Name: Tek Hücreli Dizileme için Fare Karotis Arterlerinden Tek Hücreli Süspansiyonun Hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: Keşfedin: Fare karotis arterlerinden iki aşamalı enzimatik sindirimle yüksek canlılıkta tek hücreli süspansiyon hazırlama. Bu yöntem kardiyovasküler araştırmalarda damar biyolojisini incelemek için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (82070450'den CT'ye ve 82170466'dan NZ'ye) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı'nın (7121102223'den FL'ye) burslarıyla desteklenmiştir.

Aşağıda açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Soochow Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Reaktifler ve malzeme hazırlama
<ol><li>Perfüzyon çözeltisini hazırlamak için kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1x PBS ve 2.5 U / mL heparin sodyum tuzu kullanın. 4 °C'de saklayın ve kullanıldığında buz üzerinde ön soğutun.</li>
	<li>1250 CDU/mL kollajenaz II ve 3000 U/mL DNaz I'i HBSS ile seyrelterek 125 CDU/mL kollajenaz II ve 60 U/mL DNaz I içeren ayrışma reaktifi A'yı hazırlayın. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>1 mL %0.25 EDTA içermeyen tripsini (fenol kırmızısı olmadan) 1 mL 1x PBS'ye seyrelterek %0.12 tripsin nihai konsantrasyonu içeren ayrışma reaktifi B'yi hazırlayın. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>1x PBS'de 10 mL% 1.5 FBS ve% 10 mL% 5 FBS hazırlayın. Karotis arterleri havuzlamak için% 1.5 FBS kullanın ve kullanmadan önce buz üzerinde tutun. Sindirimi nötralize etmek ve oda sıcaklığında (RT) saklamak için% 5 FBS kullanın.</li>
	<li>1 mL şırıngalar, 26-G iğneli 20 mL şırıngalar, altı oyuklu hücre kültürü plakaları, 1.5 mL santrifüj tüpleri, 40 μm steril hücre süzgeçleri ve buz kapları dahil olmak üzere deneysel materyalleri edinin.</li>
</ol>2. Ekipman hazırlığı
<ol><li>Stereoskopik mikroskop, diseksiyon makası, mikro diseksiyon makası ve ince uçlu forseps dahil tüm cerrahi ekipmanı sterilize edin.</li>
	<li>Otomatik hücre sayacını açın ve RT'de tutun.</li>
	<li>Su banyosunu önceden 37 °C'ye getirin.</li>
	<li>Kullanmadan önce mikrosantrifüjü 4 °C'ye önceden soğutun.</li>
</ol>3. Fare karotis arterinin izolasyonu
<ol><li>İntraperitoneal enjeksiyonla (vücut ağırlığının her 10 g'ı için 0,24 mL) %1,25 tribromoetanol kullanarak fareyi uyuşturun ve 3 dakika sonra düzeltme refleksi olup olmadığını kontrol etmek için fareyi çevirin. Ardından, fareyi servikal çıkık ile ötenazi yapın ve sırt üstü yatırın. Farenin cildine %75 alkol püskürtün.</li>
	<li>Cildi açmak ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için sterilize diseksiyon makası kullanın. Diyaframı keserek açın.</li>
	<li>Alt çeneye doğru yukarı doğru kesmeye devam edin ve karotis arteri açığa çıkararak fazla bağ dokularını ve yağı dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Kapalı dolaşımdan kan akışını sağlamak için farenin inferior vena kavasını kesin.</li>
	<li>Sol ventriküle 20 mL önceden soğutulmuş perfüzyon solüsyonunu bir şırınga ile yavaşça ve sürekli olarak enjekte edin. NOT: Perfüzyon başarılı olursa, karaciğer, dalak ve böbrekler gibi kandan zengin organlar gri-beyaza döner.</li>
	<li>Karotis arter çevresindeki tüm yağ ve bağ dokularını stereoskopik mikroskop altında mikro diseksiyon makası ile soyun. NOT: Karotis arterin zarar görmesini önlemek için bu adım yavaş ve dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.</li>
	<li>Karotis arteri fareden izole edin, kanı tekrar yıkamak için 1x PBS ile yıkayın ve buz üzerinde% 1.5 FBS içeren altı oyuklu plakalara aktarın.</li>
</ol>4. Karotis arterin tek hücreli süspansiyona sindirilmesi
