri aracılığıyla bu slaytlara güvenilir bir şekilde yapışır</td></tr><tr><td>Yerinde Hücre Ölümü Tespit Kiti, TMR Kırmızı</td><td>Roche</td><td>12156792910</td><td>TUNEL testi</td></tr><tr><td>Etiketleme bandı</td><td>Fisherbrand</td><td>15-959</td><td>Veya tercih edilen başka bir etiketleme bandı</td></tr><tr><td>L-askorbik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544-100G</td><td>CAS # 50-81-7, kültür ortamı formülasyonu için</td></tr><tr><td>Nötr tamponlu formalin,% 10</td> <td>Leica</td><td>3800600</td><td>Numune fiksasyonu için, 5 galon tedarik</td></tr><tr><td>Nunc petri kapları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7741-1CS</td><td>100 mm çap x 25 mm yükseklik, protokolde tarif edildiği gibi 70 mL kültür ortamına batırılmış eksplantları koruyun</td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin (100X)</td><td>Gibco by ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>500 mL'ye 5 mL ekleyin %1 v/v (1X) çalışma konsantrasyonu için 1X DMEM</td></tr><tr><td>Polilaktik asit (PLA) 1.75 mm filament</td><td>Hatchbox-3D</td><td></td> <td>yazıcı ekstruderinizle uyumlu filament çapını seçin, seçim renginde.</td></tr><tr><td>İşleme kasetleri</td><td>Leica</td><td>3802631</td><td>Fiksasyon, dekalsifikasyon ve parafin gömme için</td></tr><tr>ThermoFisher <td>P36931</td> tarafından DAPI <td>Invitrogen</td><td>ile Altın Antifade Reaktifini Uzatın</td> TUNEL Proteinaz K Fisher BioReagents BP1700-50 CAS#39450-01-6 <td>sonrası kayma dokusu kesitleri için montaj ortamı</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>, TUNEL protokolünde antijen alımı için kullanılır</td></tr><tr><td>Makas, İnce</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td>Düz, keskin</td></tr><tr><td>Kaydırak Boyama Seti, 12'li</td><td>Mercedes Scientific&nbsp;</td><td>MER 1011</td><td>Toluidin mavisi histolojisi için 12 leke tabağı ve sürgülü kepçeli raf</td></tr><tr><td>Sodyum asetat, susuz</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>A1318430</td><td>CAS # 127-09-3, Toluidin mavisi histolojisi için tampon yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Accu-Edge Düşük Profilli Mikrotom Bıçakları</td><td>VWR</td><td>25608-964</td><td>Parafin kesitleme için</td></tr><tr><td>Toluidin Blue O</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>348601000</td><td>CAS # 92-31-9</td></tr><tr><td>Hacim Azaltma Eki</td> <td>-</td><td></td> <td>Ek Dosyalar olarak sağlanan CAD dosyalarından 3D baskı</td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Leica</td><td>3803665</td><td>histolojik boyama için 4 galon tedarik</td></tr></tbody></table>

aşil tendonu sıkışmasının mekanobiyolojisini İncelemek için murin hind limb eksplant modeli

Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement

Tendonun kemiğe çarpması, glikozaminoglikan (GAG) açısından zengin matris birikimi ve kollajen ağının yeniden şekillenmesi ile karakterize lokalize bir fibrokartilaj fenotipi ortaya çıkaran, belirgin şekilde yükselmiş enine kompresyon gerilmesi ile çok eksenli bir mekanik gerilme ortamı oluşturur. Fibrokartilaj, sağlıklı tendonların sıkışmış bölgelerinde normal bir özellik iken, aşırı GAG birikimi ve kollajen ağının düzensizliği tendinopatinin ayırt edici özellikleridir. Buna göre, sıkışma klinik olarak tendinopatinin başlamasında ve ilerlemesinde önemli bir ekstrinsik faktör olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, tendon sıkışmasının altında yatan mekanobiyoloji yeterince çalışılmamıştır. Tendon sıkışmalarına hücresel yanıtı aydınlatmaya yönelik önceki çabalar, hücrelere tek eksenli kompresyon uygulamış ve tendon eksplantlarını in vitro olarak eksize etmiştir. Bununla birlikte, izole hücreler, mekanoyanıt için çok önemli olan üç boyutlu bir hücre dışı ortamdan yoksundur ve hem in vitro hem de eksize edilmiş eksplant çalışmaları, sıkışan bölgenin anatomik özelliklerine bağlı olarak in vivo tendon sıkışması tarafından üretilen çok eksenli gerilme ortamını özetlemekte başarısız olur. Ayrıca, in vivo tendon sıkışma modelleri, mekanik gerilme ortamı üzerinde kontrolden yoksundur. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, Aşil tendonu sıkışmasının mekanobiyolojisini incelemek için uygun yeni bir murin arka uzuv eksplant modeli sunuyoruz. Bu model, lokal anatomiyi korumak için Aşil tendonunu yerinde tutar ve hücreleri doğal ortamlarında tutarken, pasif olarak uygulanan ayak bileği dorsifleksiyonu sırasında Aşil tendonunun kalkaneus üzerine sıkışmasının oluşturduğu çok eksenli gerilme ortamını yeniden üretir. Bu modelin ayrılmaz bir parçası olan bir doku kültürü protokolünü tanımlıyoruz ve 7 gün boyunca sürekli eksplant canlılığını belirleyen verileri sunuyoruz. Temsili sonuçlar, artmış histolojik GAG boyaması ve sıkışmaya sekonder azalmış kollajen lif dizilimi olduğunu gösterir, bu da artmış fibrokartilaj oluşumunu düşündürür. Bu model, farklı mekanik yükleme rejimlerini araştırmak için kolayca uyarlanabilir ve sıkışmaya yanıt olarak Aşil tendonundaki fenotipik değişime aracılık eden mekanizmaları tanımlamak için ilgilenilen moleküler yolların manipülasyonuna izin verir.

