Name: Ex Vivo Çalışmalar için Gine Domuzu Yuvarlak Pencere Membran Eksplantasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Öğrenin, gine domuzu temporal kemiklerinden yuvarlak pencere membranının eksplantasyonu için cerrahi teknikleri. Bu yöntem, iç kulak ilaç teslimi araştırmalarında yapısal bütünlüğü koruyarak hedeflenen taşıma mekanizmalarının incelenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen NIDCD Hibeleri No. 1K08DC020780 ve 5T32DC000027-33 ve Rubenstein İşitme Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan prosedürleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (GP18M226) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada Hartley albino kobayları (hem erkek hem de dişi, 500-700 g ağırlığında) kullanıldı.
1. Prosedür kurulumu ve hazırlığı
<ol><li>Deneye başlamadan önce tüm aletleri etilen oksit ile sterilize edin.</li>
	<li>Kurumsal olarak onaylanmış protokolü izleyerek hayvanlara ötenazi yapın. NOT: Bu çalışmada, ticari bir silindirden% 100 karbondioksit (CO2) salmak için önceden şarj edilmemiş bir oda kullanılmıştır. Gaz akışını düzenlemek için bir hat içi kısıtlayıcı kullanıldı ve 2020 AVMA Yönergeleri11'e uygun olarak odanın hacminin dakikadaki hacminin %30 ila %70'i aralığında tutuldu.</li>
	<li>Hayvanı hazneye yerleştirin ve 5 dakika boyunca karbondioksit dağıtın. CO2 akışı solunum durmasını takiben 1 dakika boyunca korunur.</li>
	<li>Ötenaziyi sağlamak için solunum durmasını takiben dekapitasyon yapın.</li>
</ol>2. Cerrahi yaklaşım ve eksplantasyon
<ol><li>Temporal kemiği kobay kafatasından her zamanki gibi çıkarın12. Fazla yumuşak dokuyu bir rongeur ile çıkarın. Dış akustik meatusu, temporal bülleri ve fasiyal kanalı13 tanımlayın (Şekil 1).</li>
	<li>Temporal bülün ventral yönlerini 6 mm'lik bir elmas uçla delin (Malzeme Tablosuna bakınız), orta kulak boşluğunu ve dış kulak kanalını çevresel olarak açığa çıkarın.</li>
	<li>Rongeurs kullanarak, dış kulak kanalını ve timpanik halkayı nazikçe çıkarın ve aynı anda incudomalleolar eklemi ayırın. İncus, incudostapedial eklem, koklea, yatay yarım daire kanalı ve fasiyal kanalı13 tanımlayın (Şekil 2A).</li>
	<li>İnküdostapedial eklemi ayırın ve forseps kullanarak inkusu çıkarın. Yuvarlak pencerenin kemikli nişini tanımlayın.</li>
	<li>Kokleayı timpanik boşluğun medial duvarına tensör timpani kanalına bağlayan kemikli laminayı delmek için 6 mm'lik bir elmas uç kullanın. Tensör timpaninin kemikli kanalını dikkatlice açın ve 28 G'lik bir iğne kullanarak tensör timpani kasını çıkarın. NOT: Tensör timpani fossanın medial duvarı, RWM çevresindeki koklear kemiğe doğrudan bağlanır ve yuvarlak pencereye kadar uzanabilecek kırıklara neden olmamasına özen gösterilir.</li>
