Name: Dijital Mikroskop Kullanarak Hücre Ölümü Başlangıcının İncelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Öğrenin, dijital mikroskop kullanarak patates bitkilerinde hücre ölümü başlangıç hızını nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, lezyon oluşumunun tam zamanını belirleyerek bitki bağışıklık mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik yardım için Barbara Jaklič'e teşekkür ederiz. Bu araştırma, Slovenya Araştırma ve İnovasyon Ajansı tarafından finansal olarak desteklenmiştir (araştırma temel fonu no. P4-0165 ve proje Z4-3217: Virüslere karşı patates direncinde redoksla ilgili sinyal birbirine bağlılığının deşifre edilmesi).

NOT: Bölüm 1 ve 2, Lukan ve ark.7 tarafından özetlenen yöntemlere dayalı olarak bitki materyali hazırlama için değiştirilmiş bir protokolü açıklamaktadır. Spesifik olarak, kontrollü çevre koşullarında ve aşı hazırlığında bazı değişiklikler yapılmıştır.
1. Büyüyen patates bitkileri
<ol><li>Sağlıklı patates cv yetiştirin. Kök düğüm doku kültüründe rywal bitkileri8.</li>
	<li>6-8 hafta sonra, steril cımbız ve neşter bıçağı kullanarak steril koşullar altında steril kağıt üzerinde patates bitkilerinden düğümler içeren on adet 1 cm uzunluğunda eksplant kesin.</li>
	<li>Bunları Murashige ve Skoog (MS30) ortamı ile plastik kutulara aktarın (Şekil 1A) ve kontrollü çevre koşulları altında büyütün (250 μE veya μmol/m2/s radyasyon ve 16 saatlik fotoperiyot ile ışıkta 22 °C ve karanlıkta 19 °C, %55 ± %5 bağıl nemde).</li>
	<li>Mikro çoğaltmadan 2 hafta sonra toprağa aktarın.<ol><li>Saksıları (r = 10 cm) toprakla doldurun. Bir tencerenin ortasındaki toprakta 3-4 cm derinliğinde bir çukur oluşturmak için parmağınızı kullanın, deliği suyla doldurun ve emmesini bekleyin.</li>
		<li>Yaprakları yüzeyin üzerinde bırakarak deliğe saksı başına bir bitki yerleştirin. Kökleri nazikçe toprakla örtün (Şekil 1B). NOT: Bazı bitkilerde kök gelişmeyebilir. Bu bitkileri analizin dışında tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Bitkileri toprakta kontrollü çevre koşulları altında (ışıkta 22 °C ve karanlıkta 19 °C, %55 ± %5 bağıl nemde, 250 μmol/m2/s radyasyon ve 16 saatlik fotoperiyot ile) bir büyüme odasında büyütün.</li>
	<li>3-4 hafta sonra bitkiler hazırdır. Aşılanmak için bu bitkileri kullanın. NOT: Bitkiler, görünür yaprakçıklara sahip en az 3-4 tam gelişmiş yaprağa sahip olmalıdır (Şekil 1C). PVY'nin neden olduğu lezyonlarla karıştırılabilecek görünür semptomlar (sarı veya kahverengi yapraklar) olmadan sağlıklı görünmelidirler. Karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için, sirkadiyen ritmin bitki bağışıklık tepkisi ve lezyon oluşumuüzerindeki olası etkilerinden kaçınmak için tüm deneylerde bitkiler aynı anda (örneğin sabah 9'da) aşılanmalıdır 9,10,11.</li>
</ol>2. Aşı hazırlama ve patates aşılama
<ol><li>Bitkiyi PVY suşu N-Wilga (PVYN-Wi; erişim no. EF558545) aşağıda belirtildiği gibi aşılama. NOT: Birden fazla dijital mikroskop mevcutsa, daha fazla bitki paralel olarak aşılanabilir. Bitkiler aşılamadan önce en az üç tam gelişmiş yaprağa sahip olmalıdır (Şekil 1C). PVYN-Wi , patates cv'de çoğaltılır ve korunur.<ol><li>Aşılama için sodyum dietilditiokarbamat (DIECA) ile desteklenmiş fosfat tamponu hazırlayın: 1.3 mL 0.2 M NaH2PO4, 8.7 mL 0.2 MNa2HPO4ve 0.225 g DIECA'yı karıştırın. ddH20 kullanarak hacmi 100 mL'ye yükseltin. 1 M NaOH veya 1 M HCl çözeltisi ekleyerek pH'ı 7,6'ya ayarlayın.</li>
		<li>6-8 haftalık PVYN-Wi enfekte patates cv'yi hasat edin. Pentland bitkileri, filtre ağlı ekstraksiyon torbalarında (6 bitki başına 0,5 g) doku kültüründen elde edilir ve DIECA (4x bitki materyali kütlesi, kütle: hacim oranı) ile takviye edilmiş fosfat tamponu eklenir. Homojen bir çözelti elde etmek için 1-2 dakika el tipi homojenizatör kullanın.</li>
		<li>3-4 haftalık patates bitkilerinin ilk üç dip tam gelişmiş yaprağını (adım 1.6'dan itibaren) karborundum tozu ile hafifçe tozlayın. NOT: Carborundum tozu miktarını ayarlayın. Çok fazlası hasara neden olabilirken, çok azı etkisiz enfeksiyona neden olabilir. Optimal olarak, ortalama büyüklükte (yaklaşık 15cm2) yaprak başına yaklaşık 1,5 mg toz olan 0,1 mg/cm karborundum tozu kullanılır.</li>
		<li>Yaprakları inokülumla nazikçe ovalayın (yaprak başına ~ 100 μL). 10 dakika sonra yaprakları musluk suyuyla iyice yıkayın.<ol><li>Yapraklara zarar vermemeye dikkat edin. Kuluçka süresini aşmayın. Aşı miktarını yaprak boyutuna göre ayarlayın - 6,5 μL/cm, ortalama büyüklükteki yaprak başına yaklaşık 100 μL'dir (yaklaşık 15cm2).</li>
