Name: Farelerin Altı Arka Bacak Kasının Enzimatik Ayrışmasıyla Elde Edilen Sağlam Kısa, Orta ve Uzun İskelet Kası Lifleri: Fleksör Digitorum Brevisin Ötesinde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Öğrenin, enzimatik ayrışma yöntemiyle fare altı arka bacak kasından farklı uzunluk ve tipte kas lifleri izole etme tekniğini. Bu yöntem, uyarılma-kasılma mekanizmalarını incelemek için fizyolojik deneylerde kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, UdeA'dan Profesör Robinson Ramírez'e hayvanlar ve bazı fotoğraflar konusundaki yardımları için ve teknik destek için Carolina Palacios'a şükranlarını sunarlar. Kaika'dan Johan Pineda, renkli ve floresan kameraları kurmamıza yardımcı oldu. Queensland Üniversitesi'nden Shyuan Ngo, el yazmasını nazikçe düzeltti. Bu çalışma CODI-UdeA (22 Şubat 2021'den itibaren 2020-34909 ve 31 Mart 2022'den itibaren 2021-40170, SIU) ve Planlama Ofisi-UdeA (E01708-K ve ES03180101), Medellín, Kolombiya tarafından JCC'ye finanse edilmiştir. Fon sağlayıcılar veri toplama ve analizine, makale yazımına veya gönderimine katılmamıştır.

