Name: Rd10 Farelerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Fotoreseptör Progenitörlerinin Sub-Retinal Verilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Keşfedin, rd10 farelerde insani embriyonik kök hücre kaynaklı fotoreseptör progenitörlerinin sub-retinal verilmesi için optimize edilmiş protokolü. Bu yöntem, retinal dejenerasyon hastalıklarında görme restorasyonu için kök hücre tedavilerinin geliştirilmesine katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee ve Yingying Chung'a, kriyoprezervasyondan sonra 32 hESC'den türetilmiş fotoreseptör progenitörlerinin hazırlanması için teknik yardım sağladıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi Genç Araştırmacı Araştırma Hibe Ödülü (NMRC/OFYIRG/0042/2017) ve Ulusal Araştırma Vakfı24'üncü Rekabetçi Araştırma Programı Hibesi (CRP24-2020-0083) tarafından HGT'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.

İn vivo deneyler, SingHealth Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) tarafından Oftalmik ve Görme Araştırmalarında hayvanların kullanımına ilişkin Bildiri tarafından onaylanan kılavuzlara ve protokole uygun olarak yapılmıştır. Yavrular, siklosporin (260 g / L) içeren içme suyuyla beslenerek P17'den (nakil öncesi) P30'a (nakil sonrası) kadar immünosuprese edildi.
1. Kriyoprezervasyon sonrası 32. gün hESC'den türetilen fotoreseptör progenitörlerinin hazırlanması
<ol><li>37 °C'lik bir su banyosunda ön ısıtma fotoreseptör farklılaşma ortamı (PRDM).</li>
	<li>Sıvı nitrojenden 32. gün hESC'den türetilmiş fotoreseptör progenitör hücreleri içeren bir kriyoviyal alın. Kuru buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Cryovial'i 37 °C'de bir su banyosunda 3-5 dakika çözdürün. Gün 32 hücreyi 1 mL PRDM'de tekrar süspanse edin ve 4 dakika boyunca 130 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 1 mL PRDM'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücre sayımı için karışımın 10 μL'sini çıkarın. Üreticinin talimatlarına göre% 0.2 tripan mavisi kullanarak hücreleri karıştırın. Hücre karışımını hücre sayma haznesine pipetleyin slayt. Otomatik hücre sayacı ile hücre sayısını ve canlılığını belirleyin.</li>
	<li>Hücre canlılığı% 70'in üzerinde olduğunda bir sonraki adıma geçin. Kalan hücre süspansiyonunu 4 dakika boyunca 130 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve transplantasyon için 3 x 105 hücre / μL konsantrasyonunda PRDM'deki hücre peletini yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Görünür hücre kümelerini gözlemleyin. Görünür hücre kümelenmesi gözlenene kadar mikrofüj tüpünde 10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak hücre kümelerini tekrar tekrar süspanse edin. Hücre çözeltisinin iğneden ekstrüzyonunu gözlemlemek için 33G enjeksiyon şırıngasına yükleyin.</li>
</ol>2. rd10 farelerde hESC'lerin retina altı verilmesi
<ol><li>Hayvanların hazırlanması<ol><li>İntraperitoneal yaklaşımla 27G iğneye bağlı 1 mL'lik bir tüberkülin şırıngasında ketamin (20 mg/kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (2 mg/kg vücut ağırlığı) kombinasyonu kullanarak fareyi (P20, erkek/dişi, 3-6 g) uyuşturun. Önleyici bir analjezik olarak fareye deri altı buprenorfin (0.05 mg / kg) enjeksiyonu uygulayın.</li>
		<li>Anesteziyi uyguladıktan sonra, pupil dilatasyonu için% 1 tropikamid ve% 2.5 fenilefrin damlatın. Gözün kuruluğunu ve anesteziye bağlı kataraktı önlemek için korneaya oftalmik bir jel uygulayın.</li>
		<li>Tamamen uyuşturulana kadar fareyi boş bir kafese yerleştirin. Pençe yastığını sıkıştırarak uygun anestezi seviyesini değerlendirin ve hayvanın sert çimdiklemeye tepki verip vermediğini onaylayın.</li>
		<li>Fare tamamen uyuşturulduğunda, hayvanı 38 °C'ye ayarlanmış ılık bir ped üzerine yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücrelerin retina altı iletimi<ol><li>Burada yapıldığı gibi 1 portlu trans-vitreal pars plana yaklaşımını kullanmak için steril bir ortamda retina altı enjeksiyon yapın. Enjeksiyonu gerçekleştirmek için doğrudan ışık yoluna sahip dik bir ameliyat mikroskobu kullanın.</li>
		<li>İğne göbeğini çıkararak 10 μL'lik cam şırıngayı hazırlayın. 33G kör iğneyi cam şırıngaya monte edin. Metal göbek kapağını alın ve iğneyi şırıngaya dikkatlice sabitleyin.</li>
		<li>İğnede herhangi bir sızıntı belirtisi ve açıklığı olup olmadığını kontrol etmek için damıtılmış suyla yıkayın. Şırıngayı boşaltın ve dikkatlice yan tarafa koyun.</li>