TUNEL boyalı doku kesitlerinin temsili görüntüleri, deney gruplarında 7 günlük eksplant kültüründen sonra Aşil tendonunun gövdesinde minimal apoptotik çekirdekleri göstermektedir (Şekil 2A). Bu görüntülerin nicelleştirilmesi, doku kültürü protokolünün, yükleme koşulları boyunca 7 günlük eksplant kültüründen sonra Aşil tendonu içinde ortalama x'e kadar canlılığı koruduğuna dair kanıt sağlar (Şekil 2B).
Kalitatif olarak, gelişmiş Toluid...

Tendon sıkışmasının mekanobiyolojisini keşfetmek için uygun bir model sağlayarak, sürekli hücre canlılığı ile murin arka ekstremite eksplantlarında Aşil tendonu insokulasyonunun sıkışmasının neden olduğu fibrokartilajinöz değişikliği yeniden yaratan özel bir deneysel platform ve doku kültürü protokolü sunuyoruz.

Aşil Tendonu Sıkışmasının Mekanobiyolojisini İncelemek için Murin Hind Limb Eksplant Modeli

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a ...

Tendon sıkışmasının altında yatan mekanobiyolojiyi ve bu benzersiz mekanik talebin sağlık ve hastalıkta lokalize lif kıkırdak oluşumunu yönlendirdiği süreci inceliyoruz. Burada, çarpma tarafından üretilen çok eksenli mekanik gerinimin uzamsal olarak heterojen modellerine göre modelleme için matrisi karakterize etmeye ve bu tepkiye aracılık eden moleküler mekanizmaları tanımlamaya çalışıyoruz. Sıkışma mekanobiyolojisini incelemek için in vitro modeller, izole tendon hücrelerine basit kompresyon veya kısmi ve tam tendon eksplantlarına yapay tek eksenli kompresyon uygulamıştır.Tendon sıkışmasının yerleşik hayvan modelleri, tendon sıkışmasının dış kaynağını in vivo olarak en sık cerrahi olarak manipüle eder ve fiziksel aktiviteye devam ettikten sonra biyolojiyi araştırır. İn vitro modeller, izole hücrelerin mekano-yanıt için çok önemli olan üç boyutlu hücre dışı ortamlarından yoksun olmaları nedeniyle önemli sınırlamalar sunar. Eksize edilen eksplant modelleri bu sınırlamayı aşarken, her ikisi de in vivo çarpma ile üretilen çok eksenli gerinim modellerini yeniden oluşturamaz.Tersine, hayvan modelleri, iç doku suşlarını ölçmek veya kontrol etmek için sınırlı yetenek sunar. Sıkışma mekan

murine-hind-limb-explant-model-for-studying-mechanobiology-achilles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Protokol, özel uyumlu 3D baskılı armatürleri kullanarak rürinten tülonlar için etkili ve tekrarlanabilir gerilebilir biyomekanik test yöntemlerini tanımlar.