	<li>Kokleayı timpanik boşluğun alt duvarına bağlayan kemikli laminayı, kokleaya bitişik 1 mm kemik çıkıntısı kalana kadar delin (Şekil 2B).</li>
	<li>2 mm'lik bir elmas uç kullanarak (Malzeme Tablosuna bakınız), kokleanın bazal dönüşünde bir kokleostomi yapın ve yuvarlak pencereye yaklaşık 2 mm kemik bırakın. Tabanı kokleanın tepesinden ayırmak için kokleostomiye yuvarlak pencere zarına paralel bir düzlemde aşağı doğru devam edin.</li>
	<li>Kokleostomi kesimini çok daha yoğun olan kafatası tabanından uzatarak kokleanın bazal dönüşünün kesitsel bir görünümünü elde edin. NOT: Matkabı iç kulak yolunun etine doğru hedeflemek, yuvarlak pencereye çok yakın geçmekten kaçınırken kemiğin çıkarılmasını en üst düzeye çıkaran bir yörünge ile sonuçlanır.</li>
	<li>Numuneyi kafa tabanı tarafından inceleyin ve henüz yapılmadıysa, iç kulak kanalını tanımlayın ve koklear açıklığı delin. Koklear siniri 28 G iğne ile çıkarın.</li>
	<li>Numuneyi intrakoklear taraftan inceleyin. Bazal dönüşte kemik spiral laminayı ve kalan modiolusu forseps veya 28 G iğne ile tanımlayın ve çıkarın.</li>
	<li>Kalıntıları temizlemek için birleşik skala timpani-skala vestibuli boşluğunu bolca sulayın. Yuvarlak pencere, üzerinde herhangi bir kalıntı olmadan kokektomiden açıkça görülebilmelidir (Şekil 2C).</li>
	<li>Ardından, numuneyi orta kulak tarafından inceleyin. Yanal yarım daire biçimli kanalı ve yüz kanalını oval pencere seviyesine kadar delin. Forseps kullanarak stapesleri nazikçe çıkarın ve oval pencere nişini ortaya çıkarın. Dikkat çekici bir şekilde, crista stapedis olarak bilinen stapesin crura'sı arasında kemikli bir köprü vardır.</li>
	<li>1 mm'lik bir elmas matkap kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın), oval pencereyi yuvarlak pencerenin yüzü boyunca uzatarak, yuvarlak pencere nişine bitişik 1-2 mm koklear kemik tutmaya dikkat ederek girişi daha da açın (Şekil 2D).</li>
	<li>Oval pencere kesiklerini yuvarlak pencerenin her iki yanındaki kokektomi kesikleriyle birleştirerek temporal kemik kesilerini tamamlayın. NOT: Koklear kemiğin kırılganlığı nedeniyle, numunedeki tensör timpani fossanın korunması ve kesiklerden kaçınılması, RWM'ye uzanan ve bütünlüğünü tehlikeye atan koklear kemik kırıklarının önlenmesine yardımcı olacaktır.</li>
	<li>İç işitsel kanala bitişik kafatası tabanının yoğun kemiğine son bağlantıları yapın ve eksize edilmiş bir RWM örneği elde etmek için hafifçe tıraş edin (Şekil 3A).</li>
</ol>