		</ol></li>
		<li>Bitkileri bir büyüme odasına aktarın ve kontrollü çevre koşullarında (ışıkta 28 °C ve karanlıkta 28 °C, %55 ± %5 bağıl nemde, 250 μmol/m2/s radyasyon ve 16 saat fotoperiyot ile) 3 gün boyunca büyütün.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Bitki hazırlama ve lezyon gelişimini kaydetmek için dijital mikroskobu kullanma
<ol><li>Aşılanmış bitkileri, aşılamadan 3 gün sonra 28 °C'de tutulan büyüme odasından 22 °C'de bir büyüme odasına, adım 1.5'te açıklanan diğer koşullarla aktarın.</li>
	<li>Gözlem için bir bitki seçin. İkinci aşılanmış yaprağı bant kullanarak hareketsiz hale getirin (Şekil 1D). Görüntülemeye başlamadan önce istenen yaprağın tamamen hareketsiz olduğundan emin olun (Şekil 1D).</li>
	<li>Dizüstü bilgisayara görüntü yakalama için bir yazılım uygulaması yükleyin. Dijital mikroskobu bilgisayara bağlayın. Yazılımı açın. NOT: Bilgisayarı prize takmak için bitkinin, dijital mikroskobun ve dizüstü bilgisayarın soketin yanındaki rafa yerleştirildiğinden emin olun. İzlenecek yaprakların seçimine ilişkin karar, incelenen biyolojik soruya, örneğin sınırlı programlanmış hücre ölümünün oluşumuna yol açan sürecin türüne bağlı olabilir.</li>
	<li>Mikroskobu hareketsiz yaprağın üzerine ayarlayın. Dijital mikroskop üzerindeki kadranı kullanarak odaklanın ( Şekil 1E'de gösterilmiştir).<ol><li>Lezyonun oluşumunu yakalama şansını artırmak için görüş hattının mümkün olduğunca geniş olduğundan, ancak yine de lezyonun görünümünü tespit edecek kadar büyütüldüğünden emin olun (tipik olarak 25x büyütme kullanılır).</li>
	</ol></li>
	<li>Kamera ayarlarını yapın. Görüntünün sağ üst köşesindeki Ayarlar düğmesine tıklayın (Şekil 2A, daire içine alınmış bölüm 1) ve kamera ayarlarını yapın: Parlaklık (60-70), Kontrast (10-15), Ton (0), Beyaz Dengesi, Doygunluk (45-50), Netlik (0), Gama (5) (Şekil 2B). Bu çalışmada kullanılan ayarlar şu şekildedir: Parlaklık (64), Kontrast (14), Ton (0), Doygunluk (47), Netlik (0), Gama (5). NOT: En iyi görüntü kalitesini sağlamak için kamera ayarları dış ışığa göre ayarlanmalıdır. Ayarlar, kullanıcının büyüme odasındaki koşullarına göre uyarlanabilir.</li>
	<li>Görüntü Yakalama simgesine tıklayarak görüntü yakalama ayarlarını yapın (Şekil 2C, daire içine alınmış bölüm 2). Hızlandırılmış Video düğmesine tıklayın ve Görüntü Yakalamayı 24 saat boyunca her 15 dakikada bir ayarlayın (Şekil 2C). NOT: Alınan görüntüler ile görüntüleme süresi arasındaki aralık tamamen esnektir ve deneyin ihtiyaçlarına göre uyarlanabilir. Görüntü yakalama arasındaki sürede, LED ışığı söner. Görüntü yakalama sırasında LED ışığı otomatik olarak açılır.</li>
	<li>BAŞLAT düğmesine tıklayarak görüntü yakalamayı başlatın (Şekil 2C). NOT: 28 °C'den 22 °C'ye aktarıldıktan sonra, bitkiler 24 saat içinde lezyonlar geliştirmeye başlamalıdır. Değilse, bu etkisiz aşılamanın bir işareti olabilir. Karborundum tozu miktarını ayarlayın, yapraklarda aşılama inkübasyon süresinin doğru olduğundan emin olun ve qPCR ile aşıdaki virüs bolluğunu belirleyin.</li>
	<li>Görüntüleri kaydetmek için tüm görüntüleri seçin ve Kaydet simgesine tıklayın (Şekil 2B, daire içine alınmış bölüm 3). Dışa aktarma seçeneklerini ayarlayın. DPI'yı maksimuma (300) ayarlayın (Şekil 2D). Kaydettikten sonra programdaki tüm resimleri silin.</li>
	<li>Görüntü analizi için, görüntü görüntüleme/düzenleme için herhangi bir program yeterlidir. Görüntü düzenleme için ücretsiz yazılım olan ImageJ'in kullanımı aşağıda açıklanmıştır.<ol><li>Tek bir görüş alanından görüntülerin zaman sırasını içe aktarın (sol üst köşede Dosya'yı tıklatın, İçe Aktar'ı ve ardından Görüntü Sırası'nı seçin). Kaydedilen resimlerin dizininin yolunu yapıştırın ve dönüştürmeyi başlatmak için OK düğmesine basın.</li>
		<li>Dönüştürmeden sonra, yazılım otomatik olarak son videoyu gösteren dahili bir video oynatıcı açar. Dosya > Farklı kaydet seçeneğine tıklayarak ve AVI Formatı'nı seçerek video dosyasını dışa aktarın. Küçük bir pencere açılır. Kare Hızını 0.3 fps olarak ayarlayın ve videoyu bir AVI video dosyası olarak kaydetmek için Tamam'a basın. NOT: Lezyon gelişim zamanı, tüm görüntülerin manuel olarak kontrol edilmesi ve lezyonun göründüğü bir görüntünün bulunmasıyla da belirlenebilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