Tüm prosedürler, Antioquia Üniversitesi (UdeA) Hayvanlarla Deneylerde Etik Komitesi tarafından (21 Haziran 2016 tarihli 104 ve 15 Nisan 2021 tarihli 005 sayılı tutanaklar), Kolombiya Hükümeti tarafından yayınlanan 84 tarihli 84 sayılı Kanun ve 1993 tarihli 8430 sayılı Karara göre onaylandı ve Hayvan Araştırmalarına uygun olarak gerçekleştirildi ve raporlandı: In Vivo Deneylerin Raporlanması (ARRIVE) kılavuzları41. Burada sunulan tüm sonuçlar sağlıklı, 7-13 haftalık, 20-26 g, C57BL/6 erkek farelerden gelmektedir. Şekil 1, bu çalışmanın genel tasarımını ve prosedürlerin sırasını göstermektedir. Tüm reaktifler, malzemeler ve ekipman ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Hayvanlar
<ol><li>Kontrollü sıcaklık (21 ± 2 °C) ve ışık: karanlık (12:12 saat) döngüleri koşulları altında, ahşap türevli yataklı, akrilik, şeffaf, dikdörtgen kafes başına en fazla altı fare barındırın.</li>
	<li>Hayvanlara, çevresel zenginleştirme olmaksızın belirli patojen içermeyen hayvan tesislerinde yiyecek ve musluk suyuna ücretsiz erişim sağlayın.</li>
</ol>2. Diseksiyon
<ol><li>Çözeltiler, malzemeler ve reaktifler<ol><li>Çalışma çözeltilerini aşağıdaki bileşimle hazırlayın ve filtreleyin (0.22 μm) (tüm konsantrasyonlar mM cinsinden):<ol><li>Tirol: 5.4 KCl, 1 MgCl2, 140 NaCl, 0.33 NaH2PO4, 2 CaCl2, 10 glikoz, 10 HEPES, pH 7.3</li>
			<li>Ayrışma: 2.7 KCl, 1.2 KH2PO4, 0.5 MgCl2, 138 NaCl, 0.1 Na2HPO4, 1 CaCl2, pH 7.4</li>
			<li>Fosfat tamponlu salin (PBS): 137 NaCl, 8.6Na2HPO4, 2.8 KH2PO4, pH 7.34</li>
		</ol></li>
		<li>İki diseksiyon odası hazırlayın; stereoskop; ameliyat makası; ince makas; ince forseps; ve temiz, şeffaf, konik olmayan, 1-1.5 cm genişliğinde, kapaklı toplam hacmi 3-4 mL olan cam şişeler. Diseksiyon odalarındaki kasları elektriksel olarak uyarmak için bir sistem düzenleyin.</li>
		<li>Farklı genişlikte uçlara sahip ateşle parlatılmış Pasteur cam pipetler hazırlayın: 5, 4, 3, 2 ve 1 mm.</li>
		<li>Su banyosunu 37 °C'ye ayarlayın. 3 mg kollajenaz tip 2'nin alikotlarını tartın.</li>
	</ol></li>
	<li>Prosedür<ol><li>Yerel Etik Kurul tarafından onaylanan yöntemleri kullanarak fareyi kurban edin. Servikal çıkık, hızlı, daha az stresli olduğu ve kas dokusunu etkileyebilecek ilaçlara (CO2 veya bazı anestezikler gibi) maruz kalmayı önlediği için önerilir. Daha iyi sonuçlar elde etmek için hemen diseksiyona başlayın.</li>
		<li>Fareyi köpük bir yüzeye yerleştirin ve ön ayakları bantlayın veya sabitleyin. Her iki arka ayağı da ameliyat makası ile dizlerin üzerinden kesin, her birini ayrı bir diseksiyon odasına aktarın ve dokuyu kaplamak için soğuk (10-20 °C) Tyrode ekleyin. NOT: Her arka bacak aşağıdaki sırayla altı farklı kas verecektir: FDB, soleus, EDL, EHL, PL ve PDQA. Tendondan tendona sağlam altı kası incelemek için ayrıntılı anatomik referanslar Şekil 2'de ve başkayerlerde verilmiştir 42.</li>
		<li>İlk arka ayağı, bacakların arka yüzünün görülebileceği bir pozisyonda diseksiyon odasına sabitleyin. Cildi büyütme altında çıkarın; ardından FDB'yi açığa çıkarın ve çıkarın (Şekil 2). 1 mL Tyrode çözeltisi ile etiketli bir cam şişede saklayın. NOT: Kas dokusunda istenmeyen herhangi bir kesiyi önlemek için uygun büyütme ve önceden eğitim gereklidir.</li>
		<li>Soleus'u açığa çıkarın, çıkarın ve 1 mL Tyrode ile ayrı bir şişede saklayın. Şekil 2'de gösterildiği gibi, önce gastroknemius'u ayırmak ve ardından soleus'u çıkarmak için ince makas kullanın.</li>
		<li>Bacağın ön yüzünü ortaya çıkarın, cildi çıkarın ve tibialis anteriorunun distal tendonlarını ve ayak bileğindeki EDL kaslarını tanımlayın. Tibialis'i çıkarın ve atın; daha sonra EDL'nin distal tendonlarını kesin (Şekil 2). EDL'yi çıkarana kadar diseksiyona devam edin ve 1 mL Tyrode ile ayrı bir cam şişeye koyun.</li>
		<li>EDL'nin hemen arkasında ve medialinde yer alan EHL kasını çıkarın. Şekil 2'nin ilgili panelinde gösterildiği gibi, tendonu 1. basamağa kadar tanımlayarak ve takip ederek diseksiyona başlayın. Kasları 1 mL Tyrode ile ayrı bir cam şişede saklayın.</li>