Gine Domuzu Yuvarlak Pencere Membran Eksplantasyonu

<ol><li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery%3A+our+own+findings+and+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Otol%22%5BJournal%5D)">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li>
<li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li>
<li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear%3A+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li>
<li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+ear+delivery%3A+Challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope+Investig+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li>
<li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li>
<li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li>
<li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li>
<li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105(2022).</li>
<li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li>
<li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+nanoparticles%3A+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol+Neurootol%22%5BJournal%5D)">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li>
<li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%3A+2020+Edition%5BTitle%5D)+AND+%22AVMA%22%5BJournal%5D)">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li>
<li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li>
<li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li>
<li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037(2022).</li>
<li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li>
<li>Lundman, L., Bagger-Sjöbäck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol+Suppl%22%5BJournal%5D)">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li>
<li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789(2023).</li>
<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032(2021).</li>
<li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061(2021).</li>
</ol>

Yazarların yapacak herhangi bir açıklaması yoktur.

Kulağa lokal ilaç dağıtımında, RWM, terapötiklerin iç kulağa ulaşması için birincil geçiş yoludur. Yeni dağıtım araçlarında taşıma mekanizmalarını ve geçirgenliği daha iyi anlamak ve ilaç geliştirme için doğru ve güvenilir bir tezgah üstü modele ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, kobay RWM eksplantasyonunun, ilaç-membran etkileşimlerinin sistematik olarak araştırılmasına izin vermek için uygulanabilir ve güvenilir bir prosedür olduğunu gösterdik. Lundman ve ark. ve Kelso ve ark. daha önce benzer bir RWM geçirgenlik modeli 2,16; bununla birlikte, cerrahi ekstraksiyonun spesifik adımları şimdiye kadar detaylandırılmamıştır ve koklear kemiğin kırılganlığı ve karmaşık anatomi, sağlam RWM'lerin tutarlı, blok halinde toplanması için bir zorluk oluşturmuştur.
Kobay RWM, kokleanın skala timpanisinin sonunda bulunur ve ince bir koklear kemik tabakası ile çevrilidir. Eksplantasyon işlemi sırasında bu kemik yapının kırılması, çevredeki koklear kemik sağlam kalmazsa RWM yırtılma eğiliminde olduğundan, kullanılamaz bir örnekle sonuçlanabilir. Grubumuz, kırıkların en sık yüksek yoğunluklu kafatası tabanı kemiği ile kırılgan koklea arasındaki kavşağın yakınında delme sırasında meydana geldiğini, çünkü kemik yoğunluğundaki geçişin yuvarlak pencereden kırığın yayılma olasılığını artırdığını belirtti. Bu nedenle, RW'ye yakın kokleaya bağlı olan tensör timpani fossanın daha yoğun kemiğinin korunmasının, özellikle yaşlı hayvanlarda örnek hasadı verimini artıracağı öne sürülmektedir. Koklear içeriğin çıkarılması sırasında kemikte bozulma meydana gelebilir; Çevredeki koklear kemiğin minimum manipülasyonu ile kemik spiral laminanın nazikçe çıkarılmasına özen gösterilmelidir.
Bu modelde dikkate alınması gereken önemli bir ayrıntı, eksplantasyondan sonra RWM'nin uygulanabilirliğidir. Önceki gruplar, memeli RWM'nin ekstraksiyondan sonra 24-48 saat boyunca canlı kaldığını öne sürmüşlerdir17. Bu çalışma bu bulguları yansıtmaktadır; Sağlam hücre yapılarını gösteren tutarlı taşıma çalışmaları ve histolojik analizler (Şekil 2A), deneyler sırasında kobay RWM'nin yaşayabilirliğini desteklemiştir. Ekstrakte edilen numunenin genel sağlığını korumak için, RWM ekstrakte edilir ve ötenaziden sonraki 3 saat içinde gömülür.
RWM boyunca ilaç farmakokinetiğinin in vivo çalışmasında, perilenfatik dağılım ve konsantrasyonölçümlerinin yapılmasında önemli teknik zorluklar vardır 1. Timpanik uygulama yöntemlerindeki ve uygulanan miktardaki değişiklikler farklı terapötik sonuçlara neden olmuştur. Bu zorluklar, labirent içindeki karmaşık akışkan dinamiklerinin yanı sıra enjekte edilen malzemenin östaki borusundan düzensiz çıkışı ile birleşir. Tarif edilen eksplantasyon yöntemi, RWM'nin izole çalışmasına ve bir ex vivo model olarak geçirgenliğini etkileyen faktörlere izin verir. Ayrıca, eksplant, ultrason mikro kabarcıkları18 ve kimyasal olarak indüklenen bağlantı modülasyonu19 gibi RWM geçirgenliğini artırmak için şu anda kullanılan çeşitli yöntemlerin doğrudan sorgulanmasına ve görselleştirilmesine de izin verir. İlaç dağıtımında rol oynayan spesifik endositoz mekanizmaları üzerine gelecekteki çalışmalar da bu tezgah üstü modelden faydalanacaktır.