<ol><li>Karotis arteri uzunlamasına incelemek için mikro diseksiyon makası kullanın ve buz üzerinde 1 mL% 1.5 FBS içeren başka bir 6 oyuklu hücre kültürü plakasına düz bir şekilde koyun.</li>
	<li>Kalan kanı çıkarmak için intimayı %1,5 FBS ile dikkatlice yıkayın. NOT: Endotel hücrelerine zarar vermemek için yıkama nazik ve yavaş olmalıdır.</li>
	<li>Her karotis arteri %1.5 FBS'de mikrodiseksiyon makası kullanarak yaklaşık 2mm'lik 2 doku parçalarına kesin.</li>
	<li>Bu doku parçalarını 1 mL genişliğinde delikli uçlara sahip 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, dokuları dibe batırmak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı atın ve dokuları 500 μL ayrışma reaktifi A içinde yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Tüpü 1 saat boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Her 10 dakikada bir 1 mL'lik bir pipetle nazikçe pipetleyin.</li>
	<li>Tüpe 500 μL %5 FBS ekleyin ve 1 mL'lik bir pipetle iyice karıştırın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir steril hücre süzgecinden geçirerek yeni bir 1.5 mL'lik santrifüj tüpüne süzün ve 400 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini 200 μL ayrışma reaktifi B içinde yeniden süspanse edin.</li>
	<li>37 °C'lik bir su banyosuna koyun ve 5 dakika daha sindirin. Tek hücreli bir süspansiyona tamamen ayrışmak için sindirim sırasında her 2 dakikada bir hafifçe pipetleyin.</li>
	<li>Sindirim reaksiyonunu sonlandırmak için 200 μL %5 FBS kullanın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı atın ve hücre peletini buz üzerinde 100 μL 1x PBS'de yeniden süspanse edin.</li>
</ol>5. Hücre süspansiyon muayenesi ve tek hücreli RNA dizilimi
<ol><li>10 μL tek hücreli süspansiyona 10 μL AO / PI çözeltisi ekleyin ve 20 μL'lik bir pipetle hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Karışımdan 20 μL'yi hazneye pipetleyin ve 1 dakika bekleyin.</li>
	<li>Slaytı otomatik hücre sayacı cihazına yükleyin.</li>
	<li>AO/PI Canlılık testini seçin, ardından kalite raporunu bekleyin.</li>
	<li>Tek hücreli bir kontrolörde emülsiyonda tek hücreli jel boncuklar oluşturmak için tek hücreli bir 3ʹ reaktif kiti kullanın ve barkodlu cDNA'yı üreticinin protokolüne göre bir termal döngüleyicide çoğaltın. NOT: Burada Chromium Single Cell 3ʹReaktif Kitleri v3 kullanılmıştır.</li>
	<li>Eşleştirilmiş uçlu 150 bp (PE150) okuma stratejisine sahip bir sıralayıcıda sıralama gerçekleştirin. Ham temel çağrı dosyalarını mkfastq ardışık düzenini kullanarak fastq dosyalarına dönüştürmek için bir yazılım uygulaması (Cell Ranger) kullanın. Ardından, özellik barkod matrisleri13 oluşturmak için hizalama, filtreleme, barkod sayımı ve benzersiz moleküler tanımlayıcı (UMI) sayımı gerçekleştirmek için Cell Ranger'ın Sayım İşlem Hattını kullanın.</li>
	<li>R paketi Seurat14 ile veri boyutsallığını azaltma ve görselleştirme gerçekleştirin.<ol><li>İlk olarak, Seurat'ın Read10X() işlevi, Cell Ranger ardışık düzeninin çıktısını okur ve ardından bir Seurat nesnesi oluşturmak için sayı matrisini kullanır. Ardından, <200 veya >4000 gen ekspresyonu veya Seurat'ın subset() fonksiyonu ile %10'dan fazla mitokondriyal gen oranı olan hücreleri filtreleyin.</li>
		<li>Verileri normalleştirmek ve sırasıyla 2000 yüksek değişkenli özelliği tanımlamak için NormalizeData () ve FindVariableFeatures() kullanın .</li>
		<li>Ölçeklendirilmiş veriler üzerinde temel bileşen analizi (PCA) gerçekleştirin ve hücreleri karartma = 30 ve çözünürlük = 0,5 ile kümeleyin. Son olarak, tek hücreli veri kümelerini görselleştirmek için RunUMAP () işlevini ve her bir küme biyobelirtecini bulmak için FindAllMarkers() işlevini kullanın.</li>
	</ol></li>
</ol>