		<li>Anestezi uygulanmış fareyi, tedavi gözü doğrudan mikroskobun hedefine bakacak şekilde bir yastığın üzerine yerleştirin. % 0.5 proparakain hidroklorür uygulayın ve 30 saniye bekleyin. Göze 150 μL oftalmik jel uygulayın ve üzerine yuvarlak bir örtü yerleştirin.</li>
		<li>Kornea, iris, göz bebeği, lens ve konjonktivayı gözlemleyerek gözün kaba bir muayenesini yapın. Göz bebeği aracılığıyla, odak düzlemini ayarlayarak fare gözünün fundusunu görselleştirin. Optik başlık göz bebeğinin ortasına yerleştirilene kadar başlığı ayarlayın ve yastığın üzerine uygun şekilde konumlandırarak başın hareketini en aza indirin.</li>
		<li>Düzgün bir hücre süspansiyonu elde etmek için tüpün tabanına hESC'lerle birden çok kez hafifçe vurun. 10 μL cam mikrolitrelik şırıngayı 33G künt iğne ile kullanarak 2 μL hücre/ortam çekin. Şırıngada hücre yerleşimini / kümelenmesini önlemek için enjeksiyondan hemen önce hücreleri geri çekin.</li>
		<li>30G tek kullanımlık bir iğne kullanarak, limbusun 2 mm arkasında bir sklerektomi yarası yapın. Lense dokunmamak için iğnenin açısını ~45°'de tutun. İğnenin ucu gözde görüntülendikten sonra iğneyi yavaşça geri çekin. İğne batmasını önlemek için kullandıktan sonra iğneyi keskin çöp kutusuna atın.</li>
		<li>Cam şırıngayı alın ve künt iğneyi sklerektomi yarasına yerleştirin. Lense dokunmadan, künt iğneyi giriş yarasının karşı retinasına ulaşana kadar ilerletin. Kanamayı önlemek için enjeksiyon alanının ana retina kan damarlarından arınmış olduğundan emin olun.</li>
		<li>Sklera üzerinde bir basınç dalı görülene kadar retinaya hafifçe nüfuz edin. Hücrelerin vitreus boşluğuna sızmasını önlemek için iğnenin kör ucunu skleraya paralel tutun.</li>
		<li>Şırınga üzerinde hafif bir basınç korunurken retina altı boşluğa 2 μL hücre süspansiyonu veya PRDM ortamı (kontrol) yavaşça enjekte edin. Başarılı bir enjeksiyonla, enjeksiyon bölgesinde görünür bir bleb (yani, içinde hücre süspansiyonu/ortamı bulunan yükseltilmiş retina) oluşturulmalıdır. NOT: Retina yırtılmasını ve iğne ucundaki hücrelerin tıkanmasını önlemek için enjeksiyon sırasında sadece hafif basınç kullanılmalıdır.</li>
		<li>Blebi onayladıktan sonra, hücrelerin yerleşmesi için 10 saniye bekleyin. İğneyi gözden yavaşça geri çekin.</li>
	</ol></li>
	<li>İntraoperatif optik koherens tomografi (OCT) bleb taraması (isteğe bağlı)<ol><li>Kafayı yavaşça hareket ettirerek kabarmayı mikroskop altında görselleştirmek için fare gözünü konumlandırın. Kafayı nazikçe tutarak pozisyonu sabitleyin. Ek bir göz bebeği genişlemesine gerek yoktur. Kapak fişini ve gözdeki jeli çıkarmayın. Blebi görselleştirmek için net bir optik ortam sağlar.</li>
		<li>Ameliyat mikroskobunun yerleşik iOCT işlevini kullanarak intraoperatif OCT'yi gerçekleştirin.</li>
		<li>OCT ekranında Küp seçeneğine basın ve Ok düğmelerine basarak tarama alanını bleb üzerine konumlandırın. En iyi OCT kalitesi için Merkezleme ve Odaklanma'yı kaydırarak OCT'yi ayarlayın. Bleb bölgesinin OCT taramasını almak için Yakala/Tara'ya basın. Taramaların kalitesini kontrol etmek için görüntüleri inceleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Kurtarma<ol><li>Kapak fişini çıkarın ve jeli gazlı bezle gözden temizleyin. Enfeksiyonu önlemek için enjeksiyondan sonra bir kez antibiyotik merhem sürün.</li>
		<li>Sternal yaslanmanın sürdürülmesi ve ev kafesine geri dönmesi için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanın ılık bir ışık altında anesteziden kurtulmasına izin verin. Hayvanı enjeksiyondan sonra en az 3 gün boyunca iltihaplanma, enfeksiyon ve sıkıntı belirtileri açısından izleyin. NOT: 150 W sıcak ışık, hayvan kafesinden en az 30 cm uzakta olmalı ve yanık yaralanmasını önlemek için dikkatli olunmalıdır.</li>
		<li>Deri altı buprenorfin enjeksiyonu (0.05 mg / kg) 1 gün boyunca 8 saatte bir veya veteriner hekimin tavsiyesine göre uygulayın. Gözde iltihaplanma veya enfeksiyon görülürse, uygun tedavi için bir veteriner hekime danışın.</li>
	</ol></li>
	<li>Aletlerin temizlenmesi ve sterilizasyonu<ol><li>10 μL cam mikrolitre şırıngayı ve 33G kör iğneyi %100 etanol 10x ile yıkayın. Şırıngayı damıtılmış suyla yakarak etanolü yıkayın.</li>
		<li>Cam şırıngayı ve iğneyi sökün. Şırıngayı saklamak için kurutun.</li>
	</ol></li>
</ol>