Sensörinöral işitme kaybının tedavisi için yeni terapötik sınıflar ortaya çıkmıştır. Bu terapötiklerin klinik popülasyonlara çevrilmesi, iç kulağa güvenli ve etkili taşıma yolları ile sınırlıdır. Hayvan çalışmalarında mevcut in vivo uygulama yöntemleri, ya iç kulağa fenestrasyona ya da orta kulak boşluğunu kokleadan ayıran kemik olmayan bir bariyer olan yuvarlak pencere zarından (RWM) difüzyona dayanır1.
Cerrahi pencere ve iç kulağa mikroenjeksiyon hem invazivdir hem de rezidüel iç kulak fonksiyonu için risk oluşturabilir2. Bu nedenle, RWM, yerel ilaç dağıtımı için önemli bir yoldur ve kobaylar, farmasötik geliştirme için RWM boyunca ve iç kulakta yerel ilaç farmakokinetiğini incelemek için kullanılan birincil klinik öncesi hayvan modelidir 3,4. İnsan RWM'sinden daha ince olmasına rağmen, kobay RWM aynı üç katmanlı yapıyı paylaşır. Yaklaşık 1 mm çapında, 15-25 μm kalınlığındadır ve bir bağ dokusu tabakasını5 sandviçleyen iki epitel hücre tabakasından oluşur. Orta kulağa bakan epitel tabakası yoğun bir şekilde paketlenir ve sıkı bağlantılarla bağlanırken, iç kulağa bakan tabaka ve skala timpani daha gevşek bir mimariye sahiptir ve önemli hücreler arası yapışıklıklara sahip değildir.
Kobay RWM'de ilaç geçirgenliğini araştıran mevcut klinik öncesi çalışmalar, in vivo orta kulak enjeksiyonlarına ve ardından iç kulaktaki perilenf sıvısının örneklenmesine dayanmaktadır, bu da RWM transportunun spesifik çalışmasına izin vermemektedir 6,7. RWM eksplantlarının fragmanları klinik öncesi çalışmalarda kullanılmıştır, ancak kırılganlıkları ve küçük boyutları nedeniyle, RWM2 boyunca su geçirmez bir sızdırmazlık gerektiren ilaç ve araç taşımacılığının sistematik, mikroakışkan araştırmaları için uygun değildirler. Diğer gruplar, RWM 8,9,10'a yaklaşmak için kültürlenmiş insan epitel hücreleri ile in vitro modeller kullanmışlardır. Bununla birlikte, bu yapıların çoğu yalnızca dış epitel tabakasına odaklanır ve doğal doku mimarisinin karmaşıklığını yakalamaz. RWM boyunca taşıma mekanizmalarının daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılması için, hedefli, ex vivo çalışmalar gereklidir.
Bu çalışmada, membran bütünlüğünü korumak için bir kobay RWM'nin çevreleyen kemik desteği ile eksplantasyonunu gösteriyoruz ve ilaç dağıtım araçlarının RWM taşınmasının spesifik çalışması için tasarlanmış deneysel bir paradigmada kullanımlarını gösteriyoruz.

<table><tbody><tr><td>1 mm Elmas Bilyalı Matkap Ucu</td><td>Anspach</td><td>1SD-G1</td><td></td></tr><tr><td>2 mm Elmas Bilyalı Matkap Ucu</td><td>Anspach</td><td>2SD-G1</td><td></td></tr><tr><td>6 mm Elmas Bilyalı Matkap Ucu</td><td>Anspach</td><td>6D-G1</td><td></td></tr><tr><td>ANSPACH EMAX 2 Plus Sistemi</td><td>Anspach</td><td>EMAX2PLUS</td><td>Herhangi bir kemik kesme delme sistemi çalışacaktır</td></tr><tr><td>BD Eclipse İğnesi 27 G x 1/2 inç, çıkarılabilir 1 mL BD Luer-Lok Şırınga</td> <td>ileBecton, Dickinson ve Co.&nbsp;</td><td>382903057894</td><td>Herhangi bir 27-28 G iğne</td></tr><tr><td>Goril Epoksi</td><td>Goril</td><td>4200101</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-CAST</td><td>World Hassas Aletler</td><td>KWIK-CAST</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo Çalışmalar için gine domuzu yuvarlak pencere membran eksplantasyonu

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

İç kulağa etkili ve minimal invaziv ilaç iletimi önemli bir zorluktur. İç kulağa birkaç giriş noktasından biri olan yuvarlak pencere membranı (RWM), araştırmaların hayati bir odağı haline gelmiştir. Bununla birlikte, RWM'yi izole etmenin karmaşıklığı nedeniyle, farmakokinetiği hakkındaki anlayışımız sınırlı kalmaktadır. RWM üç farklı katmandan oluşur: dış epitel, orta bağ dokusu katmanı ve iç epitel katmanı, her biri potansiyel olarak benzersiz dağıtım özelliklerine sahiptir.
RWM boyunca taşınmayı araştırmak için mevcut modeller, hücre kültürlerine veya membran parçalarına dayanan in vivo hayvan modellerini veya ex vivo RWM modellerini kullanır. Gine domuzları, iç kulaktaki ilaç farmakokinetiğinin araştırılması için doğrulanmış bir klinik öncesi model olarak hizmet eder ve kokleaya dağıtım araçlarının translasyonel gelişimi için önemli bir hayvan modelidir. Bu çalışmada, bir kobay RWM'nin tezgah üstü ilaç salım deneyleri için çevresindeki koklear kemik ile eksplantasyonuna yönelik bir yaklaşım tanımlanmıştır. Bu yöntem, yerel RWM mimarisinin korunmasına izin verir ve mevcut tezgah üstü modellere göre taşıma engellerinin daha gerçekçi bir temsilini sağlayabilir.