Sürekli görüntüleme ile hücre ölümü başlangıcının ölçülmesi

<ol><li>Karasev, A. V., Gray, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+and+emerging+challenges+of+potato+virus+y+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Continuous and emerging challenges of potato virus y in potato.</a> Annual Review of Phytopathology. 51, 571-586 (2013).</li>
<li>Quenouille, J., Vassilakos, N., Moury, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+virus+Y%3A+A+major+crop+pathogen+that+has+provided+major+insights+into+the+evolution+of+viral+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Potato virus Y: A major crop pathogen that has provided major insights into the evolution of viral pathogenicity.</a> Molecular Plant Pathology. 14 (5), 439-452 (2013).</li>
<li>Szajko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+gene+Ny-1+on+potato+chromosome+IX+confers+hypersensitive+resistance+to+Potato+virus+Y+and+is+an+alternative+to+Ry+genes+in+potato+breeding+for+PVY+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">The novel gene Ny-1 on potato chromosome IX confers hypersensitive resistance to Potato virus Y and is an alternative to Ry genes in potato breeding for PVY resistance.</a> Theoretical and Applied Genetics. 116 (2), 297-303 (2008).</li>
<li>Szajko, K., Strzelczyk-Żyta, D., Marczewski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ny-1+and+Ny-2+genes+conferring+hypersensitive+response+to+potato+virus+Y+%28PVY%29+in+cultivated+potatoes%3A+Mapping+and+marker-assisted+selection+validation+for+PVY+resistance+in+potato+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">Ny-1 and Ny-2 genes conferring hypersensitive response to potato virus Y (PVY) in cultivated potatoes: Mapping and marker-assisted selection validation for PVY resistance in potato breeding.</a> Molecular Breeding. 34 (1), 267-271 (2014).</li>
<li>Lukan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+is+not+sufficient+for+the+restriction+of+potato+virus+Y+spread+in+hypersensitive+response-conferred+resistance+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Cell death is not sufficient for the restriction of potato virus Y spread in hypersensitive response-conferred resistance in potato.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 168(2018).</li>
<li>Baebler, Š, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylic+acid+is+an+indispensable+component+of+the+Ny-1+resistance-gene-mediated+response+against+Potato+virus+y+infection+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Salicylic acid is an indispensable component of the Ny-1 resistance-gene-mediated response against Potato virus y infection in potato.</a> Journal of Experimental Botany. 65 (4), 1095-1109 (2014).</li>
<li>Lukan, T., Coll, A., Baebler, Š, Gruden, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+virus+spread+around+the+cell+death+zone+at+spatiotemporal+resolution+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of virus spread around the cell death zone at spatiotemporal resolution using confocal microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 2447, 261-270 (2022).</li>
<li>Vinterhalter, D., Dragiüeviü, I., Vinterhalter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+in+vitro+culture+techniques+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Fruit%2C+Vegetable+and+Cereal+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Potato in vitro culture techniques and biotechnology.</a> Fruit, Vegetable and Cereal Science and Biotechnology. 2, Special Issue 16-45 (2008).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+plant+immune+responses+by+a+central+circadian+regulator%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Timing of plant immune responses by a central circadian regulator).</a> Nature. 470, 110-115 (2011).</li>
<li>Roden, L. C., Ingle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lights%2C+rhythms%2C+infection%3A+The+role+of+light+and+the+circadian+clock+in+determining+the+outcome+of+plant-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lights, rhythms, infection: The role of light and the circadian clock in determining the outcome of plant-pathogen interactions.</a> Plant Cell. 21 (9), 2546-2552 (2009).</li>
<li>Srivastava, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+circadian+rhythm+in+plant+system%3A+An+update+from+development+to+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Role of circadian rhythm in plant system: An update from development to stress response.</a> Environmental and Experimental Botany. 162, 256-271 (2019).</li>