Canlandırıcı Görme: Retina Dejenerasyonu için Kök Hücre Tedavisi

Hwee Goon Tay, Alder Therapeutics AB'nin kurucu ortağıdır. Diğer yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Subretinal enjeksiyon, RPE ve retina hastalıklarını tedavi etmek için hücre süspansiyon transplantasyonu için kullanılmıştır 23,25,26,27,28,31,40. Bu yaklaşım, kemirgen çalışmalarında sadece hücre nakli ve gen tedavisi yaklaşımları için değil, aynı zamanda retina hastalıkları için yeni terap...

Kalıtsal retina hastalıkları ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu, fotoreseptör hücre kaybına ve sonunda körlüğe yol açar. Retina fotoreseptörü, fototransdüksiyondan (yani ışığın nöronal sinyallere dönüştürülmesinden) sorumlu özel hücrelerden oluşan retinanın dış segment tabakasıdır. Çubuk ve koni fotoreseptör hücreleri, retina pigmentli tabakaya (RPE) bitişiktir1. Hücre kaybını telafi etmek için fotoreseptör hücre replasman tedavisi ortaya çıkan ve gelişen bir terapötik yaklaşım olmuştur. Hasarlı fotoreseptör hücrelerini restore etmek için embriyonik kök hücreler (ESC'ler)2,3,4, indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) kaynaklı RPE hücreleri ve retinal progenitör hücreler (RPC'ler)4,5,6,7,8 kullanıldı. Retina ve RPE arasında sınırlı bir boşluk olan sub-retinal boşluk, çevresi nedeniyle hasarlı fotoreseptör hücreleri, RPE ve Mueller hücrelerini değiştirmek için bu hücreleri biriktirmek için çekici bir yerdir 9,10,11.
Gen ve hücre tedavileri, klinik öncesi çalışmalarda çeşitli retina hastalıkları için rejeneratif tıp için retina altı boşluğu kullanmaktadır. Bu, genin veya gen düzenleme araçlarının fonksiyonel kopyalarının anti-sens oligonükleotid tedavisi12,13 veya CRISPR/Cas9 veya adeno-ilişkili virüs (AAV) tabanlı strateji 14,15,16 yoluyla baz düzenleme, materyallerin implantasyonu (örneğin, RPE tabakası, retina protezleri 17,18,19) ve farklılaşmış kök hücre kaynaklı retinal organoidler 20,21,22 retina ve RPE ile ilişkili hastalıkları tedavi etmek için. RPE65 ile ilişkili Leber konjenital amauroz (LCA) 23,24, CNGA3 ile ilişkili akromatopsi25, MERTK ile ilişkili retinitis pigmentosa26, koroideremi 27,28,29,30 tedavi etmek için retina altı boşlukta hESC-RPE 31 kullanan klinik çalışmalar etkili bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır. Hücrelerin hasarlı alanın çevresine doğrudan enjeksiyonu, uygun bölgede hücre yerleşimi, sinaptik entegrasyon ve nihai görsel iyileşme şansını büyük ölçüde artırır.
İnsan ve iri gözlü modellerde (yani domuz 32,33,34,35, tavşan36,37,38,39,40 ve insan olmayan primat 41,42,43) retina altı enjeksiyon yapılmış olsa da, murin modelinde bu tür bir enjeksiyon, göz küresi boyutunun kısıtlanması ve muazzam olması nedeniyle hala zordur. fare gözünü işgal eden lens 44,45,46. Bununla birlikte, genetiği değiştirilmiş modeller büyük hayvanlarda (yani tavşanlarda ve insan olmayan primatlarda) değil, yalnızca küçük hayvanlarda kolayca bulunur, bu nedenle farelerde retina altı enjeksiyon, retinal genetik bozukluklarda yeni terapötik yaklaşımları araştırmak için dikkat