Fare Karotis Arterinin İki Adımlı Hücre Sindirimi

<ol><li>Lee, D. -Y., Chiu, J. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+flow%3A+roles+of+epigenetic+modulation+in+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium.</a> Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56(2019).</li>
<li>Libby, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56(2019).</li>
<li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+applications%3A+A+brief+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview.</a> Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694(2022).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death Discovery. 7 (1), 180(2021).</li>
<li>Rohlenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+maps+endothelial+metabolic+plasticity+in+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).</li>
<li>Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+gained+from+single-cell+analysis+of+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment.</a> Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).</li>
<li>Sun, H., Xu, X., Deng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single+epithelial+cells+suspension+from+mouse+mammary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands.</a> Bio-Protocol. 10 (4), e3530(2020).</li>
<li>Korin, B., Chung, J. -J., Avraham, S., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+of+mouse+glomeruli+for+high-throughput+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis.</a> Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).</li>
<li>Thomson, B., Quaggin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+single+cell+suspension+from+the+murine+iridocorneal+angle%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle.</a> Bio-Protocol. 12 (10), e4426(2022).</li>
<li>Leale, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-stage+digestion+of+whole+murine+knee+joints+for+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage+Open%22%5BJournal%5D)">A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321(2022).</li>
<li>Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta.</a> Bio-Protocol. 6 (11), e1832(2016).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. 29, e1266(2009).</li>
<li>You, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+UMI-based+single-cell+RNA-seq+preprocessing+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows.</a> Genome Biology. 22 (1), 339(2021).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+integration+of+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Depuydt, M. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanatomy+of+the+human+atherosclerotic+plaque+by+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics.</a> Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).</li>
<li>Gao, X. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+of+the+rat+carotid+arteries+uncovers+potential+cellular+targets+of+neointimal+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152(2021).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+the+lumen+of+mouse+carotid+arteries+for+single-cell+multi-omics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. 176, e63128(2021).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Burada, kollajenaz / DNaz ve tripsinin sindirim sürecini entegre eden iki aşamalı bir sindirim yönteminin oluşturulduğu vahşi tip farelerin karotis arterinden yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyonun hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Tek hücreli süspansiyonun kalite kontrolünden sonra, hücrelerin %85'in üzerinde canlılığı ve yüksek hücre konsantrasyonu ile tek hücreli dizileme gereksinimlerini karşıladığını gördük. Ayrıca, tek hücreli veri işlemeden sonra VSMC'ler, fibroblastlar, EC'ler ve Mφ/DC'ler dahil olmak üzere karotis arterdeki çeşitli hücre tipleri başarıyla tespit edildi.
Karotis tek hücreli süspansiyonların hazırlanması için mevcut yöntemler hala azdır. Depuydt ve ark. kollajenaz, DNaz, İnsan Albümin Fraksiyonu V ve Flavopiridol'ü 37 °C'de 30 dakika15 birleştirerek insan karotis plaklarından tek hücreli bir süspansiyon elde etti. Floresanla aktive edilen hücre sıralamasından sonra, endotel hücreleri, düz kas hücreleri, mast hücreleri, B hücreleri, miyeloid hücreler ve T hücreleri 15 dahil olmak üzere14 farklı hücre popülasyonu tanımladılar. Ayrıca, araştırmacılar 37 ° C'de %0.25 tripsin-EDTA ve %0.1 kollajenaz kullanarak sıçan ortak karotis arterlerini sindirdiler ve tek hücreli RNA dizilimini başarıyla gerçekleştirdiler16. Hem normal hem de deneysel karotis arterlerde VSMC'ler, fibroblastlar, EC'ler, geçiş hücreleri ve makrofajlar dahil olmak üzere beş hücre tipi tanımlanmıştır16. Ek olarak, karotis arterin EC ile zenginleştirilmiş tek hücreli preparatlarının elde edilmesi için bir protokol de oluşturulmuştur17. Luminal enzimatik sindirimi tamamladıktan sonra, karotis arter yıkaması, scRNAseq ve scATACseq17 için yeterli tek hücreli peletler elde edecektir. Sindirim süresini esnek bir şekilde kontrol etmek için, fare karotis arterleri için doku ayrışması ve tek hücreli süspansiyon hazırlama adımlarını ayıran iki aşamalı bir sindirim yöntemi geliştirdik. İşlem 1 saat boyunca 125 CDU / mL kollajenaz II ve 60 U / mL DNaz I ile başlar, ardından 5 dakika boyunca EDTA içermeyen tripsin ile devam eder. Önemli bir şekilde, kan damarlarının özelliklerine bağlı olarak diğer kan damarı dokularının sindirimi için yöntemin herhangi bir adımını uygun şekilde değiştirebiliriz.
Açıklanan yöntemin bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, bu yöntemin in vitro birincil hücre kültürü için kullanılıp kullanılamayacağını bilmiyoruz. Karotis arter duvarı daha ince ve daha az hücreye sahip olduğundan, in vitro kültürleme ve genişletme zordur. İkincisi, diğer sindirim yöntemlerinden farklı olarak, bu protokol sindirim sırasında hücreleri ayırmak için nazik pipetleme gerektirir. Çalkalanan bir su banyosu da kaliteli bir tek hücreli süspansiyona neden olabilir. Üçüncüsü, yöntemimiz normal karotis arterlere uygulanabilir olduğundan, karotis plağının sindirimi için uygun olup olmadığı araştırılmaya devam etmektedir.
Sonuç olarak, vahşi tip farelerin karotis arterinden yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için iki aşamalı bir sindirim yöntemi tasarladık. Bu protokol, küçük değişikliklerle diğer damarlar için tek hücreli süspansiyonlar hazırlamak için kullanılabilir, bu da onu kardiyovasküler araştırmalarda çok yardımcı kılar.