<li>Mulaosmanovic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+detection+and+quantification+of+lesions+on+leaf+scale+based+on+trypan+blue+staining+and+digital+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for detection and quantification of lesions on leaf scale based on trypan blue staining and digital image analysis.</a> Plant Methods. 16, 62(2020).</li>
<li>Martinelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+of+plant+disease+detection.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Agronomy+for+Sustainable+Development%22%5BJournal%5D)">Advanced methods of plant disease detection. A review.</a> Agronomy for Sustainable Development. 35, 1-25 (2015).</li>
<li>Ali, M., Bachik, N., Muhadi, N. A., Tuan Yusof, T. N., Gomes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-destructive+techniques+of+detecting+plant+diseases%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Non-destructive techniques of detecting plant diseases: A review.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 108, 101426(2019).</li>
<li>Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+advanced+techniques+for+detecting+plant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Computers+and+Electronics+in+Agriculture%22%5BJournal%5D)">A review of advanced techniques for detecting plant diseases.</a> Computers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).</li>
<li>Rowarth, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+reveals+potential+regulators+of+programmed+cell+death+and+leaf+remodelling+in+lace+plant+%28Aponogeton+madagascariensis%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis reveals potential regulators of programmed cell death and leaf remodelling in lace plant (Aponogeton madagascariensis).</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 375(2021).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Gösterilen protokol, kullanıcının dijital bir mikroskop kullanarak hücre ölümü başlangıcı ile hücre ölümü görünümü arasındaki sürede aşılanmış yaprakları sürekli olarak görüntüleyerek hücre ölümü başlatma hızını doğru bir şekilde belirlemesini sağlar. Lezyonu ve bitki hastalığı oluşumunuizlemenin çok sayıda yolu olmasına rağmen 12,13,14,15, bu protokol, ölçümler arasında ışık kapatıldığı için bitkinin sirkadiyen ritmini bozmadan ışıktan bağımsız ölçüm avantajı sunar.
Aşılamadan sonra bitkiler 3 gün boyunca 28 °C'de büyümelidir. Aşırı duyarlı bir tepkiye neden olan Ny-1 direnç geni, sıcaklığa bağlıdır ve daha yüksek sıcaklıklarda yetiştirilen bitkilerde, lezyon oluşumu eksikliği ve sistemik virüs yayılımı olarak kendini gösteren direncin düşmesine yol açar3. Bitkiler 22 °C'ye aktarıldıktan sonra hücre ölümü başlar, bu nedenle doğru sonuçlar için bu transferden sonra mümkün olan en kısa sürede dijital mikroskop ile gözleme başlanmalıdır. Bitkinin görüntüleme için hazırlanmasındaki bir diğer önemli adım, yaprağın hareketsiz hale getirilmesidir (Şekil 1D), çünkü bitki görüntüleme sırasında büyümeye devam edecek, bu da gözlemlenen yaprağı odak dışına çıkarabilir veya bu tür bir kurulum istenen sonuçları vermeyecektir.
Açıklanan protokol, hücre ölümünün başlatılmasında rol oynadığı varsayılan değiştirilmiş bileşenlere sahip transgenik bitkiler üzerinde kullanılırsa, protokol, kullanıcının, çalışılan bir bileşenin azaltılmış seviyesinin hücre ölümü başlatma oranını etkileyip etkilemediğini belirlemesini sağlar. Bununla, hücre ölümünün başlatılmasında yer alan bileşenler, bu protokol kullanılarak programlanmış hücre ölümünün meydana geldiği patosistemlerde tanımlanabilir. Bu bileşenleri tanımlamak için diğer yöntemler, örneğin, pahalı ve zaman alıcı olabilen RNA-seq veya çeşitli mikroskopi formları gibi transkriptomik analizlerdir16. Bu protokolde açıklanan yöntem, transgenik ve kontrol bitkileri arasındaki hücre ölümü başlatma oranlarındaki farklılıkları gözlemleyerek hücre ölümünün başlamasına dahil olan bileşenlerin kolay ve ucuz bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Optimal olarak, böyle bir kurulumda, bir transgenik tesisin aynı deney içinde bir kontrol tesisi ile paralel olarak analiz edilmesi gerektiğinden, iki dijital kamera kullanılmalıdır.
Bu protokolde PVY suşu N-Wilga kullanıldı; bununla birlikte, bu virüsün diğer suşları, örneğin GFP etiketli PVY (PVY-N605 (123) -GFP) 7 de kullanılabilir. Ayrıca, programlanmış hücre ölümü gelişimi ile sonuçlanan diğer patosistemler, küçük modifikasyonlarla bu protokol kullanılarak incelenebilir.

