SARS-CoV-2, Influenza A/B ve MERS-CoV'nin Tespiti için Multipleks Gerçek Zamanlı RT-qPCR Testlerinin Geliştirilmesi
10 Kasım 2023
Yaygın solunum yolu virüsleri için iki prob tabanlı kurum içi tek adımlı RT-qPCR kiti sunuyoruz. İlk test SARS-CoV-2 (N), İnfluenza A (H1N1 ve H3N2) ve İnfluenza B içindir. İkincisi SARS-Cov-2 (N) ve MERS (UpE ve ORF1a) içindir. Bu testler herhangi bir özel laboratuvarda başarıyla uygulanabilir.
Bu testin genel amacı, SARS-CoV-2, MERS, influenza A ve influenza B gibi yaygın olarak dolaşan solunum yolu virüslerinin aynı anda tespiti için çok yönlü bir yaklaşım uygulamaktır. LAMBA. Bununla birlikte, multipleks RT-qPCR en hassas, yaygın olanıdır ve çeşitli virüsleri teşhis etmek için altın standarttır. Mevcut deneysel zorluk, 10 kopya kadar düşük RNA kopyalarını tespit etmek için kullanılabilecek bir protokol oluşturmaktır.
Tahlil için zaman ve maliyet etkin olan kurum içi RT-qPCR kitini kullandık. Başlamak için, DNA/RNA içermeyen suda RT-qPCR için 2x tamponu hazırlayın Tamponu daha fazla kullanılana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, primerleri ve probları 1.5 mililitrelik bir tüpte karıştırın.
Hacmi elüsyon tamponu ile doldurun, ardından tüpü eksi 20 santigrat derecede saklayın. Buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüpte taq polimeraz ve MMLV-RT ile bir enzim karışımı hazırlayın. Taq polimeraz depolama tamponu ile hacmi oluşturun.
Şimdi, mikrolitre başına 10 ila altıncı RNA kopyası stokları yapmak için viral sentetik RNA'ları 100 mikrolitre Tris-EDTA tamponu ile ayrı tüplerde yeniden süspanse edin. Virüs stoklarını karıştırmak için SARS-CoV-2, influenza A ve B'nin her birine beş mikrolitre ila 50 mikrolitre Tris-EDTA tamponu ekleyin. Benzer şekilde, ikinci bir viral karışım elde etmek için SARS-CoV-2 ve MERS-CoV'yi karıştırın.
Mikrolitre başına 10 RNA kopyasının nihai seyreltmesini elde etmek için her iki karışımı da on kat seyreltin. 96 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 2x tampon, astar, enzim, DNA/RNA içermeyen su ve karşılık gelen RNA karışımlarını pipetleyin. Plakayı yapışkan bir plaka contası ile kapatın.
Ardından, kuyu dibindeki sıvıyı toplamak için plakayı bir dakika santrifüjleyin. Daha sonra PCR makinesini, deney tipi standart eğriye ayarlanmış hızlı 96 kuyulu blok tipini kabul edecek şekilde programlayın. Reaktifleri TaqMan reaktifleri olarak ayarlayın ve standart çalıştırma özelliklerini seçin.
Gen hedeflerini ve raportör boyayı tanımlayın. Ardından, test edilecek her reaksiyon için numune adlarını tanımlayın ve plaka düzenine hedefler ve numuneler atayın. Şimdi döngü programını cihaza girin.
Plakayı gerçek zamanlı QPCR makinesine doğru yönde aktarın ve döngüyü başlatmak için çalıştır düğmesine basın. Deneysel verileri kaydetmek için dosya konumunu seçin. Ardından QPCR programı tarafından sağlanan amplifikasyon grafiklerini inceleyin.
Geliştirilen iki kit, reaksiyon başına 10 RNA kopyası kadar düşük bir miktarla, üç hedef genin tümünü aynı anda başarılı bir şekilde çoğaltabildi. Tüm viral titrasyonlar için amplifikasyon verimlilikleri %99'un üzerindeydi
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, SARS-CoV-2, MERS ve çeşitli Influenza suşları dahil olmak üzere yaygın solunum yolu virüslerinin eş zamanlı tespiti için tasarlanmış, prob tabanlı iki adet tek aşamalı RT-qPCR kitinin geliştirilmesini sunmaktadır. Bu kitler, maliyet etkin ve zaman tasarrufu sağlayan bir yaklaşımla uzmanlaşmış laboratuvarların tanı kapasitelerini artırmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Solunum yolu virüsü tespiti
- RT-qPCR tekniği
- Multiplex assay geliştirme
Arka Plan
- Solunum yolu virüslerinin hızlı ve hassas teşhisine duyulan ihtiyaç.