Şekil 3A'da gösterildiği gibi, bu yöntem, bozulmamış kobay yuvarlak pencere zarının, çevreleyen bir sert kemik halkası ile eksplantasyonuna izin verir. RWM, kemiksi halkaya çevresel olarak tam olarak bağlanmalıdır. Koklear kemik kırığı görülmemelidir. İnsan yuvarlak pencere örnekleriyle karşılaştırıldığında, kobay RWM'nin üzerinde bir psödomembran yoktur. Ek olarak, insanlardan farklı olarak, kobay stapeslerinin crura'sı arasında, stapes üst yapısının çıkarılmasından önce kırılması ve çıkarılması gereken kemikli bir köprü vardır. Temsili RWM'nin histolojik analizi (Şekil 3B), bitişik, sağlam yuvarlak bir pencere nişine sahip açık üç katmanlı bir epitel yapısı göstermektedir.
Teknik açıdan bakıldığında, iki kritik adım vardır. İlk olarak, adım 2.7'de kokektomi yapılırken, çapak ucundaki titremeler koklear kemikte yuvarlak pencere zarına kadar uzanabilecek travmatik kırıklara yol açabileceğinden, kesimi yapmak için uç yerine matkap ucunun ekvatorunu kullanmak önemlidir. İkinci olarak, koklear sinirin tamamen çıkarılmasına ve kemik spiral laminanın daha kolay diseksiyonuna izin verdiğinden, deneysel örnekleme için intrakoklear tarafta birleşik bir boşluk ile sonuçlandığından, iç kulak kanalının tamamen delinmesi önemlidir (Şekil 2C).
RWM başarılı bir şekilde ekstrakte edildikten sonra, grubumuz membranın farmakokinetik özelliklerini değerlendirmek için modifiye edilmiş bir Ussing odası kullandı. Modifiye edilmiş Ussing odası, epitel membranlarının taşıma özelliklerini değerlendirmek için timpanik ve yuvarlak pencere membranlarının yanı sıra retina dokusundaki diğer gruplar tarafından doğrulanmıştır14,15. Bu 3D baskılı cihaz, Poly-Jet Vero kullanılarak yapılmıştır ve her biri 400 μL sıvı haznesine sahip iki üçgen taban parçasından oluşur (Şekil 3). RWM'nin kemikli kenarı, su geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için 2 parçalı epoksi (Gorilla, bkz. Malzeme Tablosu) ve ardından silikon dolgu macunu (bkz. Malzeme Tablosu) kullanılarak tabana yapıştırılır (Şekil 4). Herhangi bir epoksi veya dolgu macununun membrana temas etmemesi için titiz özen gösterilir. RWM yerine oturtulduğunda, iki baz daha sonra epoksi ile birbirine yapıştırılır. Taşıma deneyleri sırasında, yükleme (orta kulağa bakan), dağıtım aracını (veya ilgilenilen herhangi bir molekülü) içeren fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurulur ve örnekleme odası (skala timpani kaplama) yalnızca PBS ile doldurulur. Düzenli zaman aralıklarında, numune alma odasından gelen sıvı tamamen aspire edilir ve taze PBS ile değiştirilir.
Her deney sırasında, aparat içindeki numunenin etrafında hem su geçirmez bir conta hem de mikro delikler olmadan tamamen sağlam bir membran olmasını sağlamak için kalite kontrol önlemleri alınır. Kahverengi, demir çekirdekli nanopartikül çözeltisi ile temsili sonuçlar aşağıda gösterilmiştir. Su geçirmez bir contanın kantitatif doğrulaması, her numune alma aralığı sırasında numune alma odasının tam hacminin aspire edilmesiyle gerçekleştirilir; Numune alma odasından sızan sıvı, tam aspirasyon hacminden daha azına neden olur. Her deneyin sonunda, yükleme odasındaki sıvı hacmi de aynı kalmalıdır. Ek olarak, hedef sıvımız kahverengi renkte olduğundan, bir sızıntı durumunda da kolayca görülebilir.