Patates, dünyanın en çok yetiştirilen gıda ürünlerinden biridir ve pirinç, buğday ve mısırın ardından dördüncü sırada yer almaktadır. Bununla birlikte, patates üretimi, şu anda en önemli virüs patojeni 1,2 olarak kabul edilen patates virüsü Y'den (PVY) ciddi şekilde etkilenebilir. Patates bitkilerinde cv. Buna ek olarak, birkaç PVY suşu (PVY suşu N-Wilga dahil), patojenin enfeksiyon bölgesiyle olan kısıtlamasının aşılanmış yapraklarda nekrotik lezyonlar olarak ortaya çıktığı aşırı duyarlı yanıt (HR) ile verilen direnci tetikler3. Bu patosistemde, HR'ye sıcaklığa bağlı olan Ny-1 direnç geni aracılık eder, çünkü daha düşük sıcaklıklarda yetiştirilen bitkiler verimli bir şekilde nekrotik lezyonlar geliştirirken, yapısal olarak yüksek (28 °C) sıcaklıkta yetiştirilen bitkilerde, direncin düşüklüğü lezyon oluşumu ve sistemik virüs yayılımı eksikliği olarak gösterilmiştir 3,4. Bitkiler daha düşük bir sıcaklığa (22 °C) aktarıldığında, hücre ölümü başlatılır, bu da hücre ölümünün başlaması ile hücre ölümü görünümü arasındaki sürede aşılanmış yaprakları görüntüleyerek hücre ölümü başlama hızını takip etmek için kullanılabilir.
Bu protokol, dijital mikroskop kullanılarak hücre ölümü başlama hızının belirlenmesi için basit bir yöntem göstermektedir. Bitki 28 °C'den 22 °C'ye transfer edildikten sonra aşılanan yaprakların görüntülenmesiyle, dijital mikroskop yaprağın istenilen aralıklarla sürekli gözlemlenmesini sağlar. Diğer yöntemlerin kullanımından farklı olarak (örneğin, konfokal mikroskopi veya çıplak gözle lezyon oluşumunun gözlemlenmesi), bu, lezyon oluşumunun tam zamanının ve dolayısıyla hücre ölümü başlama hızının tam olarak dakikalara kadar belirlenmesine izin verir, yukarıda belirtilen yöntemlerdesaatlerin aksine 5,6. Dijital mikroskop kullanımı da ışıktan bağımsızdır ve bu nedenle gündüz ve gece kullanılabilir. Bu protokol aynı zamanda hücre ölümünün başlatılmasında yer alan bileşenleri tanımlamak veya kullanılan bitkiler transgenik ise ve ilgilenilen bileşenlerin seviyeleri değişmişse, farklı bileşenlerin hücre ölümü başlatma hızı üzerindeki etkilerini belirlemek için de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Alkol yakıcı</td><td>Mikro+Polo</td><td>SH-234002455</td><td>Cımbız ve neşter sterilizasyonu için</td></tr><tr><td>Otoklav A-21 CAV</td><td>Kambi<img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/65824/65824eq01.jpg" style="margin: auto; "></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Carborundum tozu</td><td>VWR Kimyasalları</td><td>22505297</td><td></td></tr><tr><td>DinoCapture 2.0 </td><td>Dijital mikroskop için</td> <td>Dino-Lite</td><td>Sürüm 2.0</td> yazılımı</tr><tr><td>Dijital mikroskop AM7915MZTL</td><td>AnMo Electronics Corporation</td><td>AM7915MZTL</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, p</td> <td>Stella Tech</td><td>P94000</td><td>Cımbız ve neşter sterilizasyonu için</td></tr><tr><td>Ekstraksiyon torbaları</td><td>Bioreba</td><td>420100</td><td></td></tr><tr><td>Büyüme odası FS-WI Foton</td><td>Sistemleri Cihazları</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>El homojenizatörü</td><td>Bioreba</td><td>400010</td><td></td></tr><tr><td>Hawita Özel Yüzey</td><td>HAWITA Gruppe</td><td>2000000071701</td><td>Turba (H4-H6 ve H6-H8) kullanılarak yapılan kullanıma hazır alt tabaka</td></tr> <tr><td>Hidroklorik asit (HCl)</td> <td>Merck</td><td>109057</td><td></td></tr><tr><td>Etiket bandı</td><td>Sigma</td><td>L8144-5EA</td><td></td></tr><tr><td>DinoCapture 2.0 yüklü dizüstü bilgisayar;</td><td>HP</td><td>Z2V77EA#BED</td> Deney, bir <td>büyüme odasında yer aldığından aktarılabilir olmalıdır</td></tr><tr><td>Murashige ve Skoog ortamı</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M02220100</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Emsure</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Emsure</td><td>1064700250</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipet  0.5 mL</td><td>Marka</td><td>21500209</td><td></td></tr><tr><td>pH-metre</td><td>Mettler Toledo</td><td>ML1601</td><td></td></tr><tr><td>Plastik kutular </td><td>Cvetlice Dornig</td><td>VCG10.5</td><td>Yarıçap = 10.5 cm</td></tr><tr><td>Plastik tencere </td><td>Lab Associates</td><td>DIS40003</td><td>Yarıçapı = 11,5 cm (üst), Yarıçap = 9,8 cm (alt)</td></tr><tr><td>Sakkaroz</td><td>Kemika d.d.</td><td></td><td></td>1800408</tr><tr><td>Sodyum Dietilditiokarbamat (DIECA)</td> <td>Sigma-Aldeich</td><td>228680</td><td>Sodyum dietilditiokarbamat trihidrat, ACS reaktifi</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (NaOH)</td> <td>Merck</td><td>106462</td><td></td></tr><tr><td>Steril cerrahi bıçaklar</td><td>Braun</td><td>4511733633</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>Braun</td><td>BD033R</td><td></td></tr></tbody></table>