Murine Tendonunun Biyomekanik Testi

Bu protokol, aşırı kullanıma bağlı tendinopatinin in vivo bir modeli için bir sıçan Aşil tendonunda ölçülebilir ve kontrollü yorgunluk yaralanmalarını indüklemek için kullanılan bir test sistemi sunar. Prosedür, sıçanın ayak bileğini, özel olarak yazılmış bir MATLAB komut dosyası ile pasif ayak bileği dorsifleksiyonu gerçekleştiren bir eklem aktüatörüne sabitlemekten oluşur.

Aşırı Kullanıma Bağlı Tendinopatinin In Vivo Modeli için Pasif Ayak Bileği Dorsifleksiyon Test Sistemi

Burada, yük taşıyan tendon çekirdek dokusu ile hastalık ve yaralanma ile aktive olan hücre popülasyonlarını içeren bir dışsal bölme arasındaki tendon hücresel karışmasını taklit etmek için bir asambloid model sistemi sunuyoruz. Önemli bir kullanım durumu olarak, sistemin dışsal endotel hücrelerinin hastalıkla ilgili aktivasyonunu araştırmak için nasıl konuşlandırılabileceğini gösteriyoruz.

Hastalık ve Onarımda Hücresel Karışmayı Araştırmak için Mühendislik Tendon Toplulukları

Bu makalede ve beraberindeki video bir organoid üniteleri-on-iskele yaklaşımı kullanarak, fare doku mühendisliği bağırsak üretmek için bizim protokol sunuyoruz.

Bir fare modelinde Bağırsak Doku Mühendisliği

Bu makalede kompleks anizotropik çift eksenli mekanik deformasyona karşı tek bir hücre yanıtları araştırmak ve biyolojik dokuların mekanik özelliklerini ölçmek için kullanılabilen yeni bir germe platformu sunmak.

Hücre ve Doku mechanobiology Applications A Novel Germe Platformu

Mekanik özellikler ve hücre dışı matris mikro güçlü hücre 3D göç etkiler. In vitro bir yöntem, nüfus ve tek tek hücre düzeylerde biyofiziksel değişken ortamlarda uzaysal hücre göçü davranışı incelemek için, tarif edilmektedir.

Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için

Doku mühendisliği için iskeleler, hücresel nişin karmaşık biyokimyasal ve biyofiziksel mikro çevresini özetlemelidir. Burada, sürekli biyokimyasal salınımlı kompozit, çok bileşenli polimerik iskeleler oluşturmak için bir platform olarak arayüzey polielektrolit kompleksleştirme liflerinin kullanımını gösteriyoruz.

Biyomoleküllerin Geçici olarak Kontrollü Release için Yüzey Polielektrolit Elyaf Kompozit Yapı iskeleleri

Plastik mikrosıvısal cihazları imalatı için bir protokol ile şeffaf görünümü-liman görünür ve kızılötesi ışık görüntüleme için tanımlanır.

Görünüm-bağlantı noktaları görünür ve kızılötesi ışık şeffaf plastik mikrosıvısal cihazlar üretmek için yumuşak tekniğinde yordamı

Bu kağıt vivo içinde mikro Bilgisayarlı Tomografi (µCT) tarayıcılar kullanıcılarının nasıl anestezi, doğru getirin ve bir fare için çok az hareket hind bacak tibia yüksek çözünürlüklü görüntüleme sırasında dizginlemek bildirir. Doğru bir şekilde kemik mikro-mimari ölçmek için işlenmiş yüksek kaliteli görüntüler sonucudur.

Uygun konumlandırma ve sıçan Hind riske odaklı yüksek kararlılık düşsel ve kemik mikro mimarisi kullanarak Vivo içinde mikro Bilgisayarlı Tomografi için kısıtlama

İniş sırasında alt vücut kemikleri büyük mekanik yükler deneyim ve deforme. Etkileri ile ilişkili kemik stres yaralanma mekanizmaları daha iyi anlamak için kemik deformasyonu ölçmek için önemlidir. Konuya özgü kas-iskelet modelleme ve Sonlu elemanlar analizi entegre yeni bir yaklaşımın tibial zorlanma sırasında dinamik hareketleri ölçmek için kullanılır.

Konuya özgü kas-iskelet modeli kemik zorlanma sırasında dinamik hareket eğitimi

Keşfedin, murin arka ekstremite eksplant modeli kullanarak aşil tendonu sıkışmasının mekanobiyolojisini. Bu yöntem, çok eksenli mekanik gerinim desenlerini karakterize ederek fibrokıkırdak değişimlerini incelemenizi sağlar.

Aşil Tendonu Sıkışmasının Mekanobiyolojisini İncelemek için Murin Hind Limb Eksplant Modeli

Daha fazla video keşfet