		<li>Kesmek ve PL kasını çıkarmak için peronei'nin en dış tendonunu tanımlayın ve takip edin (Şekil 2). Kası 1 mL Tyrode ile ayrı bir cam şişeye yerleştirin.</li>
		<li>Tendonu tanımlayın ve 4. basamağa kadar takip edin; kesin ve PDQA kasını çıkarın (Şekil 2). 1 mL Tyrode ile ayrı bir cam şişeye koyun.</li>
		<li>İşlemi ikinci arka bacak ile tekrarlayın.</li>
		<li>Aynı tipteki her iki kası da etiketli bir cam şişede veya Tyrode solüsyonu içeren küçük bir Petri kabında toplayın. NOT: Bir çalışma seansı sırasında ikiden fazla kas çiftinin diseke edilmesi planlanıyorsa, diseksiyon prosedürü için iki araştırmacı görevlendirin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kas lifi izolasyon protokolü
<ol><li>Kalıntıları ve fare kürkünü temizlemek için diseksiyon odalarındaki Tyrode solüsyonunu yenileyin. FDB kaslarını bir diseksiyon odasına dökün, bütünlüklerini doğrulayın ve 1 mL ayrışma solüsyonu ile yeni bir cam şişeye aktarın. Bu prosedürü EHL, PL ve PDQA kasları ile tekrarlayın. NOT: Bir kas aşırı kasılmış, kesilmiş görünüyorsa veya elektriksel stimülasyona yanıt vermiyorsa, bir sonraki protokol adımına devam etmeyin. Bunun yerine, solüsyonların kalitesini (pH, kontaminasyon, ozmolarite) doğrulayarak ve daha fazla diseksiyon becerisi kazanarak diseksiyon protokolünü optimize edin (Şekil 1C ve Ek Video S1).</li>
	<li>Liflerin oryantasyonunu takip ederek soleus ve EDL kaslarına uzunlamasına veya çapraz kesimler yapın (Şekil 2). Soleus için, uzunluğunun ~% 80'ini keserek merkezi tendonu takip edin. EDL için, sadece bir veya iki tendonu takip edin ve soleus ile aynı uzunlukta kesin. Her bir kas çiftini 1 mL ayrışma solüsyonu ile cam şişelere koyun. NOT: Bu prosedür EDL ve soleusu küçültür ve kollajenazın dokuya daha iyi girmesini sağlar. Yeterli büyütme (40-50x), ince makas ve forseps zorunludur. Ayrışma protokolünün bir sonraki adımına geçmeden önce her zaman görsel inceleme ve elektriksel stimülasyon ile numune bütünlüğünü kontrol edin.</li>
	<li>1 mL ayrışma çözeltisi ve bir çift kas içeren her şişeye 3 mg kollajenaz tip 2 (250-300 U / mg aktivite ile) ekleyin. Kullanılan enzim partisinin aktivitesini göz önünde bulundurarak tam kollajenaz miktarını standartlaştırın.</li>
	<li>Kas çiftlerini su banyosunda 36.8-37 ° C'de 65-90 dakika hafifçe çalkalayarak inkübe edin. NOT: Sıcaklık kontrolü konusunda titiz olun. Hasarı önlemek için kasların 100 dakikadan fazla kollajenaz içinde kalmaması için prosedürü standartlaştırın.</li>
	<li>İnkübasyonun 65. dakikasından sonra her 5 dakikada bir stereoskop büyütme altındaki şişeleri kontrol edin. Kaslar hafifçe dalgalı, düzensiz ve gevşek göründüğünde, şişeyi hafifçe sallayın ve bazı liflerin kolayca ayrılmaya başlayıp başlamadığını kontrol edin. Bu durumda, kollajenazı etkisiz hale getirmek ve çıkarmak için kasları oda sıcaklığında Tyrode ile yıkayın. NOT: Yıkama işlemi, pipetlerle kaslara dokunmadan dikkatlice yapılmalıdır. 0.8 mL Tyrode ekleyerek başlayın ve ardından çözeltinin 0.8 mL'sini çıkarın. Bu prosedürü 4-5 kez tekrarlayın ve çözümün tamamen şeffaf hale geldiğini doğrulayın.</li>
	<li>Ateşle parlatılmış Pasteur pipet setinin yardımıyla Tyrode'da çok nazik bir öğütme ile kasların büyük kısmından daha fazla lif ayırın. Solüsyonu en geniş pipetle (5 mm uç) kasın etrafında çalkalayarak başlayın ve ardından kasları pipetin 3-4 kez içine ve dışına yavaşça çekin. Kas lifleri serbest bırakmaya başladığında ve inceldiğinde, işlemi bir sonraki pipetle (4 mm uç) tekrarlayın. NOT: Bu prosedürle işlenen lifler, Ek Video S2, Ek Video S3, Ek Video S4 ve Ek Video S5'te PL, EDL, EHL ve soleus lifleri kullanılarak örneklendiği gibi, 24 saatten fazla bir süre boyunca uyarılabilir ve hızlı bir şekilde büzülür.</li>
</ol>4. Deneysel prosedürler
NOT: İzole edilmiş lifler sarkoplazmik Ca2+ konsantrasyon tahminleri, morfometrik ölçümler ve miyozin ağır zincir (MHC) ekspresyon çalışmaları için kullanılmıştır.