Membran içinde sızıntı olmamasını sağlamak için çeşitli yaklaşımlar benimsenmiştir. İlk olarak, bu çalışmada kullanılan RWM örneklerinin tümü hemen çıkarılır ve ışık, konfokal ve elektron mikroskobu görüntüleri, mikro delikler olmadan bozulmamış hücresel ve membran yapılarını doğrular (Şekil 3A, B). İkincisi, nanopartikül iletimi üzerindeki etkiyi karşılaştırmak için RWM örneklerinin bir alt kümesinde kasıtlı olarak mikro delikler oluşturuldu. Numune alma ve yükleme haznesi aspiratının görsel olarak incelenmesi, numune bütünlüğünün ve su geçirmez bağlantının daha fazla doğrulanması anlamına gelir. Perforasyonlu RWM'de, belirgin bir renk değişimi ile gözlemlenebilen yükleme ve numune alma odasının hızlı bir şekilde dengelenmesi vardır (Ek Şekil 1). Ek olarak, mikroperfore RWM'lerde taşımanın, sağlam membranlarda gözlenen maksimum varyanstan daha yüksek olduğu bulunmuştur (Ek Şekil 2). Bunlar birlikte, numuneyi çevreleyen su geçirmez contanın ve RWM'nin bütünlüğü için kalite kontrol mekanizmaları olarak hizmet eder.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig01.jpg"> Resim 1: Guinea pig temporal kemiğinin ameliyat öncesi görüntüsü. Timpanik bül, dış kulak yolu ve fasiyal kanal (*) kobay temporal kemiğinin bu preoperatif görüntüsünde gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig02.jpg"> Şekil 2: İntraoperatif görüntüler. Yuvarlak pencere zarı ile inkus (*), koklea (**), stapes (†) ve dekompresyon iç kulak yolu (‡) arasındaki ilişkiyi gösteren intraoperatif görüntüler. Gölgeli alanlar, numunenin çıkarılacak kısımlarını gösterir. (A) Timpanik membran ve fasiyal sinirin çıkarılmasından sonra kobay orta kulak boşluğu (adım 2.3). (B) Tensör timpanik kanalının dekompresyonundan sonra orta kulak boşluğu (adım 2.6). (C) Kokleostomi sonrası RWM'nin bazal görünümü ve iç kulak içeriğinin çıkarılması (adım 2.11). (D) Stapesin çıkarılmasından ve vestibülün tanımlanmasından sonra RWM'nin görünümü (adım 2.13). Ölçek çubuğu = A,B (1 cm); C,D (5 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig03.jpg"> Şekil 3: Son RWM örneği ve histolojisi. (A) Kemikli halkalı kobay RWM brüt örneği. Ölçek çubuğu = 1 cm. (B) Ekilen kobay yuvarlak pencere zarının histolojisi, bozulmamış üç katmanlı bir yapı gösterir. Ölçek çubuğu = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig04.jpg"> Şekil 4: Transmembran taşıma deneyleri için mikroakışkan cihaz. (A) Transmembran taşıma deneyleri için kullanılan mikroakışkan cihazın diyagramı. (B,C) Deneyler için basılı mikroakışkan cihaz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: 5 saatlik bir demir çekirdekli nanoparçacık dağıtım deneyi üzerinde yükleme ve numune alma odası içeriği. (A) Bozulmamış RWM'nin yükleme odası, nanopartiküllerin konsantrasyonu azaldıkça renk yoğunluğunda kademeli bir azalma gösterir. (B) Bozulmamış RWM'nin örnekleme odası, düşük nanopartikül dağıtım seviyeleri ile tutarlı olarak zaman içinde stabil renklenme gösterir. (C) Delikli RWM'nin yükleme odası, içerikler örnekleme odası ile dengelendikçe renk yoğunluğunda hızlı bir azalma gösterir. (D) Delikli RWM'nin örnekleme odası, yüksek nanopartikül iletimi seviyeleri ile tutarlı olarak, zaman içinde renkte kademeli bir artış gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/Supplemental%20Figure%201.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 2: Nanopartiküllerin teslimi için temsili taşıma sonuçları. Nanopartiküllerin (polietilen glikol kaplamalı Fe3O4 çekirdek, ortalama 77 nm yarıçap) kobay RWM boyunca hem bozulmamış hem de delikli (ortalama ± SD, n ≥ 3 RWM deneyleri) verilmesi için temsili taşıma sonuçları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/Supplemental%20Figure%202.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, kobay temporal kemiklerinden yuvarlak pencere zarının eksplantasyonu için bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir ve ex vivo çalışmalar için değerli bir kaynak sağlar.

