Proteomik ve Fosfoproteomik Analizler için Biyoakışkanlardan Hücre Dışı Veziküllerin Kimyasal Afiniteye Dayalı İzolasyonu
27 Ekim 2023
Mevcut protokol, fonksiyonelleştirilmiş manyetik boncuklar kullanılarak idrar hücre dışı veziküllerin etkili izolasyonu için ayrıntılı açıklamalar sağlar. Ayrıca, western blotlama, proteomik ve fosfoproteomik dahil olmak üzere sonraki analizleri kapsar.
Hücre dışı vezikül bazlı biyobelirteç keşfi üzerinde çalışıyoruz. Önemli bir adım, onları verimli ve seçici bir şekilde izole etmektir. Manyetik boncuk bazlı ayırmaya dayanan EVtrap, yüksek verim sağlayarak, kullanımı kolay, özellikle klinik uygulamalar için kolay olarak bize gerçekten yardımcı olabilir.
Bu protokolü, meme kanseri, böbrek kanserleri ve Parkinson Hastalığı gibi farklı hastalıklar için proteinlerde ve fosfoprotein biyobelirteçlerinde keşif için kullanıyoruz. Bu biyobelirteç biyosıvıdan elde edilir. EV'ler potansiyel olarak sıvı biyopsiler için kullanılabilir, bu da klinik tanı ve tedaviyi daha da iyileştirebilir.
Şu anda, hücre dışı vezikül izolasyonu için en yaygın kullanılan yaklaşım ultrasantrifüjleme ve çökeltmedir, ancak bu yöntemler kirleticilerin birlikte izolasyonu ve ayrıca düşük verimlilik ile sınırlıdır. Bu nedenle, EVtrap yöntemimiz, EV'leri izole etmek için daha etkili bir yol sağlayacak, bu da daha tekrarlanabilir ve hassas bir yönteme izin verecek ve aynı zamanda aşağı akış analizine fayda sağlayacaktır. İki şey üzerinde çalışıyoruz.
İlk olarak, EV izolasyonu ve aşağı akış analizi, özellikle de toplu yedekleme tabanlı bir analiz için yöntemler ve protokoller geliştirmeye devam ediyoruz. İkincisi, EVtrap'ın avantajı nedeniyle klinik alanda farklı uygulamaları araştırıyoruz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, fonksiyonelleştirilmiş manyetik boncuklar kullanılarak idrar ekstrasellüler veziküllerinin (EV'ler) verimli bir şekilde izole edilmesini özetlemektedir. Ayrıca, biyobelirteç keşfi için temel teşkil eden western blotting, proteomik ve fosfoproteomik gibi sonraki analizleri detaylandırmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyobelirteç Keşfi
- Hücre Dışı Veziküller
Arka Plan
- Hücre dışı veziküller, likit biyopsiler için önemlidir.
- Çeşitli hastalıklar hakkında öngörüler sağlayabilirler.
- Verimli izolasyon, klinik uygulamalar için kritik öneme sahiptir.
- Biyoakışkanlardan elde edilen proteinler ve fosfoproteinler potansiyel biyobelirteçlerdir.
Çalışmanın Amacı
- Biyobelirteç keşfini hızlandırmak.
- EV'leri verimli ve seçici bir şekilde izole etmek.
- Klinik tanı ve tedaviyi iyileştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Manyetik boncuklar kullanılarak idrar hücre dışı veziküllerinin izolasyonu.
- Protein analizi için Western blotting.
- Biyobelirteç tanımlama için proteomik ve fosfoproteomik.
- Klinik uygulamalar için yüksek çıktılı yöntemler.
Temel Sonuçlar
- Biyoakışkanlardan EV'lerin başarılı şekilde izole edilmesi.
- Hastalıklarla ilişkili proteinlerin ve fosfoproteinlerin tanımlanması.
- Sıvı biyopsi uygulamaları için kanıtlanmış potansiyel.
- Kanserler ve Parkinson hastalığı için biyobelirteç keşfinin kolaylaştırılması.
Sonuçlar
- Bu protokol, EV izolasyonunun verimliliğini artırır.
- Klinik olarak ilgili biyobelirteçlerin keşfini destekler.