<ol><li>Sarkoplazmik Ca ölçümü2+ seğirme sırasında konsantrasyon<ol><li>Deneysel banyo odasına temiz, cam bir slayt monte edin. Slaytı 2-3 μL laminin ile kaplayın ve ~400 μL fiber süspansiyonu slaytın üzerine dökmeden önce 30 saniye kurumasını bekleyin. Liflerin oda sıcaklığında 10-15 dakika laminine yapışmasına izin verin.</li>
		<li>Deney odasını, epifloresan için donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskobun sahnesine monte edin (Şekil 3A).</li>
		<li>Deney odasının her iki tarafına yerleştirilmiş iki platin elektrot boyunca dikdörtgen akım darbeleri (0.8-1.2 ms) uygulayarak liflerin canlılığını doğrulamak için tek seğirmeleri uyandırın. Laminine bağlandığında bile, liflerin büzülmesi esas olarak uç noktalarda hala görülebilir.</li>
		<li>Lifleri 3.5-4.5 μM hızlı Ca2+ boya Mag-Fluo-4, ile 4-5 dakika Tyrode çözeltisi içinde yükleyin. Bu sürenin sonunda, hücre dışı boyayı çıkarmak için Tyrode ile hafifçe yıkayın. Hücre içi boyanın karanlık koşullar altında ~ 15-20 dakika boyunca esterden arındırılmasına izin verin. Boya bölümlendirmesini önlemek için sıcaklığı her zaman 22 °C'nin altında tutun. NOT: Yükleme Tyrode çözeltisindeki nihai DMSO konsantrasyonu %0,5'ten az olacak şekilde, yalnızca dimetil sülfoksit (DMSO) içinde bir Mag-Fluo-4, stoğu hazırlayın.</li>
		<li>Fiberi beyaz ışık yayan diyot (LED) ve uyarma/dikroik/emisyon için aşağıdaki dalga boylarına sahip bir filtre seti ile aydınlatın: 450-490/510/515 nm (Şekil 3A). NOT: Alternatif uyarma kaynakları arasında cıva ve ksenon floresan lambalar bulunur. Boyanın foto ağartılmasını ve hücreye zarar vermesini önlemek için uyarma noktasının mümkün olan en düşük yoğunluğunu ve boyutunu kullanın.</li>
		<li>20-22 ° C'de deney odasının her iki tarafına yerleştirilmiş iki platin elektrot aracılığıyla dikdörtgen akım darbeleri (0.8-1.2 ms) uygulayarak fiberin Ca 2+ tepkisini (sarkoplazmik Ca 2+ geçici maddeler) uyandırın.</li>
		<li>Floresan için uygun yağa daldırma 40x uzun mesafeli objektif ve bir sayısallaştırıcıya bağlı bir fotoçoğaltıcı tüp (PMT) ile ışık sinyallerini toplayın ve kaydedin (Şekil 3A ve Ek Video S6). Edinme yazılımında 0-200 rastgele birimlik (AU) bir ölçek sağlayın ve uyarma noktasının boyutunu ve PMT'nin kazancını modüle ederek deneyin dinlenme floresansını (Fdinlenme) bu ölçekte 10 AU'ya ayarlayın. Prosedür standartlaştırıldıktan sonra, kazancı bir deneyden diğerine değiştirmeden tutun ve ölçeği yalnızca nokta boyutunda küçük ayarlamalar yaparak ayarlayın. NOT: Hareket artefaktları ortaya çıkarsa, Tyrode çözeltisinde 20-30 μM N-benzil-p-toluen sülfonamid (BTS) kullanın.</li>
		<li>Sinyalleri aşağıdaki gibi analiz edin ve kalibre edin:<ol><li>Alçak geçiren tüm izi 1 kHz'de filtreler.</li>
			<li>İzin 1 saniyesinde Frestini hesaplayın, Frestini 0'a ayarlayın ve tepe sarkoplazmik Ca2+ geçici genliklerinin genliğini (Ftepe noktası) ölçün. Genliği denklem (1)'deki gibi sunun: <img alt="Floresan yoğunluk oranı formülü ΔF/F = Fpeak/Frest, matematiksel denklem." src="/files/ftp_upload/65851/65851eq01v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1">(1)</li>
			<li>Denklem (2)26 ve aşağıdaki parametreleri kullanarak tepe Ca2+ konsantrasyonunu ([Ca2+], μM) hesaplayın: in situ ayrışma sabiti (Kd) = 1,65 × 105 μM2, maksimum floresan (Fmaks) 150,9 AU, minimum floresan (Fmin) 0,14 AU, Mag-Fluo-4 konsantrasyonu [D]T 229,1 μM26. Fzirvesi 4.1.8.2 adımında zaten elde edilmiştir. <img alt="Biyokimyasal analizde kalsiyum konsantrasyonu hesaplama formülü, denge denklemini gösterir." src="/files/ftp_upload/65851/65851eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2">(2)</li>
			<li> <img alt="Üstel bozunma formülü, diyagram, veri uydurma analizi, geçici dinamik modellemesi." src="/files/ftp_upload/65851/65851eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3"></li><li></li></ol></li></ol></li><li><ol><li><li><li> </li><li><li><ol><li></li><li></li><li></ol></li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li><li><li><ol><li><li> </li></ol></li><li><li><li> </li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li><li><li><li><li><li><li><li></ol></li></ol><ol><li><li></li><li><li>&lt;</li></ol>