Ateroskleroz, yüksek tansiyon, hiperlipidemi ve hemodinamik gibi risk faktörleriyle ilişkili kronik inflamatuar bir hastalıktır1. Karotis arter bifurkasyonları hemodinamik değişikliklere eğilimlidir ve karotis plak oluşumuna yol açar. Karotis aterosklerozunun klinik prezentasyonu inme ve geçici serebral iskemi gibi akut veya tekrarlayan geçici serebral iskemi ve vasküler demans gibi kronik olabilir2. Mekanik olarak karotis plak, patolojik koşullar altında farklı damar duvarı hücreleri ve çeşitli kan hücreleri arasındaki etkileşimin sonucudur. Bu nedenle, fizyolojik ve patolojik koşullar altında karotis damarlarının tek hücreli atlasının ortaya çıkarılması, karotis plak gelişiminin önlenmesi ve tedavisi için özellikle önemlidir.
Tek hücreli RNA dizilimi, ultra yüksek çözünürlüğü ve aynı hücre tipi organizmalardan hücre heterojenliğinin tespiti nedeniyle biyolojik araştırmaların en güçlü teknolojilerinden biridir 3,4. Araştırmacılar, kardiyovasküler hastalık5 ve kanser6 gibi birçok alanda araştırma yapmak için tek hücreli RNA dizilimini kullandılar. Bununla birlikte, dokuları hızlı ve doğru bir şekilde tek hücrelere ayırmak hala ana zorluklardan biridir. Enzimatik ayrışma, baskın olarak kollajenaz, papain, tripsin, DNaz ve hyaluronidaz içeren yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Spesifik olarak, kollajenazlar, tek hücreli sindirim için ana enzim türleridir ve esas olarak bağ dokularındaki kollajen bileşenlerini hidrolize eder. Meme bezi7, glomerulus8, iridokorneal açı9, diz eklemi10, aort11 ve akciğer12 gibi farklı dokuların ayrışması için farklı kollajenaz tipleri uygulanabilir. Farklı dokuların benzersiz fizyolojik özellikleri nedeniyle, aynı yöntemi kullanarak ayrışma, düşük hücre canlılığı, düşük hücre sayısı ve büyük hücre kalıntıları gibi tek hücrelerin elde edilmesinde birçok soruna neden olabilir. Bu nedenle, farklı dokular için sindirim yöntemlerinin icadı, yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonların hazırlanması için gereklidir.
Bu protokol, vahşi tip farelerin karotis arterinin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için iki aşamalı bir hücre sindirim yöntemi geliştirmeyi amaçlamaktadır. Karotis arterin özelliklerine göre, fare karotis arterinin yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyonunu elde etmek için kollajenaz / DNazı tripsin ile birleştirdik çünkü kollajenaz, tripsin tarafından daha fazla sindirilen karotis dokularının kollajenini hidrolize edebilir. Hücre canlılığını ve konsantrasyonunu tespit etmek için akridin turuncu/propidyum iyodür (AO/PI) çift floresan sayımı kullanıldı ve tek hücreli süspansiyonun, hücrelerin canlılığı ile tek hücreli dizileme gereksinimlerini karşıladığı, hücrelerin %85'in üzerinde canlılığı ve yüksek hücre konsantrasyonu olduğu bulundu. Tek hücreli veri işlemeden sonra, sindirimden sonra normal fare karotis arterlerinde vasküler düz kas hücreleri (VSMC'ler), fibroblastlar, endotel hücreleri (EC'ler) ve makrofajlar ve dendritik hücreler (Mφ / DC'ler) dahil olmak üzere dört hücre tipi tanımlandı. Bu protokolün avantajları şunlardır: 1) karotis arterdeki çoklu hücre tipleri tanımlanabilir, 2) hücre canlılığı iyi korunur ve 3) özel ekipman olmadan kolayca tekrarlanabilir. Bu protokol, fare karotis arterlerinin tek hücreli multiomiklerini incelemek isteyen araştırmacılar için uygundur. Bu protokol, uygun modifikasyonlarla diğer kan damarlarının ayrışmasında da yardımcı olabilir.