- Tanısal ve terapötik stratejileri geliştirme potansiyeline sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Biyosıvılardan hücre dışı veziküllerin (EV'ler) verimli ve seçici bir şekilde izole edilmesi, biyofarma Ar-Ge'sinde proteomik odaklı biyobelirteç keşfi için kritik bir dönüm noktasıdır. Bu kimyasal afinite tabanlı manyetik boncuk protokolü, erken hastalık teşhisi ve hedef doğrulaması için temel teşkil eden kantitatif proteomik ve fosfoproteomik analizleri doğrudan destekleyerek, yüksek verimli ve tekrarlanabilir EV izolasyonu sağlar. Yöntem, translasyonel biyobelirteç süreçlerindeki öngörü güvenini artırır ve riskle uyumlu portföy ilerlemesini destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Hasta kaynaklı biyosıvılardan hastalıkla ilgili protein ve fosfoprotein imzalarının güçlü bir şekilde sorgulanmasını sağlar.
- Aşağı yönlü mekanistik çalışmalar için yüksek kaliteli EV kargosu sağlayarak fonksiyonel hedef doğrulamayı destekler.
- Tekrarlanabilir ve kantitatif moleküler profilleme aracılığıyla biyolojik risk azaltmayı kolaylaştırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Kantitatif kütle spektrometrisi iş akışları için uygun, standardize edilmiş, yüksek saflıkta EV preparatları sağlar.
- Kontaminantları minimize ederek ve EV verimini maksimize ederek analiz tekrarlanabilirliğini ve hassasiyetini artırır.
- Yüksek kapasiteli tarama ve platformun yeniden kullanımı için EV örneklerinin ölçeklenebilir preparasyonuna olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Klinik biyosıvılardan gerçek zamanlı moleküler anlık görüntüler yakalayarak translasyonel biyobelirteç stratejileriyle uyum sağlar.
- Tutarlı EV proteomu ve fosfoproteomu analizi sağlayarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar sürekliliği destekler.
- Klinik geliştirme öncesinde aday biyobelirteçler için mekanistik risk azaltma sağlar.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Bu EV izolasyon protokolü, erken keşif ve translasyonel araştırma arayüzünde yer alarak numune hazırlama ile kantitatif proteomik ve fosfoproteomik analiz arasında bir köprü kurmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: EV kaynaklı moleküler kargoya erişim sağlayarak hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturulmasını kolaylaştırır.
- Tarama: Alt analiz geliştirme ve bileşik değerlendirmesi için tekrarlanabilir, kantitatif EV örnekleri sağlar.
- Analitik: Farklı koşullar altında protein ve fosfoprotein bolluğunun yüksek çıktılı ve istatistiksel olarak güçlü ölçümünü destekler.
- Translasyonel Araştırma: Hasta örneklerinden preklinik modellere kadar biyobelirteç uyumunu ve sürekliliğini sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli Ar-Ge programları için standartlaştırılmış ve ölçeklenebilir bir EV izolasyon kapasitesi oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Biyobelirteç keşfinde öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Proteomik iş akışları için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir EV izolasyonu sağlar.
- Stratejik Değer: Güçlü moleküler profillemeyi mümkün kılarak karar verme kalitesini ve sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Biyobelirteç ve terapötik adaylarının risk ayarlı önceliklendirmesini ve geliştirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Optimum uygulama ve veri yorumlaması için proteomik, fosfoproteomik ve EV biyolojisi konularında uzmanlık gerektirir.
- Manyetik boncuk tabanlı ayırma sistemlerine ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi platformlarına erişim gerektirir.
- Tekrarlanabilirlik için örnek işleme ve analitik protokollerin ekipler arası standartlaştırılmasına ihtiyaç duyar.
- Çeşitli biyosıvı türlerine uyarlanabilir ancak farklı matrisler için optimizasyon gerektirebilir.
- Kantitatif tekrarlanabilirlik ve hassasiyet, protokole sıkı bağlılığa ve analitik kalibrasyona bağlıdır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:47
Extracellular Vesicle (EV) Isolation from Human Urine Samples Using the EVtrap Approach
3:39
Preparation of Dried Extracellular Vesicle (EV) Sample for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis
6:31
Proteome/Phosphoproteome Analysis of the Extracellular Vesicle (EV) Samples Using LC‐MS/MS