Ex Vivo Çalışmalar için Gine Domuzu Yuvarlak Pencere Membran Eksplantasyonu

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

Grubumuz, işitme kaybı gibi iç kulak hastalıklarının tedavisi için ilaçları ve ilaç dağıtım araçlarını araştırmaktadır. Yuvarlak pencere membranı, lokal olarak uygulanan ilaçların kokleaya girmesini önleyen kritik bir bariyerdir ve şu anda nanopartikül dağıtım araçlarının bu bariyerden geçecek şekilde nasıl tasarlanabileceğini anlamak için çalışıyoruz. Yuvarlak pencere zarının ilaç taşınması açısından nasıl çalıştığını anlamak, kulağa etkili ilaç verme stratejileri geliştirmede çok önemlidir.Gine domuzu, kulağa ilaç dağıtımını incelemek için önemli bir klinik öncesi hayvan modelidir. Bununla birlikte, sadece 17 mikron kalınlığındaki bu kırılgan zarın ilaç taşıma çalışmaları için izole edilmesi önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir. Burada, verimli tezgah üstü ilaç taşıma çalışmalarına izin veren kobay yuvarlak pencere zarının çıkarılması için bir yöntem açıklıyoruz.İç yıla ilaç dağıtımına ilişkin mevcut araştırmalar, öncelikle in vivo deneysel modellere ve ardından yuvarlak pencere zarı taşıma mekanizmalarının spesifik ve hedefli bir çalışmasına izin vermeyen perilenf örneklemesine dayanmaktadır. Bu çalışmada, kobay yuvarlak pencere zarının çevresindeki kemiksi destekle ekstraksiyonunu gösterdik. Bu yöntem, doğal doku mimarisi bütünlüğünü korur ve yuvarlak pencere zarı boyunca ilaç dağıtımının kesin ve hedefli çalışmalarına izin verir.

guinea-pig-round-window-membrane-explantation-for-ex-vivo-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video cerrahi endolenfatik hidrops üretmek için kobay endolenfatik kanal nasıl engel gösterir.

Endolenfatik Kanal obliterasyonu endolenfatik hidrops Cerrahi İndüksiyon

Bu videoda, in vivo ve ex vivo çalışmalar için birincil kültürlerini elde etmek üzere domuz gözlerinden iris ve retina pigment epitel hücrelerini izole etmek için bir tekniği açıklıyoruz. Bu pigment hücreleri, oküler bozuklukları tedavi etmek için rejeneratif yaklaşımları incelemek için genetik olarak değiştirilebilir.

IPE ve RPE Hücrelerinin İzolasyonu: İzole Domuz Gözünden Pigmente Epitel Hücreleri Elde Etme Tekniği

Bu videoda, alınan domuz akciğerinden bronşiolar dokuları çıkarmak için uygulanan cerrahi bir prosedürü açıklıyoruz. Ex vivo bronşiolar doku, kronik akciğer enfeksiyonlarını incelemek için enfeksiyon modelleri geliştirmek için kullanılabilir.