Değişken Uzunluklu Fare Kas Liflerinin Enzimatik İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Olgun iskelet kası biyolojisini incelemek için mevcut modelleri tamamlamak için, burada kısa, orta ve uzun liflere sahip bir dizi fare kasının başarılı bir şekilde enzimatik ayrışmasını gösteriyoruz. Bu lifler, iskelet kasındakiCa2+ geçici akımlarının MT-II kinetiğinin genelleştirilebilirliğinin gösterilmesine izin verir. Ayrıca, sağlam, bütün kaslardaki lif tipleri sınıflandırıldı. FDB'nin fizyolojik deneyler için en çok kullanılan kas olduğu göz önüne alındığında, ayrışmadan sonra hücre süspansiyonunda bulun...

Memelilerin olgun iskelet kası çok işlevli bir dokudur. Metabolizmayı yoğun bir şekilde düzenler, ısı üretiminin ana kaynağıdır ve dinamik özellikleri ona solunumda, vücut bölümlerinin hareketinde veya bir noktadan diğerine yer değiştirmede önemli bir rol verir 1,2,3. İskelet kası, miyopatiler, distrofiler veya sarkopeni gibi kalıtsal ve kronik durumların yanı sıra kardiyometabolik hastalıklar 3,4,5,6,7,8 gibi birçok kas dışı kronik durum da dahil olmak üzere birçok hastalığın patofizyolojisi ile de ilgilidir.
Sağlık ve hastalık bağlamında olgun iskelet kasının yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin ex vivo çalışması, esas olarak iki deneysel model aracılığıyla mümkün olmuştur: tüm kas ve izole lifler. 20. yüzyılda araştırmacılar, motor üniteler, lif tipleri ve kasılma ve gevşeme kuvveti ve kinetiği gibi dinamik özellikler hakkında bilgi edinmek için farklı küçük türlerin bütün, bozulmamış ekstansör digitorum longus (EDL), soleus, tibialis anterior ve gastroknemius kaslarının özelliklerini önemli modeller olarak kullandılar 9,10,11,12,13,14,15,16. Bununla birlikte, daha rafine hücre biyolojisi çalışmalarının ortaya çıkışı, alanı tek kas liflerinin incelenmesine doğru kaydırdı. Öncü çalışma daha sonra sıçanların bozulmamış fleksör digitorum brevis (FDB) liflerinin enzimatik ayrışma yoluyla daha sonraki karakterizasyon için izolasyonunu sağladı 17,18,19. FDB lifleri manuel diseksiyon20 ile de elde edilebilse de, çeşitli deneysel yaklaşımlara uygunluklarına ek olarak, murin kaslarının enzimatik ayrışmasının kolaylığı ve yüksek verimi, ikinci modelin son yirmi yılda yaygın olarak kullanılmasını sağlamıştır.
Kısa FDB lifleri, elektrofizyolojik ve diğer biyofiziksel çalışmalar, biyokimyasal, metabolik ve farmakolojik analizler, elektron ve floresan mikroskobu deneyleri, hücre biyolojisi yaklaşımları için transfeksiyon veya miyogenez çalışmalarında kök hücre kaynağı olarak uygundur 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. Bununla birlikte, kas deneylerinde sadece FDB liflerinin kullanılması, lif türleriyle ilgili araştırmaların kapsamını daraltır ve bazı metodolojik teknikler veya bir hayvandan daha fazla bilgi edinmek için mevcut biyolojik materyal miktarını sınırlar. Bu sınırlamalar, hücresel fizyolojik fenomenlerin farklı bütün, sağlam kaslarda (örneğin, EDL, soleus, peronei) gerçekleştirilen önceki biyokimyasal ve dinamik çalışmalarla açık bir korelasyonunu engellemektedir.
Bu sınırlamaların üstesinden gelen bazı gruplar, daha uzun EDL ve soleus kaslarını 24,33,34,35,36,37,38,39,40 ayırmayı başardı ve yöntemi diğer ilgili kaslara daha da genişletmek için kapıyı açtı. Bununla birlikte, EDL ve soleus liflerinin kullanımı, muhtemelen onları bozulmamış lifler olarak elde etmek için metodolojik ayrıntıların bulunmamasından dolayı hala azdır. Burada, farklı uzunluk ve tipteki liflerin altı kastan nasıl izole edileceğini ayrıntılı olarak açıklıyoruz: bunlardan üçü daha önce tanımlanmış (FDB, EDL ve soleus) ve üçü ilk kez başarılı bir şekilde ayrıştı (ekstansör hallusis longus [EHL], peroneus longus [PL] ve peroneus digiti quarti [PDQA]). Bu çalışmanın sonuçları, enzimatik olarak ayrışmış liflerin modelinin çok çeşitli çalışmalar ve daha önce yayınlanmış verilerle gelecekteki korelasyonlar için uygun olduğunu ve böylece olgun iskelet kası çalışmaları için modellerin kullanılabilirliğini artırdığını doğrulamaktadır.