çekmektedir. Hücreleri veya AAV'leri retina altı boşluğa iletmek için trans-kornea yolu, trans-skleral yol ve pars plana yolu olmak üzere üç ana yaklaşım kullanılmaktadır (Bkz. Şekil 2). Transkorneal ve transskleral yollar katarakt oluşumu, sineşi, koroid kanaması ve enjeksiyon bölgesinden reflü ile ilişkilidir 11,44,45,47,48,49. Enjeksiyon işleminin doğrudan görselleştirilmesi olarak pars plana yaklaşımını benimsedik ve enjeksiyon bölgesi mikroskop altında gerçek zamanlı olarak elde edilebiliyor.
Yakın zamanda, rekombinant insan retinasına özgü laminin izoformu LN523 kullanılarak ksenofree, kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında insan embriyonik kök hücrelerini (hESC'ler) fotoreseptör progenitörlerine farklılaştırabilen bir yöntem tanımladık. LN523'ün retinada mevcut olduğu tespit edildiğinden, insan retinasının hücre dışı matriks nişinin in vitro olarak özetlenebileceğini ve böylece hESC'lerden36 fotoreseptör farklılaşmasını destekleyebileceğini varsaydık. Tek hücreli transkriptomik analiz, koni-çubuk homeobox ve recoverin'i birlikte eksprese eden fotoreseptör progenitörlerinin 32 gün sonra üretildiğini gösterdi. Otozomal insan retinitis pigmentosa'yı taklit eden bir retina dejenerasyonu 10 (rd10) mutant fare modeli, 32 hESC'den türetilen fotoreseptör progenitörlerinin etkinliğini in vivo olarak değerlendirmek için kullanıldı. hESC'den türetilen fotoreseptör progenitör hücreler, fotoseptör disfonksiyonu ve dejenerasyonunun devam ettiği P20'de rd10 farelerin retina altı boşluğuna enjekte edildi36. Burada, kriyoprezervasyon sonrası hESC türevi fotoreseptör progenitörlerinin hazırlanması ve rd10 farelerin retina altı boşluğuna verilmesi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu yöntem aynı zamanda farelerde AAV'leri, hücre süspansiyonlarını, peptitleri veya kimyasalları retina altı boşluğa uygulamak için de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>% 0.3 Tobramisin</td><td>Novartis</td><td>NDC & nbsp; 0078-0813-01</td><td>Tobrex (3.5 g)</td></tr><tr><td>% 0.3 Tobramisin ve% 0.1 Deksametazon</td><td>Novartis</td><td>NDC 0078-0876-01</td><td>Tobradex (3.5 g)</td></tr><tr><td>% 0.5 Proparakain hidroklorür</td><td>Alcon</td><td>NDC 0998-0016-15</td><td>% 0.5 Alcaine (15 mL)</td></tr> <tr><td>1 mL Tüberkülin şırıngası</td><td>Turemo</td><td>SS01T2713</td><td></td></tr><tr><td>% 1 Tropicamide</td><td>Alcon</td><td>NDC 0998-0355-15</td><td>% 1 Midriasil (15 mL)</td></tr><tr><td>% 2.5 Fenilefrin hidroklorür</td><td>Alcon</td><td>NDC 0998-0342-05</td><td>% 2.5 Mydfrin (5 mL)</td></tr> <tr><td>24 oyuklu doku kültürü plakası</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>30 G Tek kullanımlık iğne</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>33 G, 20 mm uzunlukta künt iğneler</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Hücre Sayacı</td><td>NanoEnTek</td><td>Model: Havva</td><td></td></tr><tr><td>A Vitamini Içermeyen B27</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12587001</td><td>%236</td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>Ceva</td><td></td><td>Veterjezik veteriner (0.3 mg/mL)</td></tr><tr><td>CKI-7</td><td>Sigma</td><td>C0742</td><td>5 & mikro; İçme suyunda M36</td></tr><tr><td>Siklosporin</td><td>Novartis</td><td></td><td>260 g/L</td></tr><tr><td>Gün 32 hESC'den türetilmiş fotoreseptör progenitör hücreler</td><td>DUKE-NUS Tıp Fakültesi</td><td></td><td>İnsan embriyonik kök hücreleri 32 gün boyunca farklılaşır. Ref 36'daki protokole bakınız.