dijital mikroskop kullanarak hücre Ölümü başlangıcının İncelenmesi

Studying Cell Death Initiation Using a Digital Microscope

Aşırı duyarlı yanıt (HR) verilen direnç, N direnç genleri tarafından belirlenebilen etkili bir savunma yanıtıdır. HR, aşılanmış yapraklarda hücre ölüm bölgelerinin oluşumu olarak kendini gösterir. Burada, dijital bir mikroskop kullanarak hücre ölümü başlangıcı ile hücre ölümü görünümü arasındaki sürede aşılanmış yaprakları görüntüleyerek hücre ölümü başlatma oranını incelemek için bir protokol sunulmaktadır. Dijital mikroskop, geleneksel yöntemlerde saatler yerine tam olarak dakikalara kadar hücre ölümü başlama hızının doğru bir şekilde belirlenmesine olanak tanıyan, istenilen aralıklarla sürekli bir görüntüleme işlemi sağlar. Dijital mikroskopla görüntüleme de ışıktan bağımsızdır ve bu nedenle bitkinin sirkadiyen ritmini bozmadan gece ve gündüz kullanılabilir. Programlanmış hücre ölümü gelişimi ile sonuçlanan farklı patosistemler, küçük değişikliklerle bu protokol kullanılarak incelenebilir. Genel olarak, protokol böylece hücre ölümü başlatma oranının basit, doğru ve ucuz bir şekilde tanımlanmasına izin verir.

Bu çalışma, patates cv'sinde lezyon oluşumu yoluyla hücre ölümü başlangıcını incelemek için adım adım bir protokol göstermektedir. Rywal, dijital mikroskop ile. Bu, programlanmış hücre ölümü başlangıcının tam zamanının belirlenmesini sağlar.
Kök gelişen bitkiler patates cv'sinden 2 hafta sonra toprağa konur. Rywal mikroyayılımı (Şekil 1A, B). Tarif edilen koşullar altında 3-4 haftalık büyümeden sonra, daha fazla analiz için sağlıklı görünen, görünür yaprakçıklara sahip en az 3-4 tam gelişmiş yapraklı bitkiler kullanıldı (Şekil 1C). Bu protokolde anlatıldığı gibi dijital mikroskop kullanarak, aşılanmış yaprak üzerinde aynı alanı 15 dakika aralıklarla gözlemledik ve zaman içinde lezyon oluşumunu ve genişlemesini belirledik (Şekil 3). Lezyon 15 saat 30 dakika sonra ortaya çıktı (Şekil 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65824/65824fig01.jpg"> Şekil 1: Dijital mikroskop ile analiz için bitki hazırlığı . (A) MS 30 orta ve patates cv içeren plastik bir kutu. Rywal bitkisi düğümler içeren eksplantlar. (B) Patates cv. Toprakta rywal bitkisi (mikro çoğaltmadan 2 hafta sonra). (C) Patates cv. Aşılamaya hazır (toprağa konulduktan 4 hafta sonra), en az üç tam gelişmiş yaprağa sahip rywal bitkisi. (D) Patatesin ikinci aşılanmış yaprağı (ok) cv. Rywal bitkisi bantla konumlandırılmış ve hareketsiz hale getirilmiştir (ok). (E) Odaklama için kullanılan kadranı gösteren ok ile dijital mikroskop altında konumlandırılmış bitki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65824/65824fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65824/65824fig02.jpg"> Şekil 2: Lezyon gelişiminin kaydedilmesi için dijital yazılım ayarı. (A) Yazılım arayüzü - (1) fotoğraf makinesi ayarları, (2) görüntü yakalama ayarları ve (3) görüntü kaydetme düğmesi için kırmızı daire içine alınmış seçeneklerdir. (B) A panelinde (1) üzerine tıklanarak açılan kamera ayarlarının bulunduğu pencere. Parlaklık, Kontrast, Doygunluk, Netlik ve Gama uygun şekilde ayarlanmalıdır. (C) Panel A'da gösterilen (2) üzerine tıklandığında açılan görüntü yakalama ayarlarının bulunduğu pencere. (D) Panel A'da gösterilen (3) işaretine tıklanarak açılan görüntü kaydetme ayarlarının bulunduğu pencere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65824/65824fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65824/65824fig03.jpg"> Şekil 3: Dijital mikroskop altında gözlenen aşılanmış yaprakta lezyon oluşumu. PVY aşılı patates yaprağının orta kısmının dijital mikroskop altında görüldüğü gibi 23,6x büyütmede 5 dakikalık aralıklarla çekilmiş görüntüleri. Aşılanan bitkiler 3 gün boyunca 28 °C'ye konuldu ve üçüncü gün saat 7:00'de 22 °C'de dijital mikroskop ile gözleme başlandı. (A) Saat 21:02'de lezyon henüz görülmez, (B) 90 dakika sonra, saat 22:32'de lezyon görülür. (C) Ertesi sabah 01:02'de ve (D) 07:32'de lezyon genişlemesi gözlendi. Deney iki kez tekrarlandı ve lezyonlar hücre ölümünün başlamasından 8 saat 15 dakika ve 12 saat sonra meydana geldi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65824/65824fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Burada, hücre ölümü indüksiyonunu takiben aşılanmış yaprakları sürekli görüntüleyerek programlanmış hücre ölümü başlatma oranını incelemek için bir protokol sunuyoruz.