<table><tbody><tr><td><güçlü >Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mutlak etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Merck</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid</td><td>Gibco BRL</td><td>15512-015</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat</td><td>Panreac</td><td>141138.1610</td><td></td></tr><tr><td>Anti miyozin I antikoru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4276</td><td>Birincil antikor</td></tr>, <tr><td>Anti miyozin II antikoru</td>, <td>Sigma Aldrich</td>, <td>M8421</td>, <td>Birincil antikor</td></tr>, <tr><td>Anti miyozin IIA antikoru</td>, <td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>, SC-71</td>, <td>Birincil antikor. HB-277 hibridoma</td></tr><tr><td>Anti miyozin IIB antikorundan</td> türetilmiştir <td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td>BF-F3-c&nbsp;</td><td>Birincil antikor</td></tr><tr><td>Bis-akrilamid</td><td>AMRESCO</td><td>0172</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Thermo Scientific</td><td>B14</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reaktifi</td><td>Merck</td><td>1.10306.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Carlo Erba</td><td>428658</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum karbonat</td><td>Merck</td><td>102066</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum diklorür (CaCl2)</td><td>Merck</td><td>2389</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319988</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz tip 2</td><td>Worthington</td><td>CLS-2/LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Konsolos Dağı</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990440</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Parlak mavi R 250&nbsp;</td><td>Merck</td><td>112553</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>AMRESCO</td><td>0281</td><td></td></tr><tr><td>Edetic asit (EDTA</td><td>AMRESCO</td><td>0322</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Panreac&nbsp;</td><td></td><td></td>1423291211</tr><tr><td>Glisin</td><td>Panreac</td><td>151340.1067</td><td></td></tr><tr><td>Keçi serumu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen</td><td>Termo Bilimsel</td><td>6765015</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AMRESCO</td><td>0511</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>AMRESCO</td><td>M136</td><td></td></tr><tr><td>İzopentan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Fluo-4,</td><td>Invitrogen</td><td>M14206</td><td>Sadece DMSO'da hazırlanmıştır. Pluronik asit gerekli değildir ve lif bozulmasını önlemek için kullanılmamalıdır.</td></tr><tr><td>Merkaptoetanol</td><td>Uygulaması</td><td>A11080100</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Protokimica</td><td>MP10043</td><td></td></tr><tr><td>Fareler</td><td>Birkaç Birkaç</td><td>Bu</td><td>el yazması için sadece C57BL / 6 fareleri kullandık. Bununla birlikte, bazı ön sonuçlar, protokolün aynı yaş ve ağırlıktaki İsviçre Webster fareleri için iyi çalıştığını göstermiştir.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>N, N, N', N'-tetrametiletan-1,2-diamin (TEMED)</td> <td>Promega</td><td>V3161</td><td></td></tr><tr><td>N-benzil-p-toluen sülfonamid (BTS)</td> <td>Tocris</td><td>1870</td><td></td></tr><tr><td>Optimal kesme bileşiği (OCT)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>İkincil antikor</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11001</td><td>Keçi anti-fare IgG (H + L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Panreac&nbsp;</td><td></td><td></td>1323631209</tr><tr><td>TRIS 0.5 M, pH 6.8&nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>J832</td><td></td></tr><tr><td>Tris(Hidroksimetil)aminometan</td><td>AMRESCO</td><td>M151</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AMRESCO</td><td>M143</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Malzemeler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon odası</td><td>Ismarlama</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şarjlı slaytlar</td><td>Erie Scientific</td><td>5951PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Deneysel banyo odası</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27NE2</td><td>Alan Stimülasyonlu Dar Banyo Odası, ısıtılmış bir platform üzerine yerleştirilmiştir PH-6</td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>World Precision Instruments</td><td>500338, 500230</td><td></td></tr><tr><td>İnce makas</td><td>World Precision Instruments</td><td>Vannas Makas 501778</td><td></td></tr><tr><td>Cam Pasteur pipetleri</td><td>Birkaç</td><td></td><td>Ateşle cilalanmış uç</td></tr><tr><td>Kapaklı cam şişeler</td><td>Birkaç</td><td></td><td>2-3 mL hacim</td></tr><tr><td>Ameliyat makası</td><td>World Precision Instruments</td><td>501223-G</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>SL 8R</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Dijital kamera</td><td>Zeiss</td><td>Erc 5s ve Axio 305</td><td>Stemi 508 stereoskopuna bağlı Axio 305, diseksiyon sırasında fotoğraf çekmek için kullanıldı; Axio Observer A1 mikroskobuna bağlı Erc 5s veya Axio 208, izole edilen liflerin ve immünofloresan tahlillerinin görüntülerini almak için kullanıldı</td></tr><tr><td>Sayısallaştırıcı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>1550A Digidata</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez odası</td><td>Bio Rad</td><td>Mini-Protean IV</td><td></td></tr><tr><td>Floresan</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer A1'e</td> bağlı ters mikroskop <td>Floresan için uygun bir ışık kaynağına, filtrelere ve objektiflere bağlı</td></tr><tr><td>Fotoçoğaltıcı</td><td>Horiba</td><td>R928 tüpü, Hamamatsu, bir D104 fotometrede, Horiba</td><td>Floresan mikroskobunun yanal portuna bağlı</td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Stimülatörü&nbsp;</td><td>Çim Aletleri&nbsp;</td><td>S6</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu&nbsp;</td><td>Memmert</td><td>WNE-22</td><td></td></tr><tr><td>Xilol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>808691</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez analizleri için ücretsiz yazılım</td><td>Kentucky Üniversitesi</td><td>GelBandFitter v1.7</td><td>http://www.gelbandfitter.org</td></tr><tr><td>Görüntü analizi ve morfometri için ücretsiz yazılım</td><td>Ulusal Sağlık</td><td>Enstitüleri ImageJ v1.54</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr><tr><td>Ca2+ sinyallerinin toplanması ve analizi için lisanslı yazılım</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>pCLAMP v10.05</td><td>https://www.moleculardevices.com</td></tr><tr><td>İstatistiksel analizler ve grafikler için lisanslı yazılım</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 2019 https://www.originlab.com/</td><td></td></tr></tbody></table>