<table><tbody><tr><td>% 0.25 EDTA içermeyen tripsin</td><td>Beyotime</td><td>C0205</td><td>1 mL %0.25 EDTA içermeyen tripsini 1 mL 1x PBS'ye seyreltin.</td></tr><tr><td>% 0.9 NaCl salin çözeltisi</td><td>Beyotime</td><td>ST341</td><td>Heparin sodyum çözeltisini 10 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin</td></tr><tr><td>1 mL şırınga&</td><td>nbsp; SKJYLEAN</td><td>sk-r009</td><td>Kardiyak perfüzyon yapmak için</td></tr><tr><td>1.5 mL santrifüj tüpleri</td><td>KIRGEN</td><td>KG2211W</td><td>Doku parçasını ve hücre süspansiyonunu santrifüjlemek için</td></tr><tr><td>20 mL şırınga</td><td>SKJYLEAN</td><td>sk-r013</td><td>Kardiyak perfüzyon</td></tr><tr><td>yapmak için 40 & m hücre süzgeci</td><td>JETBIOFIL</td><td>css010040</td><td>Sindirilmemiş doku parçalarını filtrelemek için</td></tr><tr><td>AO/PI kiti</td><td>Hengrui Biyolojik</td><td>RE010212</td><td>Hücrenin canlı mı yoksa ölü mü olduğunu belirlemek için</td></tr><tr><td>Otomatik hücre sayacı</td><td>Countstar</td><td>Mira FL</td><td>Sindirilmiş karotis vasküler hücrelerin hücre morfolojisini ve hücre canlılığını analiz etmek için</td></tr><tr><td>Cell Ranger yazılımı</td><td>10 kez; Genomik</td><td>3.0.2</td><td>Krom tek hücreli RNA-seq çıktısını işlemek ve kümeleme ve gen ekspresyon analizi yapmak için</td></tr><tr><td>Krom Tek Hücreli 3'Reaktif Kitleri v3</td><td>10& kez; Genomik</td><td>1000075</td><td>Tek hücreli süspansiyonun tek hücreli RNA-seq kitaplıklarını hazırlamak için</td></tr><tr><td>Kollajenaz II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td>HBSS ile 125 CDU/mL nihai konsantrasyona seyreltin</td></tr><tr><td>Deoksiribonükleaz I</td><td>Worthington</td><td>LS002140</td><td>HBSS ile 60 U/mL nihai konsantrasyona seyreltin</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30088.03</td><td>Sindirim reaksiyonunun sonlandırılması</td></tr><tr><td>Hank'in dengeli tuz çözeltisi&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td>Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Heparin sodyum tuzu</td><td>Solarbio Life Science</td><td>H8060</td><td>% 0.9 NaCl ile 10 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>75002560</td><td>Dokuları ve hücre peletlerini küçültmek için uygulanır</td></tr><tr><td>NovaSeq 6000&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>N/A</td><td>Sequencer</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Solarbio Life Science</td><td>P1000</td><td>Kardiyak perfüzyon ve hücrelerin yeniden süspansiyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Seurat paketi- R</td><td>Satija Lab</td><td>3.1.2</td><td>scRNA dizileme verilerinin boyutsallığının azaltılması, görselleştirilmesi ve analizi için</td></tr><tr><td>Altı kuyulu hücre kültürü plakaları</td><td>NEST</td><td>703002</td><td>Vasküler dokuyu yerleştirin</td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Jinghong</td><td>DK-S22</td><td>Sindirim sıcaklığını 37 ° C'de tutun; Ç</td></tr></tbody></table>

tek hücreli dizileme için fare karotis arterlerinden tek hücreli süspansiyonun hazırlanması