Dijital Mikroskop Kullanarak Hücre Ölümü Başlangıcının İncelenmesi

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as ...

Başlamak için, virüs bulaşmış patates bitkilerini 22 santigrat derecede tutulan bir büyüme odasına aktarın. Gözlem için bir bitki seçin ve ikinci aşılanmış yaprağı tamamen hareketsiz hale getirmek için yapışkan bant kullanın. Ardından, dijital mikroskobu bilgisayara bağlayın ve görüntü yakalama yazılımını başlatın.Yaprağı mikroskobun altına yerleştirin. Ardından yaprağın yüzeyine odaklanmak için kadranı kullanın. Kamera ayarlarını yapmak için, ayarlar düğmesine tıklayın.Şimdi parlaklığı 64'e, kontrastı 14'e ve tonu sıfıra ayarlayın. Ardından, beyaz dengesini ayarlayın, ardından doygunluğu 47'ye, keskinliği sıfıra ve gamayı beşe ayarlayın. Görüntü yakalama simgesine tıklayın ve hızlandırılmış video seçeneğini seçin.Ardından, görüntü yakalamayı toplam 24 saat boyunca her 15 dakikada bir ayarlayın. Görüntü yakalamayı başlatmak için başlat düğmesine basın. Yakalanan görüntüleri kaydetmek için tüm görüntüleri seçin ve kaydet simgesine tıklayın.Şimdi dışa aktarma seçeneklerini seçin, ardından inç başına nokta sayısını maksimuma ayarlayın. Kaydedildikten sonra, programdaki tüm görüntüleri silin. Görüntüleri düzenlemek için ImageJ gibi bir düzenleme yazılımı başlatın.Dosyaya tıklayın, ardından içe aktar'ı seçin ve görüntülerin zaman dizilerini tek bir görüş alanından içe aktarmak için görüntü dizisini seçin. Kaydedilen resimlerin dizininin yolunu yapıştırın ve Tamam'a basın. Dönüştürme tamamlandığında, ImageJ otomatik olarak bitmiş videoyu görüntüleyen dahili bir video oynatıcı başlatacaktır.Dosyaya tıklayın, ardından farklı kaydedin ve video dosyasını dışa aktarmak için AVI formatını seçin. Küçük bir pencere açıldığında, kare hızını 0,3 FPS'ye ayarlayın, ardından videoyu bir AVI dosyası olarak kaydetmek için Tamam'a basın. Dijital mikroskobik analiz için en az üç ila dört tam gelişmiş yapraklı üç ila dört haftalık aşılanmış patates bitkileri kullanıldı.Aşılanan yaprak üzerinde aynı alan, lezyon oluşumunu ve zaman içinde genişlemesini belirlemek için 15 dakikalık aralıklarla gözlendi. 14 saatlik gözlemde herhangi bir lezyon görülmedi. Yaklaşık 90 dakika sonra gözle görülür bir lezyon kaydedildi.Lezyon iki saat sonra genişlemeye başladı ve sonraki sekiz buçuk saat boyunca genişlemeye devam etti.

studying-cell-death-initiation-using-a-digital-microscope

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz fare embriyolarının programlanmış hücre ölümü bölgeleri (PCD) ve LysoTracker adlı oldukça çözünür boya kullanarak embriyonik kök (ES) hücre kültürleri ayırt görselleştirmek için basit bir protokol mevcut.