farelerin altı arka bacak kasının enzimatik ayrışmasıyla elde edilen sağlam kısa, orta ve uzun İskelet kası lifleri: fleksör digitorum brevis'in Ötesinde

Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis

Fare kaslarının enzimatik ayrışması ile elde edilen iskelet kası lifleri, fizyolojik deneyler için yararlı bir modeldir. Bununla birlikte, çoğu makale, lif türleri ile ilgili sonuçların kapsamını kısıtlayan, mevcut biyolojik materyal miktarını sınırlayan ve hücresel fizyolojik fenomenler ile diğer kaslarda elde edilen önceki biyokimyasal ve dinamik bilgiler arasında açık bir bağlantıyı engelleyen fleksör digitorum brevis'in (FDB) kısa lifleri ile ilgilidir.
Bu makale, farklı lif tipi profillere ve uzunluklara sahip altı kastan sağlam liflerin nasıl elde edileceğini açıklamaktadır. C57BL/6 yetişkin fareleri kullanarak, kas diseksiyonu ve lif izolasyon protokolünü gösteriyoruz ve liflerin Ca2+ geçici çalışmalar için uygunluğunu ve morfometrik karakterizasyonunu gösteriyoruz. Kasların lif tipi bileşimi de sunulmaktadır. Ayrıştığında, tüm kaslar sağlam, 24 saatten fazla hızlı bir şekilde kasılan canlı lifler haline gelir. FDB kısa (<1 mm), peroneus digiti quarti (PDQA) ve peroneus longus (PL) orta (1-3 mm) verirken, ekstansör digitorum longus (EDL), ekstansör hallusis longus (EHL) ve soleus kasları uzun (3-6 mm) lifleri serbest bıraktı.
Hızlı boya Mag-Fluo-4 ile kaydedildiğinde, PDQA, PL ve EHL liflerinin Ca2+ geçişleri, tip IIX ve IIB liflerine karşılık geldiği bilinen tip II (MT-II) morfolojisini anımsatan hızlı, dar kinetik gösterdi. Bu, bu kasların FDB (~% 80) ve soleus (~% 65) ile karşılaştırıldığında% 90'dan fazla tip II liflere sahip olduğu gerçeğiyle tutarlıdır. FDB'nin ötesine geçerek, ilk kez 1 ila 6 mm arasında değişen uzunluklarda lifler oluşturan birkaç kasın ayrışmasını gösteriyoruz. Bu lifler canlıdır ve hızlı Ca2+ geçişleri verir, bu da MT-II'nin kas kaynaklarından bağımsız olarak IIX ve IIB hızlı liflere genelleştirilebileceğini gösterir. Bu sonuçlar, olgun iskelet kası çalışmaları için modellerin kullanılabilirliğini arttırmaktadır.

Sarkoplazmik Ca2+ seğirme sırasında konsantrasyon Ayrışmış lifler kümesinde fizyolojik deneylerin uygulanabilirliğini göstermek ve uyarma-kasılma eşleşmesi (ECC) ve lif tipleri hakkındaki önceki bulgularımızı genişletmek için, tüm kaslardan liflerde Ca2+ geçişleri elde edildi. İlk olarak, FDB (n = 5) ve EDL (n = 7), morfoloji tip II (MT-II) olarak bilinen Ca2+ kinetik gösterdi. Bunlar, RT'si ~1 ms süren hızlı, dikenli sinyallerdir; bozunma fazı, ilk bileşen (A1</s...

Yetişkin farelerin altı kasından farklı uzunluk ve tiplerde enzimatik olarak ayrışmış lifler elde etmek için bir protokol tarif ediyoruz: bunlardan üçü daha önce tarif edildi (fleksör digitorum brevis, ekstansör digitorum longus, soleus) ve üçü ilk kez başarılı bir şekilde ayrıştı (ekstansör hallusis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Farelerin Altı Arka Bacak Kasının Enzimatik Ayrışmasıyla Elde Edilen Sağlam Kısa, Orta ve Uzun İskelet Kası Lifleri: Fleksör Digitorum Brevis'in Ötesinde

Skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of mouse muscles are a useful model for physiological experiments. However, most papers deal ...

Bu çalışmada, farelerden altı arka bacak kasından farklı uzunluk ve tipteki lifleri izole etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Ayrıca, uyarma-kasılma bağlantı mekanizmasının incelenmesi ile ilgili fizyolojik deneyler için liflerin uygunluğunu test ettik. Yıllar boyunca, uzun kas lifleri elde etmek zordu, bu da alandaki birçok çalışmanın kapsamını sınırladı.Şimdi, altı milimetreye kadar uzunluklara sahip fare fleksörleri, ekstansörleri ve evertorları ile yağsız lifler elde etmenin mümkün olduğunu gösteriyoruz. Örnek olarak, altı farklı kastan lif elde etmek, morfoloji tip II olarak bilinen kalsiyum geçici kinetiğinin, kas kaynaklarının yeri veya işlevine bakılmaksızın tip IIB ve IIX'e genelleştirilebileceğini göstermemizi sağlamıştır. Enzimatik olarak izole edilmiş liflerin modelinin, biyokimya, fizyoloji, biyofizik, hücre biyolojisi ve moleküler biyoloji aralığındaki mekanik soruları yanıtlamamıza izin veren farklı teknoloji türlerine sahip çeşitli deneysel yaklaşımlar için uygun olduğuna inanıyoruz.

intact-short-intermediate-long-skeletal-muscle-fibers-obtained

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İzole İskelet Kası Myo-mekanik Analizi

Biz doğrudan kas kuvveti, kas gücü, kasılma kinetiği ve izole iskelet kaslarında yorulma ölçmek için bir yöntem...