</td></tr><tr><td>Gazlı</td><td>Bez Kazanan Sanayi Co., Ltd.</td><td>1SNW475-4</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Temel Orta</td><td>Gibco</td><td>11710&ndash; 035</td><td></td></tr><tr><td>hESC hücre hattı H1</td><td>WiCell Araştırma Enstitüsü</td><td>WA01</td><td></td></tr><tr><td>İnsan beyninden türetilmiş nörotrofik faktör (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02-50</td><td>10 ng/mL36</sup</td></tr><tr><td>>İnsan siliyer nörotrofik faktör (CNTF)</td><td>Prospec-Tany Technogene</td><td>CYT-272</td><td>10 ng/mL36</td></tr><tr><td>Ketamin hidroklorür (100 mg/mL)</td><td>Ceva Sant&eacute; Animale</td><td>KETALAB03</td><td></td></tr><tr><td>LN-521</td><td>Biolamina</td><td>LN521-02</td><td>1 & mikro; g36</sup</td></tr><tr><td>>mFreSR</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>5854</td><td></td></tr><tr><td>Mikrolitre cam şırınga (10 mL)</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>N-[N-(3,5-diflorofenasetil-L-alanil)]-S-fenilglisin t-butil ester (DAPT)</td><td>Selleckchem</td><td>S2215</td><td>10 & M36</td></tr><tr><td>N-2 takviyesi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A13707-01</td><td>%136</td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140&ndash; 050</td><td>1x36</td></tr><tr><td>NutriStem XF Media</td><td>Satorius</td><td>05-100-1A</td><td></td></tr><tr><td>Çalışma mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>OPMI LUMERA 700</td><td>Dahili iOCT fonksiyonlu</td></tr><tr><td>PRDM (Fotoreseptör farklılaşma ortamı, 50ml)</td><td>DUKE-NUS Tıp Fakültesi</td><td></td><td>Bkz. medya kompozisyonu36. Bazal Orta, 10 & M DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 ve mikro; M Retinoik asit, %2 B27 ve %1 N2. Bazal Ortam: 1x GMEM, 1 mM sodyum piruvat, 0.1 mM B-merkaptoetanol, 1x Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA).</td></tr><tr><td>Piruvat</td><td>Gibco</td><td>11360&ndash; 070</td><td>1 mM36</td></tr><tr><td>Rd10 fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>B6. CXB1-Pde6brd10/J fareler</td><td>Cinsiyet: erkek/dişi, Yaş: P20 (enjeksiyon), Ağırlık: 3-6 g&nbsp;</td></tr><tr><td>Retinoik asit</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0695/50</td><td>0.5 & M36</td></tr><tr><td>Yuvarlak Kapak Slipi (12 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td>0.5 & mikro; M36</sup</td></tr><tr><td>>Vidisic Jel (10 g)</td><td>Dr. Gerhard Mann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin hidroklorür (20 mg/mL)</td><td>Troy Laboratories</td><td>LI0605</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21985&ndash; 023</td><td>0,1 mM36</td></tr></tbody></table>