Domuz bronşiolar doku ekstraksiyonu: Domuz akciğerlerinden bronşiolar doku kesitlerini incelemek için bir prosedür

Burada insan IPS-hücre cardiomyocytes eskiden şiling şimdi domuz modelinde türetilmiş bir kalp kası yama implantasyonu ve ardından sol ventrikül cryoinjury indüksiyon için bir iletişim kuralı mevcut.

HiPSC elde edilen kalp kası yamalar implantasyonu eskiden şiling şimdi domuz modelinde miyokardiyal yaralanma sonra

Bu makalede, kobay endolenfatik kesesini yok etmek ve deneysel endolenfatik hidrops indüklemek için ince bir pick ile endolenfatik kanal zarar ekstradural bir yaklaşım göstermektedir.

Kobayda Endolenfatik Hidrops İndüklemek için Gözden Geçirilmiş Cerrahi Yaklaşım

Burada, birincil iris ve retina pigment epitel hücrelerini çeşitli memelilerden (fareler, sıçan, tavşan, domuz ve sığır) izole etmek ve transfekte etmek için bir protokol sunulmaktadır. Yöntem, insanlara aktarılabilir ex vivo analizleri ve in vivo çalışmalar için çeşitli kurulumlarda oküler gen tedavisi yaklaşımlarını incelemek için idealdir.

Viral Olmayan Gen Tedavisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği

Retina pigmentli epitelin (RPE) subretinal implantasyonu, dejeneratif retina hastalıklarının tedavisinde en umut verici yaklaşımlardan biridir. Bununla birlikte, büyük gözlü hayvan modelleri üzerinde yapılan klinik öncesi çalışmaların performansı zorlu olmaya devam etmektedir. Bu yazıda RPE'nin bir hücre taşıyıcısı üzerinde minidomuzlara subretinal transplantasyonu için kılavuzlar sunulmaktadır.

Minipiglerde RPE'nin taşıyıcı üzerine subretinal implantasyonu: Preoperatif preparatlar, cerrahi teknikler ve postoperatif bakım için kılavuzlar

Glomerüler filtrasyon hızı (GFR), böbrek fonksiyonlarını değerlendirmek için ideal bir belirteçtir. Bununla birlikte, seri kan ve idrar analizi ile inülin enjeksiyonu kullanan standart ölçüm yöntemi pratik değildir. Bu makalede, domuz yavrularında GFR'yi transdermal olarak ölçmek için pratik bir yöntem açıklanmaktadır.

Mekanik Havalandırmalı Domuz Yavrularında Glomerüler Filtrasyon Hızının Transdermal Ölçümü

Retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin hücrelerini genç pigmentli kobayların gözlerinden izole etmek için basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu prosedür, gen ekspresyon analizleri de dahil olmak üzere izole RPE üzerinde moleküler biyoloji çalışmalarının izlenmesine izin verir.

Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Guinea Pig Gözlerinden İzolasyonu

Bu çalışma, bir domuz modelinde tekrarlanan kronik kortikal kayıtlar için ölçeklenebilir, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem sunmaktadır. Yöntemin, ağrı araştırmaları ve nörolojik hastalık teşhisi dahil olmak üzere sinirbilimin çeşitli alanlarında uygulamaları vardır.

Domuzlarda anestezi sırasında tekrarlanan kortikal kayıtlar için kronik kraniyal pencere tekniği

Burada, genişletilmiş ex vivo deneyler için retinayı fare gözünden izole etmek için ayrıntılı bir metodoloji sunuyoruz. Bu protokol, retinal glia'yı canlı dokuda yerinde tutmanın sağladığı araştırma yollarından yararlanmak isteyen araştırmacılar için bu teknik olarak zorlu yaklaşımı erişilebilir kılmayı vurgulamaktadır.

Fare retinasındaki glial etkileşimleri incelemek için bir ex vivo eksplant modeli

Öğrenin, gine domuzu temporal kemiklerinden yuvarlak pencere membranının eksplantasyonu için cerrahi teknikleri. Bu yöntem, iç kulak ilaç teslimi araştırmalarında yapısal bütünlüğü koruyarak hedeflenen taşıma mekanizmalarının incelenmesini sağlar.

Ex Vivo Çalışmalar için Gine Domuzu Yuvarlak Pencere Membran Eksplantasyonu

Daha fazla video keşfet