Embriyolar yılında Programlı Hücre Ölümü Algılama LysoTracker kullanımı ve Embriyonik Kök Hücreler Farklılaşan

Mitoz geçiren kanser hücrelerinde fenantridin PJ-34 sitotoksik aktivite canlı konfokal görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak belgelenmiştir. PJ-34 eradike insan meme kanseri MDA-MB-231 mitoz İlave sentrozom barındıran hücreler. Normal iki odak mitoz farklı olarak, ekstra-sentrozom PJ-34 varlığında iki kutup mili kümelenmiş değildi.

Anormal Mitoz ile İlişkili Hücre Ölümü Canlı Kanser Hücreleri Konfokal Görüntüleme Uyacakları

Anastaz terimi, ölmekte olan hücrelerin geç bir aşamada hücre intihar sürecini tersine çevirdiği, kendilerini onardığı ve nihayetinde hayatta kaldığı fenomeni ifade eder. Burada, anastaz geçiren hücreleri tespit etmek ve izlemek için protokoller gösteriyoruz.

Takip inişi, Apoptosisi tersine Cep Survival Fenomeni için Stratejiler

Mikrobiyal popülasyonları genel davranışı dikte edebilir önemli hücre heterojenitesini içerir. Flow sitometri ile Moleküler prob analizi ancak uygulama türler arasında değişir, hücrelerin fizyolojik durumlarını belirlemek. Bu çalışma küçümseyen ya da yanlış pozitif sonuç kayıt olmadan, doğru bir siyanobakteryumdur nüfus içinde hücre ölümlerini belirlemek için bir protokol sağlar.

Moleküler Probe Optimizasyonu (a Fotosentetik Organizmaya Hücre Ölümlerini belirleme<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Akım Sitometri Kullanımı

Lazer microirradiation yaşayan hücrelerde DNA onarım çalışmaları için yararlı bir araçtır. Çeşitli DNA lezyonlar ikna etmek için UVA lazerler kullanımı için bir metodolojik yaklaşım gösterilir. Normal hücre döngüsü tutar yerel microirradiation için bir yöntemi optimize; Böylece, ışınlanmış hücre mitoz devam edin.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

İyonizan radyasyon (IR) araştırma-indüklenen klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü Malign tümörler ve normal dokuların IR etkileri anlamak için önemlidir. Burada, biz büyük modları IR kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü morfolojisi 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) üzerinde dayalı değerlendirmek için bir tek adımlı tahlil tarif-floresan mikroskopi tarafından görüntülenmiştir çekirdeği lekeli.

Tek adımlı protokol modu Floresans mikroskobu tarafından radyasyon kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü değerlendirilmesi için

Biz yöntemleri konvansiyonel ve confocal live-cep mikroskobu görüntüleme, dahil olmak üzere necroptosis MLKL-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu için scanning elektron mikroskobu ve lipid NMR tabanlı bağlama raporu.

Necroptosis MLKL-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu

Burada, hayatta kalma tek hücre olarak izlemek ve önemli ölçüde hücre ölümünü tahmin değişkenleri tanımlamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Boyuna floresans mikroskobu ile nöronal hayatta kalma izleme

Bu protokol, sitokinler gibi sitotoksik pertürbagenlere yanıt olarak insan kolonik organoidlerinde hücre ölümünü araştırmak ve ölçmek için basit ve uygun maliyetli bir yöntemi tanımlar. Yaklaşım, sitotoksik uyaranlara tek organoid tepkileri ölçmek için bir floresan hücre ölüm boyası (SYTOX Yeşil Nükleik Asit Boyası), canlı floresan mikroskobu ve açık kaynaklı görüntü analiz yazılımı kullanır.

Canlı Floresan Mikroskobu Kullanılarak İnsan Kolonik Organoidlerinde Sitokin ile İndüklenen Hücre Ölümünün Miktar Tayini

Bu protokol, lizozomal membran bütünlüğü ve asitleşmedeki değişiklikleri tespit eden floresan problar kullanarak, nekroptoz sırasında lizozomal membran geçirgenliğini izlemek için bir canlı hücre görüntüleme yöntemini açıklar.

Nekroptoz Sırasında Lizozomal Membran Geçirgenliğinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Öğrenin, dijital mikroskop kullanarak patates bitkilerinde hücre ölümü başlangıç hızını nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, lezyon oluşumunun tam zamanını belirleyerek bitki bağışıklık mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Dijital Mikroskop Kullanarak Hücre Ölümü Başlangıcının İncelenmesi

Daha fazla video keşfet