rd10 farelerde İnsan embriyonik kök hücre kaynaklı fotoreseptör progenitörlerinin sub-retinal verilmesi

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

İnsan pluripotent kök hücreleri kullanılarak fotoreseptör hücrelerin rejenerasyonu, hem kalıtsal hem de yaşlanan retina hastalıklarının ileri evrelerde tedavisi için umut verici bir tedavidir. İnsan rekombinant retinaya özgü laminin izoform matrisinin, insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler) fotoreseptör progenitörlerine farklılaşmasını destekleyebildiğini gösterdik. Ek olarak, bu hücrelerin subretinal enjeksiyonu, rd10 kemirgen ve tavşan modellerinde kısmi restorasyon göstermiştir. Subretinal enjeksiyonun, hedef boşluğa yakınlığı nedeniyle gözün fotoreseptör hücrelerine ve retina pigmentli epitel (RPE) tabakasına farmasötik bileşikler vermek için kullanılan yerleşik bir yöntem olduğu bilinmektedir. Ayrıca, retina hastalıklarını tedavi etmek için adeno ile ilişkili viral vektörleri retina altı boşluğa iletmek için de kullanılmıştır. Fare modelindeki farmasötik bileşiklerin ve hücrelerin retina altı iletimi, murin göz küresinin boyutundaki kısıtlama nedeniyle zordur. Bu protokol, genetik retinitis pigmentosa mutant, rd10 farelerinde hESC'den türetilen fotoreseptör progenitör hücrelerin enjeksiyon için hazırlanması ve bu hücrelerin retina altı dağıtım tekniği için ayrıntılı prosedürü açıklar. Bu yaklaşım, hedeflenen bölgeye, özellikle de fotoreseptör dejenerasyonuna yol açan hastalıkların meydana geldiği retinanın dış nükleer tabakasına hücre tedavisine izin verir.

10 μL'lik cam şırınga, üreticinin talimatlarına göre monte edilmiştir (Şekil 1) ve hücre süspansiyonunu/ortamını iletmek için kullanılan kör iğne Şekil 1B'de gösterilmektedir. Subretinal enjeksiyon için farklı yaklaşımlar Şekil 2'de gösterilmektedir. Bu protokolde pars plana yaklaşımını açıklıyoruz (Şekil 2C). Bir cam şırıngaya monte edilen künt iğne, bir sklerotomi yarasından sokuldu ve dünya çapında r...

Kriyoprezervasyon sonrası hESC kaynaklı fotoreseptör progenitör hücrelerin hazırlanması ve bu hücrelerin rd10 farelerde retina altı verilmesi için ayrıntılı bir protokol tanımladık.

Rd10 Farelerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Fotoreseptör Progenitörlerinin Sub-Retinal Verilmesi

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

Araştırmam, fotoreseptör dejenerasyonuna neden olan retina hastalıklarının ileri evreleri için kök hücre bazlı tedavinin geliştirilmesine odaklanmaktadır. Araştırmamızın amacı, klinik olarak güvenli ve fonksiyonel fotoreseptör progenitörleri olan hastalarda fotoreseptör kaybını, görme keskinliklerini artırmak ve hatta görüşlerini geri kazanmak amacıyla yerine koymaktır. Ana preklinik model farelerdir, ancak küçük boyutlu göz küreleri, özellikle retina altına malzeme enjekte etmeyi zorlaştırır.Başarılı subretinal enjeksiyonlar gerçekleştirme becerisini geliştirmek sabır ve azim gerektirir. Reseptör farklılaşma yöntemi için 32 günde fotoreseptör progenitörleri üretebilen bir laminin bazını başarıyla geliştirdik. Bu fotoreseptör progenitörlerinin kemirgenlerdeki hücre süspansiyonlarının subretinal transplantasyonları, gözlerdeki delikler ve greft arasında sinaptik bağlantı ile sonuçlandı.Bu, kısmi görsel restorasyona yol açmıştır. Yaklaşımımız basittir, doğru görselleştirme cerrahın iğneyi ilgilenilen alana tutmasına yardımcı olur.

sub-retinal-delivery-human-embryonic-stem-cell-derived-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu cerrahi teknik fare gözün subretinal boşluk içine gen terapisi vektörleri ve kök hücrelerinin enjeksiyonu göstermektedir.