- Mevcut tespit teknolojilerinin kısıtlılıkları.
- Eş zamanlı tespit için multipleks bir yaklaşımın önemi.
Kullanılan Yöntemler
- Kurum içi geliştirilmiş RT-qPCR kitleri
- Viral RNA tespiti
- Spesifik problarla kombine edilmiş Multiplex RT-qPCR
Ana Sonuçlar
- Influenza A ve B'nin yanı sıra SARS-CoV-2 ve MERS başarıyla tespit edildi.
- Reaksiyon başına 10 kopya kadar düşük RNA seviyelerinde amplifikasyon sağlandı.
- Hedef genler için %99'un üzerinde yüksek amplifikasyon verimlilikleri kanıtlandı.
Sonuçlar
- Geliştirilen RT-qPCR kitleri, solunum yolu virüslerinin multipleks tespiti için etkilidir.
- Bu çalışma, viroloji araştırmalarında daha iyi tanı stratejilerine katkı sağlamaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik Özeti
SARS-CoV-2, Influenza A/B ve MERS-CoV için geliştirilen multipleks gerçek zamanlı RT-qPCR analizleri, keşif ve translasyonel araştırmalarda birlikte dolaşan solunum yolu virüslerinin hızlı, hassas ve spesifik bir şekilde tespit edilmesine yönelik kritik ihtiyaca cevap vermektedir. Bu analizler, viral hedeflerin yüksek güvenilirlikle ayırt edilmesini sağlayarak sağlam bir hedef doğrulamasına destek olmakta ve erken aşama tanı geliştirme süreçlerindeki belirsizlikleri azaltmaktadır. Bu analizlerin entegrasyonu, bulaşıcı hastalık tehditlerine odaklanan Ar-Ge portföylerinde öngörüsel güveni ve operasyonel verimliliği artırmaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Solunum yolu hastalığı modellerinde fonksiyonel doğrulama için viral hedeflerin hassas bir şekilde sorgulanmasını sağlar.
- Karmaşık örneklerde yakından ilişkili viral patojenleri ayırt ederek biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Tanı ve tedavi programları için hedef seçimi ve önceliklendirmede öngörülebilir güvenilirliği kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Antiviral bileşiklerin veya tanı araçlarının alt ekranlamaları için valide edilmiş multipleks assay sistemleri hazırlar.
- Assay kıyaslaması (benchmarking) ve optimizasyonu için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir ve kantitatif çıktılar sağlar.
- Aday müdahalelerin hızlı değerlendirmesi için ölçeklenebilir, yüksek kapasiteli tarama (high-throughput screening) hazırlığına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Birden fazla solunum yolu virüsünün eş zamanlı tespitini sağlayarak translasyonel biyobelirteç stratejileriyle uyum sağlar.
- Güçlü ve kantitatif viral tespit sağlayarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği destekler.
- Hastalıkla ilişkili sistemlerde doğru patojen tanımlaması sağlayarak, adayların geliştirilme sürecindeki riskleri azaltır.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Multiplex RT-qPCR analizleri, erken hipotez testlerini, analiz geliştirmeyi ve bulaşıcı hastalık portföyleri için translasyonel araştırmaları destekleyerek, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Hipotez odaklı viral hedef doğrulaması için yüksek hassasiyetli tespit sağlar.
- Tarama: Analiz standardizasyonu ve bileşik değerlendirmesi için tekrarlanabilir, kantitatif çıktılar sunar.
- Analitik: Karşılaştırmalı analizler için güçlü amplifikasyon verileri ve özgüllük metrikleri sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Araştırma aşamaları boyunca biyobelirteç uyumunu ve sürekliliğini mümkün kılar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli Ar-Ge ortamlarında çoklu viral tespit için yeniden kullanılabilir ve uyarlanabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Viral tespitlemede öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Tanısal iş akışlarının standardizasyonunu, tekrarlanabilirliğini ve ölçeklenebilirliğini geliştirir.
- Stratejik Değer: Patojenlerin erken ve doğru şekilde ayırt edilmesini sağlayarak, devam/dur kararlarını ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Bulaşıcı hastalık programlarının riskle uyumlu önceliklendirmesini ve ilerletilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Moleküler viroloji ve kantitatif PCR analiz tasarımı konularında uzmanlık gerektirir.
- Real-time PCR cihazlarına ve analitik yazılım altyapısına erişim gereklidir.
- Analiz kurulumu, veri yorumlama ve kalite kontrol için ekipler arası standartlaştırma gerektirir.
- Farklı örnek türleri veya ortaya çıkan yeni viral varyantlar için adaptasyon gerektirebilir.
- Performans, kaynağın desteklediği primer/prob özgünlüğüne ve RNA kalitesine bağlıdır.