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

Karotis arterler, boyundaki beyne kan ve oksijen sağlayan ana kan damarlarıdır, ancak karotis arterleri plak tarafından tıkandığında karotis darlığı meydana gelir. Karotis arterin hücresel bileşiminin tek hücre düzeyinde ortaya çıkarılması, karotis aterosklerozunun tedavisi için esastır. Bununla birlikte, karotis arterlerden tek hücreli süspansiyonların hazırlanması için kullanıma hazır bir protokol yoktur. Normal karotis arterlerin tek hücre düzeyinde hücrelere daha az zarar vererek ayrışması için uygun bir protokol elde etmek için, kollajenaz/DNaz ve tripsinin sindirim sürecini entegre ederek iki aşamalı bir sindirim yöntemi tasarladık. Hücre canlılığını ve konsantrasyonunu tespit etmek için akridin turuncu/propidyum iyodür (AO/PI) çift floresan sayımı kullanıldı ve tek hücreli süspansiyonun, hücrelerin canlılığı ile tek hücreli dizileme gereksinimlerini karşıladığı, hücrelerin %85'in üzerinde canlılığı ve yüksek hücre konsantrasyonu olduğu bulundu. Tek hücreli veri işlemeden sonra, her karotis arter hücresinde hücre başına ortalama ~ 2500 transkript tespit edildi. Özellikle, vasküler düz kas hücreleri (VSMC'ler), fibroblastlar, endotel hücreleri (EC'ler) ve makrofajlar ve dendritik hücreler (Mφ / DC'ler) dahil olmak üzere normal karotis arterin çeşitli hücre tipleri aynı anda tespit edilebilirdi. Bu protokol, uygun modifikasyonlarla diğer dokulardan kan damarlarının tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için uygulanabilir.