Fare Göz içine Gen Terapisi Vektörler ve Kök Hücre Subretinal Enjeksiyon

Hücre nakli fotoreceptör kaybı ile karakterize retina dejenerasyonu tedavisi için bir stratejiyi temsil eder. Burada, nakledilebilir fotoreceptörlerin zenginleştirilmesi ve yetişkin farelere alt deri nakli için bir yöntem açıklıyoruz.

MACS Saflaştırılmış Fotoreceptör Öncü Hücrelerinin Yetişkin Fare Retinasına Subretinal Transplantasyonu

Burada, sıçanlarda ve farelerde bir RPE hücresi bolusunu subretinal olarak enjekte etmek için multimedya formatında topluluk tarafından kabul edilen bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, retinal dejenerasyonun hayvan modellerinde implantasyon üzerine aşılanmış RPE hücrelerinin kurtarma potansiyellerini, güvenlik profillerini ve hayatta kalma kapasitelerini belirlemek için kullanılabilir.

Süspansiyon Retina pigment epiteli Hücreleri sunun Kemirgenler Subretinal Enjeksiyonları Sahne

Subretinal enjeksiyon kök hücre replasman tedavisi için yaşa bağlı makula dejenerasyonu preklinik çalışmalarda yaygın olarak uygulanmıştır. Görüntülenmeyecektir bu makalede, biz daha az riskli, tekrarlanabilir ve tam olarak değiştirilmiş subretinal enjeksiyon tekniğini hücrelerin sıçan gözlerinin içine sunmak için trans-scleral yaklaşım yoluyla tanımlamak.

Sıçan gözlerinin içine insan retina Pigment epitel hücrelerinin Trans-scleral Subretinal nakli için rafine bir protokol geliştirilmesi

Retina pigment epitel hücreleri hücre-replasman tedavisi için Kuru yaşa bağlı makula dejenerasyonu gelişmiş form olarak hizmet verebilir. Bu iletişim kuralı coğrafi Atrofi büyük gözlü modeli ve hastalık bu modeline insan embriyonik kök hücre kaynaklı retina pigment epitel hücrelerinin nakli subretinal nesil açıklar.

Büyük gözlü manken coğrafi Atrofi, içine insan embriyonik kök hücre elde edilen retina Pigment epitel hücrelerinin subretinal nakli

Retina pigment epitel hücrelerinin insan amniyotik membran ve hayvan modellerinde aşılama için hazırlık üstüne kültürlü insan pluripotent kök hücreler elde oluşan bir retina doku mühendisi bir yöntem açıklanmaktadır.

Transplantasyonu uygun Retina Pigment epitel doku mühendisliği insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş

Burada, insan pluripotent kök hücresi (hPSC) kaynaklı retinal dokunun büyük bir hayvan modelinin subretinal boşluğuna nakledilmesi için cerrahi bir teknik sunulmaktadır.

Bir Kedi Büyük Hayvan Modelinde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Retinal Dokunun Subretinal Transplantasyonu

Bu protokol, retina dejenerasyonu olan veya olmayan fare alıcılarında düşük cerrahi komplikasyon oranıyla subretinal hücresel greftleri güvenli ve hassas bir şekilde vermek için transpupiller görme kılavuzluğunda trans-skleral bir yaklaşım sunar.

Retinal Dejenerasyon Fare Modelinde Subretinal Greftlerin Transpupiller Kılavuzluğunda Transskleral Transplantasyonu

Insan retinoblastom farelerde tümörlerin yaymak için bir yöntem açıklanmıştır. Tümör hücreleri bağışıklık eksikliği olan farelerde gözlerinin içine doğrudan enjekte edilir. İkincil tümörlerin başarıyla doğrudan insan tümörleri ve kültürlü tumorspheres hasat hücreler kullanılarak kurulmuştur.

Bağışıklık Eksik Fare Kuruluş ve İnsan Retinoblastom Tümörler yayılımı

Bir Kök Hücre Nakli In vitro Simüle İskemi / Reperfüzyon Modeli

Keşfedin, rd10 farelerde insani embriyonik kök hücre kaynaklı fotoreseptör progenitörlerinin sub-retinal verilmesi için optimize edilmiş protokolü. Bu yöntem, retinal dejenerasyon hastalıklarında görme restorasyonu için kök hücre tedavilerinin geliştirilmesine katkı sağlar.

Rd10 Farelerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Fotoreseptör Progenitörlerinin Sub-Retinal Verilmesi

Daha fazla video keşfet