İzole İskelet Kaslar Kasılma, çabuk yorulma ve Alternans Ex Vivo Değerlendirilmesi

Bu video, hasat edilen murin Ekstansör Digitorum Longus (EDL) kasından tek miyoliflerin izolasyonunu göstermektedir. İzole edilen miyofiberler, miyofiber ile ilişkili kas kök hücre aktivitesini incelemek için kültürlenebilir.

Myofiber İzolasyonu: Hasat Edilen Fare Ekstansör Digitorum Longus (EDL) Kasından Tek Myofiber Elde Etme Tekniği

Biz bozulmamış fare iskelet kasları kullanarak küçük açılı X-ışını dikeslenme denemeleri gerçekleştirmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. İnsan hastalıkları için transgenik fare modellerinin geniş kullanılabilirlik ile, bu deneysel platform genetik kas hastalıklarının yapısal temeli aydınlatılmasına için yararlı bir test yatağı...

Kas hastalığının yapısal temelini Incelemek için bir araç olarak bozulmamış Murine Iskelet kasının X-ışını kırması

Burada, homozigot mutant Lamin Δ8-11 fare modeli, Emery-Dreifuss kas distrofisi (EDMD) için çok ciddi bir model erken doğum sonrası gelişim aşamalarında verimli bir şekilde tek kas lifleri elde etmek için bir yöntem öneriyoruz.

Erken Doğum Sonrası Gelişimde Emery-Dreifuss Musküler Distrofi'nin Murine Modelinden Tek Miyofiber İzolasyon ve Kültür

Burada, fare iskelet kasından mitokondri izolasyonu için ayrıntılı bir yöntem ve ardından mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak Oksijen Tüketim Hızı (OCR) ile solunum analizi için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu boru hattı, çoklu çevresel veya genetik müdahalelerin mitokondriyal metabolizma üzerindeki etkilerini incelemek için uygulanabilir.

Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

İskelet kası fonksiyonu, geleneksel olarak zahmetli, düşük verimli yaklaşımlar kullanılarak, izole kas liflerinin kontraktilitesini ölçerek değerlendirilebilir. Burada, hidrojel gömülü kas liflerinin kontraktilitesini ölçmek için optik tabanlı, yüksek verimli bir yöntem tarif ediyoruz. Bu yaklaşımın ilaç taraması ve terapötik gelişim için uygulamaları vardır.

Optik tabanlı bir sistem kullanarak hidrojel gömülü bozulmamış fare kas liflerinin yüksek verimli kasılma ölçümleri

Bu protokol, mekanik dekolman, enzimatik ayrışma, filtrasyon ve diferansiyel ultrasantrifüjleme yoluyla iskelet kası interstisyel hücre dışı veziküllerini (SkM-EV'ler) kemirgen kas dokularından izole etmeyi ve saflaştırmayı amaçlar. Tutarlılık ve güvenilirlik gösterir. İzole edilmiş SkM-EV'ler, tanısal biyobelirteçler veya terapötik araçlar olarak potansiyel uygulamalarla birlikte kas homeostazı ve hastalıkları hakkında bilgi sağlar.

İskelet Kası İnterstisyel Hücre Dışı Veziküllerin Enzimatik İzolasyonu

Bu protokol, yetişkin ve yenidoğan fare iskelet kaslarından birincil miyoblastların doku ayrışması, ardışık filtrasyon, ön kaplama ve tanımlanmış kültür koşulları yoluyla izole edilmesi ve zenginleştirilmesi için standartlaştırılmış bir yöntem sunar; böylece uydu hücresinden türetilen miyoblast kültürlerinin sonraki deneysel uygulamalar için oluşturulması ve bakımı mümkün olur.

In vitro miyogenez çalışmaları için iskelet kası uydu hücrelerinin izolasyonu

Bu protokol, oksidatif soleus'tan sağlam tek kas liflerinin izole edilmesini ve bu liflerden türetilen yüksek saf miyoblast kültürlerinin oluşturulmasını açıklar. Optimize edilmiş prosedür, fare başına yaklaşık 300–500 sağlam miyofiber elde ederek sonraki moleküler ve hücresel analizleri mümkün kılar.

Oksidatif Miyofiber Davranışının Değerlendirilmesi İçin Tek Lifli İzolasyon Testi

Öğrenin, enzimatik ayrışma yöntemiyle fare altı arka bacak kasından farklı uzunluk ve tipte kas lifleri izole etme tekniğini. Bu yöntem, uyarılma-kasılma mekanizmalarını incelemek için fizyolojik deneylerde kullanılabilir.

Farelerin Altı Arka Bacak Kasının Enzimatik Ayrışmasıyla Elde Edilen Sağlam Kısa, Orta ve Uzun İskelet Kası Lifleri: Fleksör Digitorum Brevisin Ötesinde (Video) | JoVE Journal

Farelerin Altı Arka Bacak Kasının Enzimatik Ayrışmasıyla Elde Edilen Sağlam Kısa, Orta ve Uzun İskelet Kası Lifleri: Fleksör Digitorum Brevis'in Ötesinde

Daha fazla video keşfet