Bu protokol, fare karotis arterlerinin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için iki aşamalı bir hücre sindirim yöntemini açıklar (Şekil 1). Bu iki aşamalı hücre sindirim yöntemi, tek hücreli dizileme için yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlar elde etmek üzere fare karotis vasküler duvarını etkili bir şekilde ayırmak için kollajenaz/DNazı tripsin ile birleştirir. Ayrışmadan sonra, hücre konsantrasyonu ve hücre canlılığı otomatik bir hücre sayacı tarafından hesaplandı. Parlak alan, sindirimden sonra karotis vasküler hücrelerin morfolojisini gösterdi ve AOPI çift floresan boyama aynı anda hücre canlılığını tespit etti (Şekil 2A, B). Özellikle, tek başına ayrışma reaktifi A'nın kullanılmasıyla karşılaştırıldığında, karotis arter dokusu, ayrışma reaktifi B ile birleştirildiğinde daha kapsamlı bir şekilde ayrışabilir. Ayrıca, dokuz arterin canlı bir hücre sayısını bulduk ve ortalama hücre çapı, iki aşamalı hücre sindiriminden sonra tek hücre diziliminin gereksinimlerini karşıladı (Şekil 2C). Bu arada, dokuz sol karotidden toplam 176.000 tek hücre toplandı ve çoğu vasküler damar, yüksek canlılığa sahip tek hücrelere ayrıldı (Şekil 2C).
Hizalama, filtreleme, barkod sayımı ve UMI sayımından sonra, tek hücreli dizilemenin ham verileri R paketi Seurat ile analiz edildi. Hücre başına genlerin dağılımı, hücre başına UMI ve hücre başına mitokondriyal okumalar keman grafiklerinde gösterilmiştir (Şekil 3A-C). Özellikle, her karotis arter hücresinde hücre başına ~ 2500 transkript medyanı tespit edildi. Düşük kaliteli hücreler çıkarıldıktan sonra, 14.580 hücre tespit edildi ve aşağı akış tek hücreli RNA-seq analizi için kullanıldı. Benzer profillere sahip 2000 değişken gen kullanılarak, denetimsiz Seurat tabanlı kümeleme, sindirimden sonra normal fare karotis arterlerinde VSMC'ler (% 74.0), fibroblastlar (% 16.5), EC'ler (% 6.5) ve Mφ / DC'ler (% 3.0) dahil olmak üzere dört ana hücre tipi gösterdi (Şekil 3D-F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65863/65863fig01.jpg"> Şekil 1: Fare karotis arter sindiriminin şematik diyagramı. Fare karotis arteri izole edildikten ve kesildikten sonra, fare karotis arterini ayrıştırmak için 500 μL ayrışma reaktifi A eklendi. Hücre süspansiyonu filtrelendiğinde ve santrifüjlendiğinde, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için daha fazla ayrışma için 200 μL ayrışma reaktifi B eklendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65863/65863fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65863/65863fig02.jpg"> Şekil 2: Fare karotis arterinden tek hücreli süspansiyon preparatı . (A) Ayrışma reaktifi A ile 1 saatlik sindirimden sonra karotis arter hücrelerinin hücre morfolojisi ve hücre canlılığı, parlak alan görünümünde ve AOPI boyamasında gösterilir. Yeşil floresan ile boyanmış çekirdekli hücreler canlı hücreler iken, kırmızı floresan ile boyanmış olanlar ölü hücrelerdir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) İki aşamalı hücre sindiriminden sonra karotis arter hücrelerinin hücre morfolojisi ve hücre canlılığı, parlak alan görünümünde ve AOPI boyamasında gösterilir. Yeşil floresan ile boyanmış çekirdekli hücreler canlı hücreler iken, kırmızı floresan ile boyanmış olanlar ölü hücrelerdir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (C) Hücre canlılığı, toplam hücre sayısı, canlı hücre sayısı ve ortalama hücre çapı, iki aşamalı hücre sindiriminden sonra ölçüldü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65863/65863fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65863/65863fig03.jpg"> Şekil 3: scRNA-seq ve karotis arterin hücre manzarası için standart kalite kontrol (QC) ölçümleri. (A) scRNA-seq verileri için hücre başına gen dağılımını (nFeature RNA), (B) hücre başına UMI (nCount_RNA) ve (C) hücre başına mitokondriyal okumaları (yüzde mt) gösteren keman grafikleri. (D) Karotis arterin tanımlanmış dört hücre tipini gösteren tek tip manifold yaklaşımı ve projeksiyonu (UMAP) grafiği. (E) D panelindeki her bir hücre kümesi türünü tanımlayan işaretçileri gösteren nokta grafiği. Her dairenin boyutu, her bir transkripti ifade eden grup içindeki hücre oranını gösterir. Mavi noktalar yüksek oranda eksprese edilen genleri, gri noktalar ise düşük ekspresyonlu genleri gösterir. (F) Yabani tip farelerin (WT) scRNA dizisi tarafından tespit edilen dört hücre tipinin nispi bolluğunu gösteren yığılmış çubuk grafiği. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65863/65863fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Burada, fare karotis arterlerinin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için iki aşamalı bir hücre sindirim protokolünü açıklıyoruz.

Tek Hücreli Dizileme için Fare Karotis Arterlerinden Tek Hücreli Süspansiyonun Hazırlanması

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are ...

Düşük çözünürlük ve daha büyük hücre bilgisi, vasküler doku ayrışmasının ana zorluklarıdır. İki adımlı veya sindirim yöntemimiz karotis doku ayrışması için çok uygundur ve küçük değişikliklerle diğer damarlar için tek hücreli şüpheler hazırlamak için kullanılabilir, bu da onu kardiyovasküler araştırmalarda çok yardımcı kılar. Bu protokol karotis arterde birden fazla hücre tipi elde etmek için uygundur ve özel ekipman olmadan kolayca tekrarlanabilir.Gelecekte, kardiyovasküler hastalıkların hedefe yönelik tedavisi için tek hücre iyon dizilimi ile keşfedilen hücre alt sınıflarını kullanmayı hedefliyoruz.

preparation-single-cell-suspension-from-mouse-carotid-arteries-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Belirli doku tiplerinin hücreleri Dissociating doku aggitation için belirli parametreler uygulanabilir kültürlenebilen hücrelerinin yüksek ses elde etmek için gereklidir. Miltenyi gentleMACS Dissociator basit, pratik bir protokol ile bu görevi en iyi hale getirir. Bu yayında, nerual doku bu cihazların kullanımı açıklanmıştır.

Fare Sinir Doku Hücre Tek Cezalar Üretimi

Video, bir murin beyin dokusundan tek hücreli bir bağışıklık hücresi süspansiyonunun hazırlanmasını göstermektedir. Hücreleri beyin dokusundan serbest bırakmak için enzimatik sindirimi ve ardından tek hücreli süspansiyonu elde etmek için bağışıklık hücrelerini yoğunluklarına göre izole etmek için yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeyi içerir.

Murin Beyin Dokusundan Tek Hücreli Bağışıklık Hücrelerinin Süspansiyonunun Hazırlanması

Burada, hızlı bir şekilde yüksek kaliteli çekirdekleri aşağı akım kitlesel paralel RNA sıralama için taze veya dondurulmuş dokusundan izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut. İkisi de çekirdek yalıtımı için kullanılan deterjan-mekanik ve mekanik hipotonik doku bozulma ve hücre lizis seçenekleri, içerir.

Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için

Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

Burada fare embriyonik dokularında gen ekspresyonunu profillemek için çok katlı tek hücreli mRNA dizileme yöntemi ni sunduk. Damlacık tabanlı tek hücreli mRNA dizileme (scRNA-Seq) yöntem çoklama stratejileri ile birlikte aynı anda birden fazla örnekten tek hücre profili olabilir, hangi önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve deneysel toplu etkileri en aza indirir.

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Mevcut protokol, sürekli büyüyen bir fare kesici dişinden, fare azı dişinden ve insan dişlerinden tek hücreli RNA-seq analizine uygun tek hücreleri izole etmek için hızlı, verimli ve nazik bir yöntem sunar.

Fare ve İnsan Dişlerinden Tek Hücrelerin Hızlı İzolasyonu

Tek hücreli omik deneyler yapmak için stabil veya rahatsız edici akış koşullarına maruz kalan fare karotis arterlerinin lümeninden endotel hücrelerini ve çekirdeklerini izole etmek için bir yöntem sunuyoruz.

Tek Hücreli Multi-Omik Deneyler için Fare Karotis Arterlerinin Lümeninden Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Burada, miyokard enfarktüsü sonrası (MI) fare kalbinden yüksek canlılığa sahip yeterli miktarda tek kardiyomiyosit olmayan izole etmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu, sonraki tek hücreli dizileme, akış sitometri analizi ve birincil hücre kültürü için kullanılabilir.

Miyokard Enfarktüsü Sonrası Yetişkin Fare Kalbinden Tek Hücreli RNA Dizilimi için Kardiyomiyosit Olmayan Hücre Süspansiyonunun Hazırlanması

Burada, hücre çekirdeği hazırlığını tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Kardiyak dokunun mikrodiseksiyonu ve enzimatik ayrışmasından sonra, progenitör hücreler donduruldu, ardından tek çekirdekli RNA dizilimi için kullanılan saf canlı hücrelerin izolasyonu ve yüksek verimli dizileme analizleri ile transpozaz erişilebilir kromatin için tek çekirdekli tahlil yapıldı.

Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

ScRNA-seq gereksinimlerini karşılayan fare beyni kortikal perisitlerini elde etmek için, CD13⁺/CD31⁻ seçimine dayalı kritik optimize edilmiş bir FACS protokolü sunuyoruz. Ana iyileştirmelerimiz, hücre canlılığını ve RNA bütünlüğünü önemli ölçüde artırır ve güvenilir transkriptomik profilleme imkanı sağlar.

Fare Kortikal Dokusundan Perisitlerin Tek Hücreli Dizileme için FACS Kullanılarak İzolasyonu

Burada, kollajenaz A ve tripsin ile ardışık sindirim yoluyla tüm fare kornealarından yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, yüksek RNA bütünlüğüne sahip geçerli tek hücreler sağlar ve bu da onları tek hücreli RNA dizileme ve akış sitometriy gibi sonraki uygulamalarla uyumlu kılar.

Fare Kornealarından Tek Hücreli Süspansiyonun Hasat İçin Bir Protokol

Keşfedin: Fare karotis arterlerinden iki aşamalı enzimatik sindirimle yüksek canlılıkta tek hücreli süspansiyon hazırlama. Bu yöntem kardiyovasküler araştırmalarda damar biyolojisini incelemek için uygundur.

Tek Hücreli Dizileme için Fare Karotis Arterlerinden Tek Hücreli Süspansiyonun Hazırlanması

Daha fazla video keşfet